高效液相色譜分析ppt

高效液相色譜分析ppt1第一頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日基本概念與特點(diǎn)

概念：高效液相色譜法(HPLC)是在20世紀(jì)60年代末，以經(jīng)典液相色譜為基礎(chǔ)，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高效固定相、高壓輸液系統(tǒng)和高靈敏度的在線(xiàn)檢測(cè)器，從而發(fā)展起來(lái)的一種新型分離分析技術(shù)。隨著科學(xué)和技術(shù)的不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為重要、廣泛的分離分析手段.特點(diǎn)：分離效率高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣、操作自動(dòng)化。2第二頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日液相色譜流程與原理基本原理：混合組分的樣品在色譜柱中，各組分由于在流動(dòng)相和固定相之間溶解、吸附、滲透或離子交換等作用力的不同，隨流動(dòng)相在色譜柱中運(yùn)行時(shí)，在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次分配過(guò)程，使得原來(lái)分配系數(shù)具有微小區(qū)別的各組分，產(chǎn)生了保留能力明顯差異的效果，進(jìn)而各組分在柱中的移動(dòng)速度不同，經(jīng)過(guò)一定長(zhǎng)度的色譜柱，彼此分離開(kāi)來(lái)，最后按一定順序流出。3第三頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日色譜圖及相關(guān)名詞（一）色譜流出曲線(xiàn)—色譜圖

色譜圖是色譜柱流出物通過(guò)檢測(cè)器所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)對(duì)時(shí)間或液體流出體積的曲線(xiàn)。

色譜流出曲線(xiàn)是色譜基本參數(shù)的源流，而色譜基本參數(shù)又是用來(lái)觀察色譜行為和研究色譜理論的重要指標(biāo)。另外，還可以直接利用色譜圖峰位置點(diǎn)（特征保留值）進(jìn)行定性，根據(jù)曲線(xiàn)上測(cè)得的峰高或峰面積進(jìn)行定量。4第四頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日（二）柱效能

色譜柱在色譜分離中由動(dòng)力學(xué)因素所決定的柱效能，通常用塔板高度或塔板數(shù)表示。塔板數(shù)：

塔板高度：渦流擴(kuò)散相分子擴(kuò)散相流動(dòng)相線(xiàn)速度傳質(zhì)阻力相5第五頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日（三）分離度R分離度的表達(dá)式：tR(2),tR(1):組分2和組分1的保留時(shí)間Wb(2),Wb(1):組分2和組分1的峰底寬度6第六頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日R=1.5完全分離7第七頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日

高效液相色譜系統(tǒng)（一）高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)流程高壓泵色譜柱廢液檢測(cè)器進(jìn)樣器儲(chǔ)液瓶高壓輸液泵、高效分離柱、高靈敏度檢測(cè)器8第八頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日（二）高壓輸液系統(tǒng)（高壓泵）

高壓輸液泵是核心部件，要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)范圍寬，便于迅速更換溶劑及耐腐蝕等。

高壓泵主要有恒流泵（往復(fù)泵）和恒壓泵（氣動(dòng)泵）兩種。恒流泵特點(diǎn)輸出流量保持恒定而與色譜柱引起阻力變化無(wú)關(guān)。分為機(jī)械注射泵和機(jī)械往復(fù)泵(常用)兩種。恒壓泵特點(diǎn)能保持輸出壓力恒定，但其流量則隨色譜系統(tǒng)阻力而變化，故保留時(shí)間的重視性差。

9第九頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日電動(dòng)機(jī)偏心輪柱塞柱球形單向閥溶劑圖10-7柱塞往復(fù)泵示意圖10第十頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日（三）色譜柱

色譜柱是高效液相色譜分離過(guò)程的核心。一支穩(wěn)定、高效的色譜柱對(duì)建立適用性強(qiáng)、重現(xiàn)性好的分析方法是必不可少的。

1.擔(dān)體

高效液相色譜的柱填料有離子交換樹(shù)脂、凝膠，較多的使用硅膠微粒作為擔(dān)體。以下為幾種常用的微粒類(lèi)型：

(1)全多孔型擔(dān)體：屬于顆粒均勻的多孔球體，很好的兼顧了效能、樣品荷載量、耐久性等理想的性質(zhì)，所以最為常用。(2)表層多孔型擔(dān)體（薄殼型微珠擔(dān)體）：

它是直徑為30～40μm的實(shí)心核(玻璃微珠)，優(yōu)點(diǎn)是：孔穴淺（固定相僅為表面的一薄層），傳質(zhì)速度快，易于填充均勻，柱效高。這種擔(dān)體目前應(yīng)用較為普遍。11第十一頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日2.色譜柱

柱體為直型不銹鋼管，標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)經(jīng)為4.6或3.9mm，柱長(zhǎng)15～30cm，填料顆粒粒度5－10μm。發(fā)展趨勢(shì)是減小填料粒度(3－5μm)和柱經(jīng)以提高柱效。

為保護(hù)色譜柱，通常在柱前加一支填料與色譜柱相同的保護(hù)柱。

12第十二頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日3.固定相選擇固定相的一般標(biāo)準(zhǔn)還是以“相似相容”原理為基礎(chǔ)。如果溶質(zhì)溶于烴類(lèi)溶劑，表明是低極性化合物，這樣就可以選擇非極性或亞極性固定相。若樣品溶于極性溫和溶劑中，如醇類(lèi)，則可選擇極性固定相，也可以選擇非極性固定相。13第十三頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日4.流動(dòng)相

液相色譜的流動(dòng)相又稱(chēng)為淋洗液，洗脫劑。流動(dòng)相組成、極性改變，可顯著改變組分分離狀況，改變流動(dòng)相的組成和極性（組成比例）是提高分離度的有效手段。常用溶劑：環(huán)己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇、乙腈、水等。14第十四頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日正相液相色譜（正相柱）固定相極性>流動(dòng)相極性反相液相色譜（反相柱）固定相極性<流動(dòng)相極性組分極性越大，保留時(shí)間越長(zhǎng)；使用極性化合物的分離。組分極性越小，保留時(shí)間越長(zhǎng)；適用非極性化合物的分離。15第十五頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日

選擇流動(dòng)相時(shí)應(yīng)注意的問(wèn)題1、盡量使用高純度試劑作流動(dòng)相，防止微量雜質(zhì)長(zhǎng)期累積損壞色譜柱和使檢測(cè)器噪聲增加。2、避免流動(dòng)相與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。16第十六頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日3、試樣在流動(dòng)相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。4、流動(dòng)相同時(shí)還應(yīng)滿(mǎn)足檢測(cè)器的要求。當(dāng)使用紫外檢測(cè)器時(shí)，流動(dòng)相不應(yīng)有紫外吸收。17第十七頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日（四）檢測(cè)器（一）、紫外檢測(cè)器—應(yīng)用最廣泛的檢測(cè)器基本原理：試樣組分對(duì)特定波長(zhǎng)的紫外光具有選擇性的吸收，吸光度與試樣組分濃度之間的定量關(guān)系符合郎伯-比耳定律。優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，線(xiàn)形范圍寬；死體積??；波長(zhǎng)可選；對(duì)流速和溫度變化不敏感；可用于梯度洗脫。缺點(diǎn)：無(wú)紫外-可見(jiàn)吸收組分不響應(yīng)；流動(dòng)相選擇受一定限制。18第十八頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日(a)可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器(b)二極管陣列檢測(cè)器19第十九頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日（二）、示差折光檢測(cè)器—通用型檢測(cè)器每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)?；驹恚哼B續(xù)檢測(cè)參比池和樣品池中流動(dòng)相之間的折光系數(shù)差值，該值與試樣池流動(dòng)相中的組分濃度成正比。

生命科學(xué)中各類(lèi)糖類(lèi)化合物，沒(méi)有紫外吸收，一般要用示差折光檢測(cè)器。

20第二十頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日

缺點(diǎn)：靈敏度低；對(duì)溫度敏感；不能用于梯度洗脫。21第二十一頁(yè)，共二十三頁(yè)，2022年，8月28日（三）、熒光檢測(cè)器—專(zhuān)用型檢測(cè)器基本原理：在一定的條