酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座

主要內(nèi)容：

一、概述二、酶類藥品分類三、酶類藥品制備幾個主要酶類藥品制備工藝知識目標(biāo)：

掌握酶類藥品分類、應(yīng)用和生產(chǎn)方法掌握SOD生產(chǎn)工藝了解酶類藥品發(fā)展趨勢酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第1頁一、概述

1、酶(enzyme)特點(diǎn)

酶含有高度專一性和催化效率.酶催化反應(yīng)反應(yīng)條件溫和.酶催化活性在生物體內(nèi)受到各種原因調(diào)整.酶對底物結(jié)構(gòu)含有嚴(yán)格選擇性.

2、藥用酶—是用于預(yù)防、治療、診療疾病一類酶制劑。

酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第2頁3、酶類藥品發(fā)展歷程

4千多年前夏禹時代就盛行釀酒；周朝已開始制醋、醬、豆豉（在霉菌蛋白酶作用下產(chǎn)生風(fēng)味食品）和飴糖（主要含麥芽糖）.1833年，Payen從麥芽抽提物中沉淀出一個對熱不穩(wěn)定物質(zhì)，它可促進(jìn)淀粉水解成可溶性糖，人們開始意識到生物細(xì)胞中可能存在著一個類似催化劑物質(zhì).1893年francs用木瓜蛋白酶治療白喉和結(jié)核性潰瘍病，療效很好.1896年，W·Kuhne首先把這類物質(zhì)稱為“enzyme”，漢字譯為“酶”.1897年Buchner成功地用不含細(xì)胞酵母液實(shí)現(xiàn)發(fā)酵，說明含有發(fā)酵作用物質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)，并不依賴活細(xì)胞.1926年Sumner首次提取出脲酶，并進(jìn)行結(jié)晶。20世紀(jì)60年代中期以前，普通動植物起源酶已陸續(xù)投入生產(chǎn)，隨即，又向著生產(chǎn)各種微生物起源酶和輔酶方向發(fā)展?，F(xiàn)已經(jīng)有二千余種酶被判定出來，已經(jīng)應(yīng)用有1211各種其中有二百余種得到結(jié)晶。酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第3頁

二、酶類藥品分類

1.消化酶類胰酶、胰脂酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶等，用于治療消化不良、食欲不振、急慢性腸胃炎、消化功效受阻等。2.消炎（抗炎）胰蛋白酶、糜蛋白酶等用于消炎、消腫、清瘡、排膿和促進(jìn)傷口愈合；膠原蛋白酶用于治療褥瘡和潰瘍；溶菌酶可作為一個含有殺菌作用天然抗感染物質(zhì)。有抗菌、抗病毒、止血、消腫止痛及加緊組織恢復(fù)功效等作用。臨床用于慢性鼻炎、急慢性咽喉炎、水痘、帶狀皰疹和扁平疣等木瓜凝乳蛋白酶用于治療椎間盤突出癥；胰蛋白酶還用于治療毒蛇咬傷。依照其功效和臨床應(yīng)用分類酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第4頁3．心血管疾病治療彈性蛋白酶能降低血脂，用于防治動脈粥樣硬化；激肽釋放酶有擴(kuò)張血管、降低血壓作用；一些酶制劑對溶解血栓有獨(dú)特效果。如尿激酶、鏈激酶、蚓激酶、纖溶酶及蛇毒溶栓酶。凝血酶可用于止血。4.抗腫瘤酶類生化產(chǎn)品用于治療一些腫瘤，如門冬酰胺酶、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶等。L-門冬酰胺酶是一個抗白血病藥品，它是利用門冬酰胺酶選擇性地爭奪一些類型瘤組織營養(yǎng)成份，干擾或破壞腫瘤組織代謝，而正常細(xì)胞能本身合成門冬酰胺故不受影響。谷氨酰胺酶能治療各種白血病、腹水瘤、實(shí)體瘤等。神經(jīng)氨酸苷酶是一個良好腫瘤免疫治療劑。尿激酶可用于加強(qiáng)抗癌藥品如絲裂霉素(mitomycin)藥效，米曲溶栓酶也能治療白血病和腫瘤等酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第5頁5、其它酶類生化產(chǎn)品細(xì)胞色素c是參加生物氧化一個非常有效電子傳遞體，是組織缺氧治療搶救和輔助用藥；超氧化物歧化酶(SOD)用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、放射病，在抗衰老、抗輻射、消炎等方面也有顯著療效。PEG-腺苷脫氫酶用于治療嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺點(diǎn)癥；DNA酶和RNA酶可降低痰液黏度，用于治療慢性氣管炎；透明質(zhì)酸酶用于藥品擴(kuò)散劑；青霉素酶可治療青霉素過敏。酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第6頁6．輔酶類生化產(chǎn)品輔酶或輔基在酶促反應(yīng)中起著遞氫、遞電子或基團(tuán)轉(zhuǎn)移作用，對酶催化作用化學(xué)反應(yīng)方式起著關(guān)鍵性決定作用。各種酶輔酶或輔基成份含有醫(yī)療價值。如煙酰胺腺、腺嘌呤二核苷酸(NAD)、煙酰胺腺嘌呤核苷酸磷酸(NADP)、黃素單核苷酸(FMN)、泛醌、輔酶A等已廣泛用于肝病和冠心病治療。輔酶A常與ATP、細(xì)胞色素c、胰島素等組成復(fù)方制劑以增強(qiáng)療效。酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第7頁三、酶類藥品制備1、原料選擇

（1）不一樣酶用料選擇(含量低）

（2）注意不一樣生長發(fā)育情況及營養(yǎng)情況（3）原料起源豐富（4）從簡化提純步驟著手（鴿肝中提取乙?；?，需將動物饑餓，降低肝糖原）（5）如用動物組織作原料，應(yīng)在此動物宰殺后馬上取材。

伴隨酶應(yīng)用日益廣泛和需求量增加，工業(yè)生產(chǎn)重點(diǎn)已逐步轉(zhuǎn)向微生物。酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第8頁2、微生物酶制劑高產(chǎn)菌株選育自然界分離篩選.物理、化學(xué)方法處理、誘變.基因重組與細(xì)胞融合技術(shù).3、微生物酶制劑生產(chǎn)發(fā)酵技術(shù)菌株產(chǎn)酶最適培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、溫度、PH、通氣量）一系列工藝條件（滅菌方式、發(fā)酵罐型號）酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第9頁（1）材料預(yù)處理動物材料預(yù)處理：機(jī)械法凍融丙酮粉微生物材料預(yù)處理:干燥法：干燥后菌體產(chǎn)生自溶?？諝飧稍锓ǎ哼m合于酵母，熱穩(wěn)定性好酶。真空干燥法：適合細(xì)菌冷凍干燥：適合于較敏感酶。機(jī)械法酶法處理4、酶類藥品提取與純化酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第10頁（2）酶提取水溶解法：慣用稀鹽溶液或緩沖液提取，普通在低溫下操作，酸性蛋白酶用堿性溶液提取，堿性蛋白酶用酸性溶液提取，鹽溶度以等滲為好，0.15mol/LNaCl離子強(qiáng)度是最適合酶提取。有機(jī)溶劑法一些結(jié)合酶如微粒體和線粒體膜酶，因?yàn)楹椭惱慰拷Y(jié)合，用水溶液極難提取，為此必須除去結(jié)合脂類，且不能使酶變性，最慣用有機(jī)溶劑是丁醇。表面活性劑法

表面活性劑能與蛋白質(zhì)結(jié)合而分散在溶液中，故能夠提取結(jié)合酶。酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第11頁（3）酶制劑工業(yè)提取法發(fā)酵液預(yù)處理及過濾：在發(fā)酵液中加入絮凝劑（聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷氨酸）酶液脫色（活性炭、脫色樹脂）鹽析有機(jī)溶劑法噴霧干燥直接制備粉末酶制劑酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第12頁（4）酶純化

凡用于蛋白質(zhì)純化伎倆均適合用于酶純化.注意兩個問題：1.建立快速測定酶活力方法2.建立活力回收表

酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第13頁☆雜質(zhì)去除

PH和加熱沉淀法蛋白質(zhì)表面變性法選擇性變形法核酸沉淀劑法酶與底物結(jié)合☆脫鹽(透析、凝膠過濾）濃縮（超濾、真空減壓濃縮、薄膜濃縮、冷凍濃縮和聚乙二醇濃縮）☆酶結(jié)晶--處于過飽和狀態(tài)鹽析法有機(jī)溶劑沉淀法復(fù)合結(jié)晶法透析平衡法等電點(diǎn)法☆酶分離和純化過程注意事項(xiàng)（變性、輔因子流失、降解）酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第14頁

1938年Marn等人首次從牛紅血球中分離得到超氧化物歧化酶1969年McCord等重新發(fā)覺這種蛋白，而且發(fā)覺了它們生物活性，搞清了它催化過氧陰離子發(fā)生歧化反應(yīng)性質(zhì)，所以正式將其命名為超氧化物歧化酶。超氧化物歧化酶按其所含金屬輔基不一樣可分為三種：（1）是Cu.Zn—SOD，最為常見一個酶，呈綠色，主要存在于機(jī)體細(xì)胞漿中；（2）是Mn—SOD，呈紫色，存在于真核細(xì)胞線粒體和原核細(xì)胞內(nèi)；（3）是Fe—SOD），呈黃褐色，存在于原核細(xì)胞中。

1、概述超氧化物歧化酶

（Superoxidedismutase,SOD）酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第15頁人類SOD酶晶體結(jié)構(gòu)（彩虹彩色圖：N-末端

=藍(lán)色，C-末端

=紅色）結(jié)合銅（藍(lán)-綠球）與鋅（灰球）線粒體SOD酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第16頁2、SOD臨床作用

酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第17頁3、SOD應(yīng)用領(lǐng)域（1）藥品類主要集中在炎癥病患者，尤其治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、慢性多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、心肌梗塞、心血管病、腫瘤患者以及放射性治療炎癥病患者；（2）生化制藥作為一個生化酶制劑，廣泛應(yīng)用于臨床和科研上，可抗衰老，抗腫瘤、調(diào)整人體內(nèi)分泌系統(tǒng)；（3）化裝品可添加在化裝品中，含有抗氧化抗腐蝕優(yōu)良性能。以SOD為主要成份化裝品風(fēng)靡世界，引發(fā)了化裝品歷史上一場革命，使人類永葆青春漂亮夢想成真；（4）保健食品、飲料SOD糖、SOD口服液、SOD干啤等都非常暢銷。在飲料、糖果、糕點(diǎn)等食品中加入SOD既可利用其抗腐蝕性延長保質(zhì)期，又可調(diào)整人體內(nèi)分泌系統(tǒng)。酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第18頁酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第19頁4、SOD性質(zhì)對熱穩(wěn)定：天然牛血SOD可75℃加熱數(shù)分鐘，對熱穩(wěn)定性與溶液離子強(qiáng)度相關(guān)對pH穩(wěn)定性：普通pH5.3~9.5較穩(wěn)定，豬血SOD在pH7.6～9較穩(wěn)定金屬輔基與酶活性關(guān)系Cu、Zn-SOD：Zn與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，與催化活性無關(guān)Cu與活性相關(guān)，對酶活力是必需Mn-SOD：Mn對酶活力是必需Fe-SOD：Fe對酶活力是必需酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第20頁5、SOD制備酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第21頁提取工藝關(guān)鍵點(diǎn)：溶血液制備：新鮮牛血以3.8%檸檬酸鈉抗凝,血球分離機(jī)分離紅細(xì)胞,加2倍無離子水,攪拌溶血30min.選擇性熱變性：溶血液泵入夾層反應(yīng)釜,攪拌、蒸汽加熱至68℃,加入適量蛋白質(zhì)沉淀劑使血紅蛋白完全變性后,將反應(yīng)液泵入冷卻罐,攪拌機(jī)攪拌,快速冷卻至15℃,按反應(yīng)液總體積補(bǔ)加適量蛋白質(zhì)沉淀劑,攪拌1h,甩干過濾去除變性血紅蛋白,過濾液3000rpm20min低速離心,去除顆粒沉淀物.超濾濃縮：上清液經(jīng)微孔過濾去除細(xì)微顆粒,經(jīng)超濾器超濾濃縮至總體積1/200,搜集濃縮液.丙酮沉淀：超濾濃縮液預(yù)冷至4℃,加入等體積預(yù)冷工業(yè)丙酮,放置1h,4000rpm30min冷凍離心,沉淀用少許無離子水回溶,對無離子水透析12h,4000rpm30min冷凍離心,搜集上清液.柱層析：經(jīng)處理DEAE-52裝柱,用2.5mM/L緩沖液平衡,遲緩上樣,用梯度洗脫,搜集SOD部分,對無離子水透析12h.冷凍干燥透析后酶液經(jīng)濃縮,置凍干機(jī)內(nèi)冷凍干燥,升溫速率控制在5℃/h.酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第22頁6、SOD檢測SOD酶活力測定采取鄰苯三酚自氧化法,25℃自氧化速率0.07,pH8.2,50mMTris-HCl緩沖液.

蛋白質(zhì)濃度測定采取Lowry法,以250μg/mlBSA作標(biāo)準(zhǔn)曲線.分子量測定采取SDS電泳法,濃縮膠3.5%分離膠10%.

紫外吸收光譜檢測掃描波長范圍230~300nm.酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第23頁

溶菌酶（lysozyme）

1、概述

（1）溶菌酶（又稱胞壁質(zhì)酶、N-乙酰胞壁質(zhì)聚糖水解酶）是一個能水解致病菌中黏多糖堿性酶。主要經(jīng)過破壞細(xì)胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間β-1,4糖苷鍵，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，造成細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解。溶菌酶還可與帶負(fù)電荷病毒蛋白直接結(jié)合，與DNA、RNA、脫輔基蛋白形成復(fù)鹽，使病毒失活。所以，該酶含有抗菌、消炎、抗病毒等作用。（2）20世紀(jì)初，英國細(xì)菌學(xué)家弗萊明（Flemin）在發(fā)覺青霉素前6年（1922年）發(fā)覺人唾液、眼淚中存在有溶解細(xì)菌細(xì)胞壁酶，因其含有溶菌作用，故命名為溶菌酶。。酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第24頁（3）性質(zhì)：其純品為白色或微黃、黃色結(jié)晶體或無定型粉末，無異味，微甜，易溶于水，遇堿易被破壞，不溶于乙醚，溶菌酶由129個氨基酸殘基組成堿性球蛋白，等電點(diǎn)在pH10.8左右，分子量為14000，化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，當(dāng)PH值在1.2-11.3范圍猛烈改變時，其結(jié)構(gòu)幾乎不變，在酸性環(huán)境下，溶菌酶對熱穩(wěn)定性很強(qiáng)，pH4.0-7時，100℃處理1min仍能保持原油酸活性；pH值低于4時，能耐100℃加熱處理，在空氣濕度較低時，溶菌酶能夠長久在室溫下存放。

酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第25頁

2、溶菌酶制備酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第26頁

胰蛋白酶（Trypsin）

1、概述

胰蛋白酶系自牛、羊或豬胰中提取一個蛋白水解酶。白色或米黃色結(jié)晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24000，pI10.5，最適pH值7.8～8.5左右。pH>9.0不可逆失活。

酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第27頁2、臨床應(yīng)用能選擇地水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸羧基所組成肽鏈，能消化溶解變性蛋白質(zhì)，對未變性蛋白質(zhì)無作用，所以，能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易于引流排除，加速創(chuàng)面凈化，促進(jìn)肉芽組織新生，另外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生局部水腫、血腫及膿腫等。噴霧吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治療毒蛇咬傷。酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第28頁3、胰蛋白酶制備（一）酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第29頁可溶性固定化胰蛋白酶制備（二）（1）載體合成：將2g經(jīng)過堿處理殼聚糖,置于40mL二甲亞砜中,在攪拌下加入2g丁二酸酐,于65℃反應(yīng)4-6h。反應(yīng)結(jié)束后過濾,固相用乙醇浸泡1h,并將pH調(diào)到10左右。過濾后將沉淀物溶于蒸餾水中,用4倍體積丙酮沉淀,沉淀物再依次用無水乙醇和丙酮洗滌,40℃真空干燥后得N-琥珀酰殼聚糖。稱取1gN-琥珀酰殼聚糖,溶于20mL磷酸鹽緩沖液中,調(diào)整pH至4·5左右,離心搜集沉淀。將沉淀溶解于20mL磷酸鹽緩沖液,即得載體溶液。（2）可溶性固定化酶(soluble-immobilizedtrypsin,SIT)制備在磁力攪拌下向20mL載體溶液中滴加入一定量5%EDC

1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳二亞溶液和10mL胰蛋白酶磷酸鹽溶液(2mg/mL),于5-15℃反應(yīng)一段時間后,調(diào)整溶液pH至4·5左右,離心搜集沉淀,用檸檬酸鈉緩沖液(0·2mol/L,pH4·5)洗滌后,離心搜集沉淀。沉淀溶于磷酸鹽緩沖液(0·2mol/L,pH8·0),定容至50mL即得SIT溶液。酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第30頁尿激酶（Urokinase）

1、概述從健康人尿中分離，或從人腎組織培養(yǎng)中取得一個酶蛋白。本品直接作用于內(nèi)源性纖維蛋白溶解系統(tǒng)，能催化裂解纖溶酶原成纖溶酶，后者不但能降解纖維蛋白凝塊，亦能降解血循環(huán)中纖維蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，從而發(fā)揮溶栓作用分子式：C21H25BrN2O3分子量：433.35本品為白色狀粉末。

酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第31頁2、臨床作用：用于急性心肌梗塞、急性腦血栓形成和腦血管栓塞、肢體周圍動靜脈血栓、中中央電視臺網(wǎng)膜動靜脈血栓及其它新鮮血栓閉塞性疾病。

酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第32頁3、重組人尿激酶原（prouk）工業(yè)化制備

（1）重組人prouk工程菌發(fā)酵從LB(含50μg/mLKan)平板上挑取prouk工程菌單菌落于500mLLB培養(yǎng)基中,經(jīng)37℃、180r/min培養(yǎng)約12h后,接種至10L種子罐,初始時設(shè)定溫度為37℃,pH7.0,攪拌速度200r/min,通氣量5L/min,溶氧100%,打開酸泵(2mol/LHCl)和堿泵(濃氨水)控制pH為7.0.逐步增加通氣量至15L/min,攪拌速度最終提升到1000r/min.發(fā)酵進(jìn)行約4h,細(xì)菌生長進(jìn)入對數(shù)期,OD600可達(dá)12~15,移入100L發(fā)酵罐.控制pH為7.0,伴隨發(fā)酵進(jìn)行,溶氧逐步下跌,可增加通氣量和提升攪拌速度.約3h后,OD600增至約12~15,加入IPTG至終濃度0.5mmol/L,開始補(bǔ)充葡萄糖(25%,葡萄糖終濃度為每升低于1.5g).發(fā)酵過程中每1h取樣一次,測定OD600,繪制生長曲線,當(dāng)生長速度顯著減慢,曲線到達(dá)基本水平時放罐,用連續(xù)流離心機(jī),4℃、20000r/min離心培養(yǎng)物,搜集菌體并稱量,-80℃保留備用,整個過程約10~12h.酶類藥物醫(yī)學(xué)知識專家講座第33頁

（2）重組人prouk活化將已知重量菌體,按8mL/g濕重百分比加入裂解液(100mmol/LTris-HCl,5mmol/LEDTA,pH7.0)攪拌混勻.用弗氏壓碎器破碎細(xì)胞兩次(16000~18000Lb/in2),待細(xì)胞裂解液冷至4℃時用超聲勻漿儀超聲,直至溶液不再粘稠.4℃,12000g離心30min.取沉淀物(包涵體)懸浮在9倍體積洗滌緩沖液(100mmol/LTris