免疫檢測技術(shù)

第九章免疫檢測技術(shù)免疫檢測技術(shù)第1頁免疫檢測是當(dāng)前生物學(xué)檢測方法中用途最廣泛一個方法。含有高度準(zhǔn)確、靈敏、特異特點(diǎn)?？捎糜诿庖邔W(xué)基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究，也可應(yīng)用于生物學(xué)研究各個領(lǐng)域。免疫檢測技術(shù)第2頁1、免疫疾病診療

2、動物植物生理活動研究（激素、維生素）3、物種及微生物判定

4、動物、植物性狀免疫標(biāo)識

5、免疫增強(qiáng)藥品和疫苗研究

6、發(fā)病機(jī)理研究7、分子生物學(xué)研究

免疫檢測技術(shù)在生物科學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用：免疫檢測技術(shù)第3頁第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理

抗體能特異性地識別對應(yīng)抗原，并與之結(jié)合。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生，當(dāng)抗原和抗體在體外特異性結(jié)合后可出現(xiàn)肉眼可見或借助儀器可檢測出反應(yīng)現(xiàn)象。

試驗時既可用已知抗體檢測標(biāo)本中有沒有對應(yīng)抗原，也可用已知抗原檢測標(biāo)本中有沒有對應(yīng)抗體。這種特征就是許多免疫檢測方法基礎(chǔ)!!免疫檢測技術(shù)第4頁一、體外抗原抗體反應(yīng)特點(diǎn)①特異性：抗原抗體反應(yīng)含有高度特異性。②可逆性：抗原抗體反應(yīng)所形成復(fù)合物較穩(wěn)定，但在一定條件下可解離。（低酸、高鹽）③百分比性：抗原抗體百分比適當(dāng)，才可出現(xiàn)可見反應(yīng)現(xiàn)象。（網(wǎng)格理論）④階段性：特異性結(jié)合階段和可見反應(yīng)階段。免疫檢測技術(shù)第5頁網(wǎng)格理論——解釋抗原抗體形成沉淀機(jī)制免疫檢測技術(shù)第6頁網(wǎng)格學(xué)說（latticetheory）抗體過?？乖^?？贵w抗體百分比適當(dāng)抗原抗體免疫檢測技術(shù)第7頁二、影響抗原抗體反應(yīng)原因①溫度：在一定溫度范圍內(nèi)，提升溫度可加速反應(yīng)速度，縮短反應(yīng)時間，慣用反應(yīng)溫度為37-45℃。②溶液pH：pH過高或過低可改變抗原和抗體理化性質(zhì)，影響反應(yīng)結(jié)果，所以溶液pH應(yīng)適宜（pH6-8）。③電解質(zhì)：反應(yīng)中必須有適宜電解質(zhì)（0.85%NaCl）參加，不然不出現(xiàn)可見反應(yīng)。免疫檢測技術(shù)第8頁三、抗原抗體反應(yīng)類型1.沉淀反應(yīng)2.凝集反應(yīng)3.補(bǔ)體參加反應(yīng)4.中和反應(yīng)5.免疫標(biāo)識技術(shù)免疫檢測技術(shù)第9頁第二節(jié)常見免疫檢測方法可溶性抗原（血清蛋白、病毒抗原、細(xì)胞裂解液或組織液等）與對應(yīng)抗體結(jié)合，在一定條件下形成肉眼可見沉淀物稱沉淀反應(yīng)。一、免疫沉淀反應(yīng)免疫檢測技術(shù)第10頁一、免疫沉淀反應(yīng)

1.液相沉淀反應(yīng)2.凝膠擴(kuò)散沉淀3.凝膠免疫電泳絮狀沉淀環(huán)狀沉淀免疫濁度沉淀單向瓊脂擴(kuò)散試驗雙向瓊脂擴(kuò)散試驗血清免疫電泳火箭電泳對流免疫電泳免疫印跡等免疫檢測技術(shù)第11頁絮狀沉淀試驗操作步驟：（1）將可溶性抗原作一系列倍比稀釋。（2）各管加入一定濃度適量抗血清。（3）振搖使抗原、抗體充分混勻，置37℃孵育。（4）產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不一樣，以出現(xiàn)沉淀物最多管為最適百分比管。絮狀沉淀試驗方法簡單，設(shè)備要求低，敏感度較低，當(dāng)前多用以測定抗原抗體反應(yīng)最適比。免疫檢測技術(shù)第12頁環(huán)狀沉淀試驗操作步驟：（1）用毛細(xì)滴管吸收抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部，防止產(chǎn)生氣泡。（已知?。?）將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上，形成清楚交界面。（待測?。?）置沉淀管于室溫下使其反應(yīng)，1~5min內(nèi)在兩界面間展現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性。30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性。應(yīng)用：主要用于抗原定性試驗。用已知抗體來檢測未知抗原。

（診療炭疽Ascoli試驗、細(xì)菌分型、血跡判定）。

免疫檢測技術(shù)第13頁2.凝膠擴(kuò)散沉淀凝膠擴(kuò)散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成濃度梯度，抗原與抗體在百分比適當(dāng)擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線反應(yīng)。慣用凝膠有瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等。最慣用方法為：①單向瓊脂擴(kuò)散試驗②雙向瓊脂擴(kuò)散試驗免疫檢測技術(shù)第14頁單向瓊脂擴(kuò)散試驗

原理：

將適當(dāng)濃度抗體混入瓊脂凝膠中，瓊脂凝固后，打成小孔，加入待測抗原物質(zhì)，使抗原在凝膠中由小孔自由向周圍擴(kuò)散，并在小孔周圍適當(dāng)位置與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán)，沉淀環(huán)大小與抗原濃度呈正相關(guān)。免疫檢測技術(shù)第15頁單向免疫擴(kuò)散試驗示意圖免疫檢測技術(shù)第16頁雙向免疫擴(kuò)散試驗雙向免疫擴(kuò)散試驗是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個小孔，在相鄰兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料。當(dāng)抗原和抗體向四面凝膠中擴(kuò)散，在兩孔間可出現(xiàn)2～3條沉淀線，本法常用于抗原或抗體定性或定量檢測，或用于兩種抗原材料抗原相關(guān)性分析。免疫檢測技術(shù)第17頁免疫檢測技術(shù)第18頁3.免疫電泳技術(shù)

免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)結(jié)合產(chǎn)物。這種技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn)：一是加緊了沉淀反應(yīng)速度，二是將一些蛋白組分利用其帶電荷不一樣而將其分開，再分別與抗體反應(yīng)，以此作更細(xì)微分析。免疫電泳包含:血清免疫電泳、對流免疫電泳、火箭電泳、免疫印跡等

免疫檢測技術(shù)第19頁血清免疫電泳將抗原混合物（病人血清）在凝膠中用電泳分離后，沿電泳方向挖一平行小槽，加入抗血清，進(jìn)行雙向擴(kuò)散。沉淀線特點(diǎn)顯示病人血清與正常人血清存在差異，即血清蛋白組分缺乏或增加。免疫檢測技術(shù)第20頁免疫電泳原理圖解免疫檢測技術(shù)第21頁火箭免疫電泳火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗，它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來一項定量技術(shù)，實(shí)質(zhì)上是加速度單向擴(kuò)散。免疫檢測技術(shù)第22頁

沉淀線高度與抗原量成正比火箭電泳圖免疫檢測技術(shù)第23頁二、凝集反應(yīng)（Agglutination）

顆粒性抗原（如細(xì)菌、細(xì)胞）與對應(yīng)抗體，在適當(dāng)電解質(zhì)存在條件下，經(jīng)過一定時間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱為凝集反應(yīng)。1、直接凝集：將細(xì)菌或紅細(xì)胞與對應(yīng)抗體直接反應(yīng)，出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象。又分為玻片法和試管法。2、間接凝集：將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面，與對應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象。免疫檢測技術(shù)第24頁免疫檢測技術(shù)第25頁妊娠免疫診療試驗

孕婦尿中，絨毛膜促性腺激素（HCG）含量顯著增高。（HCG是可溶性抗原）反之，非孕婦尿中HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗體。免疫檢測技術(shù)第26頁三、補(bǔ)體結(jié)合試驗（2個系統(tǒng)，5種成份）免疫檢測技術(shù)第27頁已知抗原加入血清（檢測抗體）加入標(biāo)準(zhǔn)量補(bǔ)體加入包被抗體紅細(xì)胞檢測紅細(xì)胞溶解情況AgYYPatient’sserum

YYYYYYYYAbNoAbAg三、補(bǔ)體結(jié)合試驗（2個系統(tǒng)，5種成份）免疫檢測技術(shù)第28頁免疫標(biāo)識技術(shù)是采取酶、熒光素、放射性核素等標(biāo)識物標(biāo)識抗原或抗體所進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。免疫標(biāo)識技術(shù)既可對樣品作定性、定量檢測，也可進(jìn)行定位分析，且大大提升了方法靈敏度，是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛免疫學(xué)檢測技術(shù)。四、免疫標(biāo)識技術(shù)免疫檢測技術(shù)第29頁常見標(biāo)識免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)

四、免疫標(biāo)識技術(shù)免疫檢測技術(shù)第30頁該法是用放射性核素作為標(biāo)識物標(biāo)識抗原或抗體所進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)，盡管放射免疫技術(shù)需特殊儀器設(shè)備且有一定放射性危害，但因為其含有高度靈敏度（pg）和自動化檢測等特點(diǎn)，所以在實(shí)驗研究和臨床檢測中仍被廣泛應(yīng)用。主要用于激素、小分子藥品、腫瘤標(biāo)志物等小分子化合物定量分析。1.放射免疫技術(shù)（125I）免疫檢測技術(shù)第31頁放射免疫分析－基本原理競爭性結(jié)合反應(yīng)經(jīng)典標(biāo)識抗原（Ag*）和非標(biāo)識抗原（Ag）與限量抗體(Ab)競爭性結(jié)合Ag*和Ag含有等同與Ab結(jié)合能力免疫檢測技術(shù)第32頁

Ag*AbAg標(biāo)識抗原特異性抗體待測抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量

測定Ag*-Ab和游離Ag*放射性

放射免疫測定法(RIA)示意圖免疫檢測技術(shù)第33頁RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線

7550301001101001000未標(biāo)識抗原濃度（ng/mL)結(jié)合/未結(jié)合放射活性（%）Ag*-AbAg*免疫檢測技術(shù)第34頁將熒光素（異硫氰酸熒光素或羅丹明等）標(biāo)識抗體，制成熒光抗體診療試劑。用熒光顯微鏡觀察熒光產(chǎn)生或熒光強(qiáng)度，以此判斷抗原存在、定位和分布情況。免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等。2.免疫熒光技術(shù)免疫檢測技術(shù)第35頁免疫熒光技術(shù)——直接法AgY熒光素標(biāo)識特異性抗體組織切片免疫檢測技術(shù)第36頁免疫熒光技術(shù)——間接法AgYY熒光素標(biāo)識抗抗體組織切片待測抗體免疫檢測技術(shù)第37頁免疫熒光染色顯示細(xì)胞骨架

免疫熒光染色是利用抗原－抗體特異性結(jié)合原理，用經(jīng)熒光染料標(biāo)識抗體對細(xì)胞或組織內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或定量研究方法。該技術(shù)與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合，可對特定蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞或組織內(nèi)準(zhǔn)確定位。慣用于抗原、抗體標(biāo)識熒光染料有以下幾個顯示綠色熒光：Fluoresceinisothocyancie(FITC),Alexa-488顯示紅色熒光：RhodamineB,TexasRed,Alexa-546,568,594顯示藍(lán)色熒光：Alexa－350用Alexa488標(biāo)識抗人α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細(xì)胞核:紅色,DAPI染色人皮膚角化細(xì)胞免疫熒光染色用抗α-tubulin抗體染色顯示微管(綠色);細(xì)胞核:紅色,DAPI染色(激光共聚焦顯微鏡照片)PtK1細(xì)胞免疫熒光染色免疫檢測技術(shù)第38頁本法是抗原抗體反應(yīng)特異性與酶對底物高效催化活性相結(jié)合免疫檢測技術(shù)。酶標(biāo)識抗原或抗體與待檢標(biāo)本中對應(yīng)成份特異性結(jié)合，依據(jù)酶作用底物后顏色改變，采取肉眼或酶標(biāo)檢測儀分析、判斷結(jié)果。慣用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗和酶免疫組化法，前者用于檢測可溶性抗原或抗體，后者慣用于檢測組織中或細(xì)胞表面抗原。3.免疫酶測定法免疫檢測技術(shù)第39頁是在固相載體（通常為聚苯乙烯反應(yīng)板）表面進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。試驗中慣用酶是辣根過氧化物酶（HRP），底物為二苯基聯(lián)苯胺。酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）：免疫檢測技術(shù)第40頁ELISA試驗三個必要試劑(1)固相抗原或抗體（免疫吸附劑）(2)酶標(biāo)識抗原或抗體（標(biāo)識物）(3)酶作用底物（顯色劑）免疫檢測技術(shù)第41頁底物顯色定性或定量分析原理包被反應(yīng)加入待測抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體洗滌使結(jié)合在固相上抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合分離1234基本步驟免疫檢測技術(shù)第42頁五種常見檢測方法1雙抗夾心法（測定抗原）2測定抗體間接法3競爭法（測定抗原）4捕捉包被法測IgM抗體5ABS-ELISA法免疫檢測技術(shù)第43頁適合用于測定二價或二價以上大分子抗原，但不適合用于測定半抗原及低于二價小分子單價抗原，因其不能形成兩位點(diǎn)夾心

1雙抗夾心法測抗原免疫檢測技術(shù)第44頁2間接法測抗體免疫檢測技術(shù)第45頁幾個標(biāo)識/檢測技術(shù)靈敏度比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光靈敏度(mol/L)10-1810-1510-1210-9免疫檢測技術(shù)第46頁幾個標(biāo)識/檢測試劑使用期比較酶標(biāo)熒光放免發(fā)光使用期（月）1815129630免疫檢測技術(shù)第47頁020,00040,00060,00080,000100,000試劑盒儀器特殊防護(hù)治理污染人民幣人民幣三種免疫測定技術(shù)成本及費(fèi)用三種免疫測定技術(shù)成本及費(fèi)用放免酶標(biāo)發(fā)光免疫檢測技術(shù)第48頁A.

將Ab吸附在固相載體表面;B.加入酶標(biāo)Ag和待測Ag，競爭結(jié)合Ab；對照只加入酶標(biāo)Ag；C.加底物。對照孔與樣品孔底物降解量差＝未知Ag量。3競爭法測定抗原免疫檢測技術(shù)第49頁血清標(biāo)本中IgM包含針反抗原特異性IgM抗體和非特異性IgM

加入特異性抗原試劑：它只與固相上特異性IgM結(jié)合抗人IgM抗體包被加入血清標(biāo)本加入特異性抗原試劑加入針對特異性抗原酶標(biāo)抗體加底物顯色4捕捉包被法測IgM抗體免疫檢測技術(shù)第50頁捕捉法

原理：抗人IgMμ鏈抗體包被捕捉待測標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)識特異性抗原抗體底物顯色

免疫檢測技術(shù)第51頁ABS為親和素(avidin)生物素(b