基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件

第三章核酸操作基本技術(shù)

基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第1頁3.1堿抽提法提取DNA堿變性抽提法又稱堿抽提法或堿裂解法，是一個用最廣泛制備質(zhì)粒DNA方法，是當今分子生物學研究中常規(guī)方法。堿變性抽提法是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA變性與復性差異而到達分離目標。在pH值到達12.6堿性條件下，染色體DNA氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性，質(zhì)粒DNA大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環(huán)狀兩條互補鏈不會完全分離。當以pH4.8NaAc高鹽緩沖液調(diào)整其Ph至中性時，變性質(zhì)粒ＤＮＡ又恢復原來構(gòu)型，保留在溶液中，而染色體ＤＮＡ不能復性基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第2頁而形成纏連網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。經(jīng)過離心，染色體ＤＮＡ與不穩(wěn)定大分子ＲＮＡ、蛋白質(zhì)－ＳＤＳ復合物等一起沉淀下來而被除去。堿變性抽提質(zhì)粒ＤＮＡ，除了菌體培養(yǎng)、質(zhì)粒擴增和搜集菌體外，其提取過程大致分為三個步驟：（１）從染色體ＤＮＡ中分離質(zhì)粒ＤＮＡ。（２）去除質(zhì)粒ＤＮＡ中ＲＮＡ。（３）深入純化質(zhì)粒ＤＮＡ，去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第3頁3.1.1堿抽提法所用各類試劑生化作用（１）溶菌液中溶菌酶是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁主要化學成份肽聚糖中Ｂ－１，４糖苷鍵，因而含有溶菌作用。（２）NaOH-SDS液：核酸在pH５.９溶液中是穩(wěn)定，但當pH>１２或pH<３時，就會引發(fā)雙鏈之間氫鍵解離而變性。ＳＤＳ是離子型表面活性劑，它能夠溶解細胞膜上脂質(zhì)與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜、解聚基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第4頁細胞中核蛋白，還能與蛋白質(zhì)結(jié)合成為Ｒ－Ｏ－ＳＯ－３…R+－蛋白質(zhì)復合物，使蛋白質(zhì)變性而沉淀下來。不過ＳＤＳ能抑制核糖核酸酶作用，所以在以后提取過程中，必須把它去除潔凈，預防它影響Raase活性?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第5頁（３）ＮaＡc水溶液呈堿性，為了調(diào)整pH至4.8，必須加入大量冰醋酸。目標是把pH12.6抽提液調(diào)整至中性，使變性質(zhì)粒ＤＮＡ能夠復性，并能穩(wěn)定存在。而高鹽３mol/LNaAc有利于變性大分子染色體ＤＮＡ、ＲＮＡ、以及ＳＤＳ－蛋白復合物凝聚而沉淀之?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第6頁（４）乙醇：ＤＮＡ溶液是ＤＮＡ以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去ＤＮＡ周圍水分子，ＤＮＡ失水而易于聚合。普通試驗中，是加２倍體積無水乙醇與ＤＮＡ相聚合，其乙醇最終含量占６７％左右。基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第7頁（５）ＴＥ緩沖液：在基因操作試驗中，選擇緩沖液主要標準是考慮ＤＮＡ穩(wěn)定性及緩沖液成份不產(chǎn)生干擾作用。采取Tris-HCL緩沖系統(tǒng)，因為緩沖液是TrisH+/Tris,不存在金屬離子干擾作用，故在提取或保留ＤＮＡ時，大都采取Tris-HCL系統(tǒng)，而ＴＥ緩沖液中ＥＤＴＡ更能穩(wěn)定ＤＮＡ活性?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第8頁（６）酚－氯仿：酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時，蛋白質(zhì)分子之間水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白質(zhì)失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過離心，變性蛋白質(zhì)密度比水密度大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中ＤＮＡ分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第9頁（７）異戊醇：在抽提ＤＮＡ時，為了混合均勻，必須猛烈振蕩容器數(shù)次，這時在混合液內(nèi)易產(chǎn)生氣泡，氣泡會阻止分子相互間充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能降低抽提過程中泡沫產(chǎn)生。普通采取氯仿與異戊醇之比為２４：１。也可采取酚、氯仿與異戊醇之比為２５：２４：１。同時異戊醇有利于分相，使離心后上層水相、中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩(wěn)定。基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第10頁（８）飽和酚：因為酚與水有一定互溶，苯酚用水飽和目標是使其抽提ＤＮＡ過程中，不致吸收樣品中含有ＤＮＡ水分，降低ＤＮＡ損失。用Ｔris調(diào)整pH為８是因為ＤＮＡ在此條件下比較穩(wěn)定?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第11頁質(zhì)粒DNA小規(guī)模提?。瓑A裂解法1）接種一單菌落于3ml含70μl/mlAmpLB液體培養(yǎng)基中。200轉(zhuǎn)/分37℃振蕩培養(yǎng)過夜（約8－10h）。1rpm離心1min搜集細菌。2）用STE重懸細菌沉淀，1rpm離心5min，棄上清。3）將細菌沉淀重懸于100μl冰預冷溶液I中，加入200μl新配制溶液II，溫和轉(zhuǎn)動使之混勻，冰浴2min。4）加入150μl溶液III，將管倒置搖蕩1min，冰浴5min?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第12頁質(zhì)粒DNA提取溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，25mMTris.Cl（pH8.0），10mMEDTA（pH8.0），高壓滅菌，4℃保留。質(zhì)粒DNA提取溶液Ⅱ：0.2MNaOH，1%SDS，現(xiàn)配現(xiàn)用。質(zhì)粒DNA提取溶液Ⅲ：5M乙酸鉀溶液60ml，冰乙酸11.5ml，滅菌水28.5ml。基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第13頁5）1rpm離心8min，小心取上清于離心管中。加等體積酚：氯仿抽提一次。6）取上清液加入1/5體積5M乙酸胺，再加入2倍體積無水乙醇，1rpm離心5min，棄上清，加入70％乙醇沉淀。7）離心棄上清，真空抽干，去除痕量乙醇。8）加入50μlTE并加入1μlRNase放入37℃水浴1h。9）0.7%瓊脂糖電泳檢測其含量?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第14頁3.1.2堿抽提法抽提DNA過程中應注意問題（1）染色體DNA、蛋白質(zhì)與RNA是否去除潔凈，是否取得一定得率質(zhì)粒DNA。（2）所用器皿必須嚴格清洗，各種試劑配制是否準確，有需高壓高溫滅菌。（3）加乙醇沉淀DNA時，要把離心管加蓋搖動4-5次，注意觀察水相與乙醇之間沒有分層現(xiàn)象之后，才能夠放入冰箱中沉淀DNA?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第15頁3.2DNA提取其它方法2.2.1質(zhì)粒DNA分離純化2.2.1.1微量提取質(zhì)粒ＤＮＡ小規(guī)模制備質(zhì)粒ＤＮＡ特點是能夠一次制備各種質(zhì)粒ＤＮＡ，速度快、省時間、步驟簡化、ＤＮＡ純度好，能夠用于酶切、連接，甚至多純化幾次還可作雙鏈ＤＮＡ序列分析模板等常規(guī)基因工程操作之用。主要有以下方法：有煮沸法、９６孔微量滴定板法、堿變性ＳＤＳ和和ＳＥＴ法、單鏈質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備法、不需要苯酚抽提質(zhì)粒ＤＮＡ小量制備和用商品化試劑盒制備質(zhì)粒ＤＮＡ等?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第16頁3.2.1質(zhì)粒ＤＮＡ大量制備在制作酶譜、測定序列、制備探針等試驗中需要高純度、高濃度質(zhì)粒ＤＮＡ，為此需要大量提取質(zhì)粒ＤＮＡ。大量提取質(zhì)粒ＤＮＡ普通需深入純化，慣用柱層析法和氯化銫梯度離心法。ＤＮＡ抽提方法主要有：煮沸裂解法、ＳＤＳ裂解法、Triton裂解法和Wizard大量ＤＮＡ純化系統(tǒng)等?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第17頁質(zhì)粒DNA大量制備1）接種含有目標片段單菌落于100ml液體LB培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。4000rpm，4℃離心10min，搜集菌體。2）將細菌沉淀用20ml冰預冷STE溶液重懸，按上述方法重新離心，去上清，倒置，用吸水紙吸干殘留液，加入冰預冷溶液Ⅰ2ml，將細菌沉淀重懸。3）加200μl新配制溶菌酶溶液(10mg/ml溶于10mMTris·Cl，pH8.0)，混勻。4）加入4ml新配制溶液Ⅱ，遲緩顛倒數(shù)次，充分混勻內(nèi)容物，于室溫放置5-10min。5）加2ml用冰預冷溶液Ⅲ，將離心管顛倒數(shù)次，冰浴15min。1rpm，4℃離心20min?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第18頁6）將上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加0.6倍體積異丙醇，充分混勻，于室溫放置10min。10000rpm，室溫離心15min，回收質(zhì)粒沉淀。7）去除上清，用70%乙醇洗沉淀一次，稍抽干，溶于1mlTE中。8）加入5μlRNaseA（5mg/ml），37℃消化1hr。9）轉(zhuǎn)移至小離心管，用等體積苯酚，苯酚∶氯仿，氯仿，各抽提一次。10）加入1/5體積10MNH4AC，再加入2倍體積無水乙醇，混勻，室溫放置30min。1rpm，室溫離心10min。11）棄上清，70%乙醇洗沉淀兩次，真空抽干，溶于適量TE中，儲存于-20℃?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第19頁3.2.2質(zhì)粒ＤＮＡ純化１、聚乙二醇沉淀法純化質(zhì)粒ＤＮＡ２、氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心法純化閉環(huán)ＤＮＡ３、從質(zhì)粒ＤＮＡ制品中去除ＲＮＡ（１）經(jīng)過１mol/LNaCl進行離心（２）經(jīng)過Bio-GelA-150m或SepharoseCL-4B進行層析基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第20頁3.2.3基因組或其它ＤＮＡ抽提2.2.2.1細菌基因組ＤＮＡ制備以微量制備法為例：１、５ml細菌培養(yǎng)液生長至對數(shù)生長久。取1.5ml轉(zhuǎn)入小離心管中離心２min.2、用567ulＴＥ緩沖液重新懸浮沉淀，加入30ul１０％ＳＤＳ和3ul20mg/ml蛋白酶Ｋ，混合。在３７℃下保溫１h。３、加入100ul５mol/LNaCl，完全混合，再加入80ulCTAB-NaCl溶液，混合。在65℃下保溫10min。(CTAB,十六烷基三甲基溴化銨)基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第21頁４、加入等體積酚－氯仿－異戊醇，混合。離心４－５min，將上清液轉(zhuǎn)移至一新離心管中。５、按上述步驟重復抽提。將上清液轉(zhuǎn)移至一新離心管中。６、加入0.6倍體積異丙醇，輕輕混合直至ＤＮＡ沉淀。用70%乙醇洗一下沉淀。離心５min，棄去上清液后真空干燥。用100ulＴＥ緩沖液重新懸?。模危??；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第22頁3.2.4哺乳動物細胞基因組ＤＮＡ抽提哺乳動物基因組DNA通常先用SDS等裂解,再用苯酚抽提進行分離。用這類方法產(chǎn)生DNA長度（100-150kb）適合用于Southern分析和用λ噬菌體構(gòu)建基因組文庫?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第23頁1、哺乳動物組織細胞DNA提取組織樣保留在70%乙醇中，－20℃凍存。提?。模危習r組織樣需研碎，乙醇揮發(fā)掉，提取方法同質(zhì)粒ＤＮＡ提取法。2、哺乳動物血液基因組DNA提?。?）取750ul凍存血加入等量PBS，混合均勻（2）1rpm離心5分鐘，棄上清（3）加入450ulDNA提取buffer,重懸沉淀（4）加入Rnase至終濃度20ug/ml，37℃溫育1小時基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第24頁(5)加入蛋白酶K至終濃度100ug/ml,混勻，55℃水浴消化過夜(6)加入等體積Ｔris飽合酚，溫和搖動10分鐘，1rpm離心５分鐘(7)將上層水相轉(zhuǎn)移至另一潔凈離心管(8)再加入等體積酚：氯仿和氯仿，各抽提一次(9)上層水相用1/5體積乙酸鈉和２倍體積無水乙醇沉淀ＤＮＡ(10)1rpm離心10分鐘，搜集沉淀，70％乙醇洗沉淀(11)真空抽干，用適量TE（pH8.0）溶解ＤＮＡ基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第25頁2.2.5從植物中分離基因組DNA

從植物中分離高產(chǎn)量和高質(zhì)量DNA不是一件輕易事。因為細胞壁及植物特有細胞內(nèi)物質(zhì)，需要用較特殊處理方法。1、用CTAB抽提植物DNA（1）將組織放入離心管中，加入5倍體積抽提緩沖液，再加入一些洗過滅菌海沙于-20℃冷凍?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第26頁（2）用杵將組織壓軟，置組織于液氮中磨碎。（3）短暫振蕩，于65℃溫浴5min。（4）加1倍體積氯仿-異戊醇混合物，輕輕顛倒幾次使之混勻。離心5min,將上層水相轉(zhuǎn)移到另一管中。（5）加1倍體積溴化乙錠液，1倍體積苯酚和1倍體積氯仿，輕輕混勻。離心取上清。溴化乙錠可幫助除去多糖。大多數(shù)植物組織可省去這一步。基因工程之核酸操作的基本技術(shù)培訓課件第27頁（6）加1/10體積3mol/L醋酸鈉和1倍體積異丙醇，于-20℃放置30min或過夜，沉淀DNA。（7）以1r/min離心10min，倒掉上清。（8）加0.5ml冷70%乙醇，重懸沉淀，離心2min。（9）真空或37℃放置10min，干燥DNA。（10）適量TE溶解DNA?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第28頁3.3DNA定量和純度測定對于基因操作中載體DNA和外源目標DNA片段，必須對其濃度、純度、構(gòu)型、相對分子量大小等基本情況進行了解。有時DNA中含有酚類和多糖類物質(zhì)會影響酶切和PCR效果，尤其DNA濃度是一個非常關(guān)鍵原因。3.3.1紫外光譜分析法紫外光譜分析法原理基于DNA（RNA）分子在260nm處有特異紫外吸收峰且吸收強度與系統(tǒng)中DNA或RNA濃度成正比。該法特點是準確、簡便，但所需儀器較昂貴?；蚬こ讨怂岵僮鞯幕炯夹g(shù)培訓課件第29頁因為測定OD260時，難以排除RNA、染色體DNA、以及解鏈增色效應原因，所以測得數(shù)據(jù)往往比實際濃度偏高。衡量所提取DNA純度可用OD260與OD280比值。OD260/OD280對DNA而言其值大