哮喘患病及危險因素的研究

哮喘患病及危險因素的研究第1頁/共29頁ERCC1codon118單核苷酸多態(tài)性與草酸鉑敏感性的關(guān)聯(lián)性研究第2頁/共29頁

前言

大腸癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病及死亡率較高的惡性腫瘤。近年來我國的大腸癌發(fā)生率也呈逐年上升趨勢。遺傳、飲食、腸道內(nèi)微生態(tài)失衡等因素可能與其發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。早期治療的大腸癌一般預(yù)后良好，但對于進(jìn)展期大腸癌患者，大多數(shù)治療效果不盡人意。故探求新的有效治療手段對挽救進(jìn)展期大腸癌患者生命和提高生存質(zhì)量具有重要意義。第3頁/共29頁

草酸鉑（Oxaliplatin）是新一代鉑類抗腫瘤藥物，具有抗癌譜廣，毒副作用小等優(yōu)點，尤其可以用于有效治療進(jìn)展期大腸癌。然而由于臨床用藥的盲目與濫用，無論單獨還是聯(lián)合應(yīng)用，草酸鉑的目標(biāo)有效率也僅為20%-35%。因此，提高草酸鉑使用的有效性及安全性，降低耐藥性的相關(guān)研究逐漸受到普遍關(guān)注。第4頁/共29頁

鉑類藥物的細(xì)胞毒作用主要歸因為鉑原子與細(xì)胞內(nèi)DNA特異位點結(jié)合形成的鉑-DNA加合物產(chǎn)生鏈間交聯(lián)或鏈內(nèi)交聯(lián)，抑制DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。故其藥物抵抗性與腫瘤細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力密切相關(guān)。草酸鉑因具有1，2二氨基環(huán)己烷（DACH）結(jié)構(gòu)，與DNA鏈中的鳥氨酸形成的DACH-Pt-DNA加合物更易誘導(dǎo)參與核苷酸切除修復(fù)（NER）途徑的酶類，啟動NER。第5頁/共29頁

NER過程涉及包括識別DNA損傷位點，切開受損的DNA鏈，合成并連接DNA鏈，以取代切除的寡核苷酸等，大約18-25個活性因子在其中發(fā)揮作用。第6頁/共29頁

切除修復(fù)交叉互補(bǔ)集團(tuán)1基因（ERCC1）編碼的ERCC1蛋白是NER途徑中的關(guān)鍵因子.ERCC1與XPF形成一異源二聚體:ERCC1-XPF，具有重要的結(jié)構(gòu)特異性核酸內(nèi)切酶活性，在雙鏈DNA交界處酶促5’端裂解，損傷的寡核苷酸可被切除。ERCC1蛋白表達(dá)水平的差異，可能直接影響到細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力。第7頁/共29頁

誘導(dǎo)ERCC1蛋白表達(dá)，增加細(xì)胞的DNA修復(fù)損傷能力是一把“雙刃刀”。一方面受損的DNA修復(fù)系統(tǒng)會增加發(fā)生腫瘤的危險性，這在肺癌、頭頸腫瘤等惡性腫瘤的病因?qū)W研究中得到證實。另一方面ERCC1表達(dá)降低則難以清除鉑-DNA加合物，增加腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物的敏感性也是不爭的事實。因此,ERCC1蛋白表達(dá)缺陷會降低細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)能力，可能致使細(xì)胞對草酸鉑敏感性升高。第8頁/共29頁

據(jù)報道ERCC1基因存在著兩個常見的單核苷酸多態(tài)性,其中一個位于第4外顯子118密碼子（ERCC1codon118SNPs）,盡管這是一種保守的同義核苷酸突變（AAT→AAC），兩者皆編碼絲氨酸,但有人認(rèn)為該SNP不同基因型可能通過改變ERCC1蛋白表達(dá)水平而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對于草酸鉑敏感性的差異,故將ERCC1codon118SNPs作為判斷草酸鉑治療進(jìn)展期腸癌療效的一個遺傳預(yù)測標(biāo)記。第9頁/共29頁

研究目的:

*證實ERCC1蛋白表達(dá)水平與草酸鉑敏感性的關(guān)聯(lián)*闡明ERCC1蛋白在草酸鉑細(xì)胞毒性機(jī)制的作用*構(gòu)建兩種包含ERCC1codon118SNP表達(dá)載體，獲得穩(wěn)定表達(dá)ERCC1不同基因型蛋白的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系*比較ERCC1codon118SNP不同基因型對ERCC1蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞DNA損傷修復(fù)能力及對草酸鉑敏感性的影響

第10頁/共29頁材料與方法

細(xì)胞系

中國倉鼠卵巢細(xì)胞系（CHO）:AA8（CHO野生型）

UV20（CHO突變型，ERCC1表達(dá)缺失）

DMEM培養(yǎng)基，37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。

第11頁/共29頁方法:

構(gòu)建兩種包含ERCC1codon118SNP

的基因型T/T或C/C的質(zhì)?？俁NA提取及cDNA合成PSQTMDNA短序列分析ERCC1SNP基因型ERCC1基因擴(kuò)增及目的片段的回收Gateway?定向克隆技術(shù)構(gòu)建ERCC1表達(dá)載體第12頁/共29頁Gateway?定向克隆技術(shù)構(gòu)建ERCC1表達(dá)載體示意圖第13頁/共29頁2、不同ERCC1SNP的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染UV20細(xì)胞

轉(zhuǎn)染細(xì)胞可在含10%G418的DMEM培養(yǎng)基選擇生長，次日調(diào)G418濃度為5%，五日后，在熒光顯微鏡下根據(jù)是否可見表達(dá)綠色熒光蛋白細(xì)胞，確定是否轉(zhuǎn)染成功及轉(zhuǎn)染效率。

每次轉(zhuǎn)染實驗設(shè)立無DNA的空白對照組，以保證實驗結(jié)果的特異性第14頁/共29頁3、蛋白提取及Westernblot檢測ERCC1表達(dá)獲得3種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系UV20-ERCC1(C/C)或

UV20-ERCC1(T/T)及UV20-GFP,聚丙稀凝膠電泳法定性檢測ERCC1蛋白表達(dá)

4、檢測各轉(zhuǎn)染細(xì)胞ERCC1mRNA水平

實時-定量PCR法5、PSQTMDNA短序列確定轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因型

第15頁/共29頁6、SRB法測定草酸鉑的細(xì)胞抑制率

7、細(xì)胞克隆實驗分析草酸鉑細(xì)胞毒性

8、改良彗星實驗檢測草酸鉑所致DNA損傷9、Rad51免疫熒光實驗評價草酸鉑所致DNA損傷及修復(fù)第16頁/共29頁結(jié)果1、ERCC1入門載體及表達(dá)載體的構(gòu)建、酶切鑒定及測序分析

ERCC1入門載體pDONR-ERCC1(3150bp)可選擇生長于含1%卡那霉素培養(yǎng)基平板，質(zhì)粒純化后，用PstⅠ進(jìn)行限制性酶切，得到533bp和2617bp的預(yù)期片段。

ERCC1表達(dá)載體pIRES-GFP-ERCC1(6626bp)可選擇生長于含1%氨芐青霉素培養(yǎng)基平板經(jīng)HindⅢ酶切后可獲1227bp,5039bp片段,而經(jīng)BglⅡ酶切后可獲891bp,5735bp片段。第17頁/共29頁2、ERCC1在UV20細(xì)胞中的表達(dá)圖1，ERCC1不同SNP轉(zhuǎn)染細(xì)胞與UV20的FITC熒光圖象比較（╳100）第18頁/共29頁3、Westernblot驗證ERCC1在各細(xì)胞系中表達(dá)

38kDERCC1圖2，WesternBlot檢測ERCC1蛋白表達(dá)第19頁/共29頁4、轉(zhuǎn)染細(xì)胞ERCC1的SNP確定

第20頁/共29頁5、不同細(xì)胞ERCC1mRNA水平比較

AA8、UV20以及三種轉(zhuǎn)染細(xì)胞ERCC1mRNA水平差別具有統(tǒng)計學(xué)意義.（F=664.06,P=0.00）ERCC1缺乏細(xì)胞UV20和UV20-GFP均無ERCC1表達(dá)（LSD,P=0.732）。兩種ERCC1SNPs轉(zhuǎn)染細(xì)胞ERCC1表達(dá)接近.（LSD,P=0.648）

第21頁/共29頁6、草酸鉑的細(xì)胞抑制率測定及細(xì)胞克隆實驗結(jié)果

圖4，各細(xì)胞草酸鉑染毒后SRB細(xì)胞抑制率測定結(jié)果第22頁/共29頁圖5，各細(xì)胞草酸鉑染毒后細(xì)胞克隆實驗結(jié)果第23頁/共29頁圖7，草酸鉑染毒后細(xì)胞培養(yǎng)24h兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞彗星實驗圖象（╳100）

第24頁/共29頁7、改良彗星實驗測定各細(xì)胞DNA損傷修復(fù)程度

第25頁/共29頁第26頁/共29頁圖9，ERCC1不同SNPs轉(zhuǎn)染細(xì)胞草酸鉑處理后24h免疫熒光圖象（╳100）第27頁/共29頁討論ERCC1基因存在著兩個常見的單核苷酸多態(tài)性有報道認(rèn)為ERCC1codon118SNP擁有T/T基因型的卵巢癌細(xì)胞系與ERCC1mRNA水平降低相關(guān),有人將ERCC1codon11819007T>CSNP作為判斷草酸鉑治療進(jìn)展期腸癌療效的一個遺傳預(yù)測標(biāo)記。但與此相反，通過對31例進(jìn)展期腸癌分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，T/T基因