阿魏酸酯酶的研究與應(yīng)用

隨著全球人口和經(jīng)濟(jì)規(guī)模的不斷增長，能源使用帶來的環(huán)境問題及其誘因不斷地為人們所認(rèn)識，不止是煙霧、光化學(xué)煙霧和酸雨等的危害，大氣中二氧化碳濃度升高將帶來的全球氣候變化，也已被確認(rèn)為不爭的事實。二氧化碳的釋放很大部分是由于植物秸稈的燃燒。這不盡污染了環(huán)境而且也是對能源的浪費(fèi)。當(dāng)前1頁，總共32頁。圖一：中國主要糧食作物年平均秸稈燃燒情況3.96×108t0.94×108t當(dāng)前2頁，總共32頁。圖二：糧食作物秸稈露天焚燒排放情況當(dāng)前3頁，總共32頁。纖維素是世界上最豐富的天然有機(jī)物，占植物界碳含量的50％以上。圖三：一般木材中的成分此外，麻、麥稈、稻草、甘蔗渣等，都是纖維素的豐富來源。當(dāng)前4頁，總共32頁。所以，應(yīng)如何充分利用秸稈，木材等生物原料？分解纖維素的酶：纖維素酶、木聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、阿魏酸酯酶當(dāng)前5頁，總共32頁。什么是阿魏酸酯酶？當(dāng)前6頁，總共32頁。一：阿魏酸酯酶feruloylesterase阿魏酸酯酶指能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵，將阿魏酸游離出來的一種酶。它能切斷細(xì)胞壁中多糖-多糖、多糖-木質(zhì)素間的交聯(lián)，有利于細(xì)胞壁物質(zhì)中多糖的降解和木質(zhì)素的釋放，因此在食品、飼料和造紙工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)前7頁，總共32頁。阿魏酸酯酶A的三維結(jié)構(gòu)當(dāng)前8頁，總共32頁。阿魏酸

阿魏酸(FerulicAcid)的化學(xué)名稱為4羥基3甲氧基肉桂酸，是植物界普遍存在的一種酚酸,在植物體內(nèi)很少以游離態(tài)存在,主要與細(xì)胞壁多糖和木質(zhì)素交聯(lián)構(gòu)成細(xì)胞壁的一部分，與低聚糖、多胺、脂類和多糖形成結(jié)合態(tài)。它有許多保健功能,如清除自由基、抗血栓、抗菌消炎、抑制腫瘤、防治高血壓、心臟病等。阿魏酸毒性低,易于為人體代謝,其用途越來越廣泛。阿魏酸在食品工業(yè)中主要用于制備天然香蘭素、抗氧化劑、防腐劑、交聯(lián)劑和機(jī)能促進(jìn)劑等,阿魏酸可通過化學(xué)合成法和提取法獲得。阿魏酸分子式當(dāng)前9頁，總共32頁。目錄：一、阿魏酸酯酶feruloylesterase二、阿魏酸酯酶對其它纖維素酶類具有協(xié)同作用三、阿魏酸酯酶的結(jié)構(gòu)以及催化特性四、阿魏酸酯酶的分類和催化專一性五、阿魏酸酯酶的最適作用條件六、阿魏酸酯酶的應(yīng)用七、黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、表達(dá)及快速酶活檢測體系的建立八、阿魏酸酯酶的研究現(xiàn)狀及展望當(dāng)前10頁，總共32頁。二、阿魏酸酯酶對其它纖維素酶類具有協(xié)同作用

例1：

當(dāng)阿魏酸酯酶加入量為240mu/g對底物水解72h時,稻草纖維素的酶解率、不溶性底物失重率較不加阿魏酸酯酶分別增加了32.00%、32.77%；阿魏酸酯酶(300mu/g)對底物作用120min后，纖維素酶對稻草纖維素的酶解率、不溶性底物失重率分別增加了29.85%、32.48%。由此表明,阿魏酸酯酶和纖維素酶之間存在較大的協(xié)同作用，添加阿魏酸酯酶能夠提高纖維素酶對天然木質(zhì)纖維素的酶解效率。當(dāng)前11頁，總共32頁。例2：在pH值為5.0、45℃、料液比1∶30（g∶mL）條件下，取47.5U/mL的木聚糖酶粗酶液15mL，加入1.0g麥糟的乙醇不溶物，反應(yīng)12h后，加入40.8U/mL的阿魏酸酯酶粗酶液15mL再反應(yīng)12h，阿魏酸和低聚木糖釋放率分別為54.1%和161mg/g（麥糟的乙醇不溶物）。結(jié)果表明，阿魏酸酯酶與木聚糖酶存在協(xié)同作用，能極大提高麥糟中阿魏酸及低聚木糖的釋放率，有利于麥糟的降解。當(dāng)前12頁，總共32頁。三、阿魏酸酯酶的結(jié)構(gòu)以及催化特性由于其催化底物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，相應(yīng)的阿魏酸酯酶也有著相當(dāng)復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。雖然不同的阿魏酸酯酶結(jié)構(gòu)有差異，但都為球蛋白質(zhì)且大都具有Ser-His-Asp的“三點催化活性中心”僅結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtu-berculosis)產(chǎn)生的酶的活性中心由Ser-Glu-His組成。阿魏酸酯酶A氨基酸序列：MKISAPRALALSVAVGHALAAVTKGVSDNIYNRLVDMATISQAAYADLCKIPATITTVEKIYNAQTDINGWVLRDDSRQEIIVVFRGTAGDTNLQLDTNYTLAPFDTLPKCIGCAVHGGYYLGWTSVQDQVESLVQQQAGQYPEYALTVTGHSLGASMAAITASQLSATYEHVTLYTFGEPRTGNLAYASYMNENFEATSPETTRFFRVTHGNDGIPNLPPAEQGYVHSGIEYWSVDPHRPGSTSVCTGNEVQCCEAQGGQGVNDDHITYFGMASGACSW-當(dāng)前13頁，總共32頁。MKQFSAKYALILLATAGQALAASTQGISEDLYNRLVEMATISQAAYADLCNIPSTIIKGEKIYNAQTDINGWILRDDTSKEIITVFRGTGSDTNLQLDTNYTLTPFDTLPQCNDCEVHGGYYIGWISVQDQVESLVKQQASQYPDYALTVTGHSLGASMAALTAAQLSATYDNVRLYTFGEPRSGNQAFASYMNDAFQVSSPETTQYFRVTHSNDGIPNLPPADEGYAHGGVEYWSVDPYSAQNTFVCTGDEVQCCEAQGGQGVNDAHTTYFGMTSGACTW當(dāng)前14頁，總共32頁。催化過程中阿魏酸酯酶的催化中心和輔助中心將阿魏酸酯化合物中的阿魏酸殘基束縛，而后經(jīng)過一系列化學(xué)過程將酯鍵斷裂,使阿魏酸游離出來。當(dāng)前15頁，總共32頁。四、阿魏酸酯酶的分類和催化專一性阿魏酸酯酶對苯乙酸酯類具有催化專一性,然而不同的阿魏酸酯酶的催化專一性也有所不同,依據(jù)催化專一性的不同,阿魏酸酯酶最初被分為A、B兩種類型,后來又發(fā)現(xiàn)了一些其他類型。當(dāng)前16頁，總共32頁。

A型這一類阿魏酸酯酶對以1,5-酯鍵連接在阿拉伯糖殘基C-5上的阿魏酸具有催化專一性。當(dāng)原料用木聚糖酶預(yù)處理過或用木聚糖酶與阿魏酸酯酶協(xié)同水解時,產(chǎn)物中有少量的5,5’-和8-O-4’-阿魏酸二聚體。A型的阿魏酸酯酶對苯環(huán)上有甲氧基(特別是在3,5位)的酚類酯都有催化特性。A型阿魏酸酯酶還可以催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、芥子酸甲酯以及香蘭酸甲酯中的酯鍵,但是對咖啡酸甲酯無效。AnFaeA就是屬于A型的阿魏酸酯酶。當(dāng)以谷物作為培養(yǎng)基時,微生物傾向于產(chǎn)生A型阿魏酸酯酶。當(dāng)前17頁，總共32頁。

B型以甜菜渣做培養(yǎng)基時,微生物傾向于分泌B型阿魏酸酯酶。B型的阿魏酸酯酶對連接在阿拉伯糖殘基C-2和半乳糖殘基C-6上的阿魏酸酯鍵具有專一性,黑曲霉來源的B型阿魏酸酯酶對1,5-阿魏酸阿拉伯糖酯鍵也有催化作用,但效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于A型。另外B型的阿魏酸酯酶不能使阿魏酸二聚體游離出來。B型阿魏酸酯酶還可以催化水解人工合成的阿魏酸甲酯、咖啡酸甲酯以及香蘭酸甲酯中的酯鍵,但是對芥子酸甲酯無效。B型阿魏酸酯酶的產(chǎn)酶微生物主要有黑曲霉、青霉和鏈孢霉菌等。當(dāng)前18頁，總共32頁。

第三種類型目前還發(fā)現(xiàn)一種稱作XYLD的乙酸酯酶具有阿魏酸酯酶活性,它是從熒光假單胞桿菌的一個亞種中分離得到的,它對苯乙烯酚酸酯類(阿魏酸酯、咖啡酸酯、香蘭酸酯以及芥子酸酯)的化合物同樣有催化作用。用XYLD處理小麥的外殼,產(chǎn)物中有5,5’-阿魏酸二聚體。此外,也有研究者依據(jù)誘導(dǎo)產(chǎn)酶培養(yǎng)基、能水解的酯鍵、肽鏈中氨基酸的序列和產(chǎn)物中是否產(chǎn)生阿魏酸的二聚體等因素進(jìn)一步把阿魏酸酯酶細(xì)分為A、B、C、D4類。當(dāng)前19頁，總共32頁。Table1Classificationofferuloylesterases當(dāng)前20頁，總共32頁。菌株名稱黑曲霉Aspergillusniger產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum繩狀青霉Penicilliumfuniculosum熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens粗糙脈孢菌Neurosporacrassa互隔交鏈孢菌Alternaria

alternata甘藍(lán)鏈格孢菌Alternariabrassicicola當(dāng)前21頁，總共32頁。阿魏酸酯酶的名稱Type-AferuloylesterasefromPenicilliumchrysogenumType-BferuloylesterasefromPenicilliumchrysogenumType-CferuloylesterasefromPenicilliumchrysogenumType-AferuloylesterasefromAspergillusnigerType-BferuloylesterasefromAspergillusNigerType-CferuloylesterasefromSporotrichumthermosporumPcFacCPcFacBStFaeCAnFaeBPcFacAAnFaeA當(dāng)前22頁，總共32頁。五、阿魏酸酯酶的最適作用條件阿魏酸酯酶種類不同,其作用的最適條件也不盡相同。表1列出了典型的產(chǎn)酶微生物黑曲霉所產(chǎn)生的幾種阿魏酸酯酶的最適作用條件。當(dāng)前23頁，總共32頁。例：方園等人利用泡盛曲霉固體發(fā)酵麥麩，蔗渣等纖維質(zhì)原料產(chǎn)生阿魏酸酯酶，并對其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行初步檢驗，結(jié)果表明：該酶制劑最適pH為6.0，最適溫度為25℃，Cu2+、Fe2+、EDTA對該酶活力有激活作用，Mg2+、Zn2+、Mn2+則有一定的抑制作用。其中，Cu2+的最適添加濃度為0.25mol/L，EDTA與Fe2+的最適添加濃度為0.20mol/L。W(最適酶):W(底物)=1:100，在1.5h后，酶解產(chǎn)率達(dá)到最高。并研究該酶對去淀粉麥麩、蔗渣、玉米皮和玉米芯這4種天然纖維質(zhì)原料的酶解效果，結(jié)果表明該酶對去淀粉麥麩的酶解效果最佳。產(chǎn)生阿魏酸的質(zhì)量濃度達(dá)到72.93mg/L。當(dāng)前24頁，總共32頁。六、阿魏酸酯酶的應(yīng)用

1.在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究表明阿魏酸可以作為抗氧化劑用于油脂的抗氧化,除此之外,阿魏酸還具有的抗腫瘤、消炎、促進(jìn)傷口愈合等保健作用,所以阿魏酸可作為功能因子開發(fā)功能性的食品。同時,阿魏酸可以作為合成天然香蘭素的前體,以阿魏酸為原料,利用微生物的方法生產(chǎn)的香蘭素與合成的香蘭素相比具有毒性低,安全性高的特點,可以用作食品和化妝品行業(yè)的香料。阿魏酸大量存在于植物的細(xì)胞壁中,研究者使用阿魏酸酯酶和使用阿魏酸酯酶與其他酶協(xié)同作用從各種農(nóng)作物的副產(chǎn)品中提取阿魏酸的研究取得了一定的成果,目前主要使用麥麩、玉米麩皮等作為原材料來提取阿魏酸。當(dāng)前25頁，總共32頁。

2.在飼料和造紙工業(yè)中的應(yīng)用利用阿魏酸酯酶處理植物性的原材料,可以將阿魏酸從植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)中游離出來,從而破壞了細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu),使得木質(zhì)素、半纖維素以及纖維素之間的連接被部分打破,結(jié)構(gòu)變得比處理前疏松。在飼料工業(yè)中,變得疏松的原料更容易被牲畜消化吸收利用,可以提高飼料的利用效率。而在造紙工業(yè)中,纖維素是構(gòu)成紙張的主要成分,半纖維素可部分被利用,木質(zhì)素是需要去除的成分,經(jīng)阿魏酸酯酶處理的原料,木質(zhì)素更容易脫除,因而可以減少制漿工序的化學(xué)藥品用量。而纖維細(xì)胞壁經(jīng)阿魏酸酯處理后,表面變得疏松,更容易形成分叉,在成紙時,纖維間的交織力變大,可以提高紙品的機(jī)械強(qiáng)度。當(dāng)前26頁，總共32頁。

七、黑曲霉阿魏酸酯酶A的克隆、

表達(dá)及快速酶活檢測體系的建立當(dāng)前27頁，總共32頁。黑曲霉在PDA固體培養(yǎng)基上劃線活化挑取黑曲霉孢子接種于50mL黑曲霉液體基本培養(yǎng)基中收集菌體以CTAB法提取總RNA以總RNA為模板，以oligo(dT)為引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA.以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增出編碼阿魏酸酯酶的cDNA經(jīng)膠回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T克隆載體上后轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。7.1.黑曲霉阿魏酸酯酶AcDNA的獲得培養(yǎng)5d培養(yǎng)24h當(dāng)前28頁，總共32頁。7.2.表達(dá)載體的構(gòu)建、陽性克隆的篩選和表達(dá)以正確的