HBV基因分型和耐藥突變基因檢測的臨床應(yīng)用

HBV基因分型和耐藥突變基因檢測的臨床應(yīng)用第1頁/共29頁乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的肝臟炎性損害。是我國當(dāng)前流行最廣泛、危害最嚴(yán)重的一種傳染病。

HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV感染的流行強(qiáng)度差異很大。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3.5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌(HCC)[1]。

[1]WorldHealthOrganization.HepatitisB.WorldHealthOrganizationFactSheet204dex.(RevisedOctober2000).WHOWebsite./mediacentre/factsheets/fs204/en/inhtml.流行病學(xué)第2頁/共29頁流行病學(xué)ClinicalandEpidemiologicCorrelationsinHBVInfection.LokAS,McMahonBJ.ChronichepatitisB.Hepatology2007;45:507-39.[Erratum,Hepatology2007;45:1347.]第3頁/共29頁流行病學(xué)2006年全國乙型肝炎流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明：我國1～59歲人群乙肝表面抗原攜帶率為7.18%，據(jù)此推算，我國現(xiàn)有的慢性HBV感染者約9300萬人，其中慢性乙型肝炎患者約2000萬例[2][2]《慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）》中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì)，2010年12月10日第4頁/共29頁病原學(xué)HBV（hepatitisBvirus）乙型肝炎病毒，屬嗜肝病毒科，基因組長約3.2Kb，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。HBV已發(fā)現(xiàn)有A~I9個(gè)基因型，在我國以C型和B型為主。包膜：

HBsAg

糖蛋白

細(xì)胞脂肪

核心：

HBV-DNA

DNA-Polymerase

HBcAg第5頁/共29頁病原學(xué)HBV侵入肝細(xì)胞后，部分雙鏈環(huán)狀HBVDNA在細(xì)胞核內(nèi)以負(fù)鏈DNA為模板延長正鏈以修補(bǔ)正鏈中的裂隙區(qū)，形成共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)；然后以cccDNA為模板，轉(zhuǎn)錄成幾種不同長度的mRNA，分別作為前基因組RNA和編碼HBV的各種抗原。

cccDNA半壽

(衰)期較長，很難從體內(nèi)徹底清除。??第6頁/共29頁HBV感染和發(fā)展的結(jié)局圖HBV感染可有不同的發(fā)展和結(jié)局，這是由病毒和宿主雙方因素決定的。病毒方面：感染的數(shù)量和毒株的異質(zhì)性、以及傳播的方式；宿主方面：免疫狀態(tài)、以及決定免疫狀態(tài)的年齡、遺傳素質(zhì)、基礎(chǔ)健康狀況和并存的疾病。自然史第7頁/共29頁診斷?臨床診斷

既往有乙型肝炎病史或HBsAg陽性超過6個(gè)月，現(xiàn)HBsAg和（或）HBVDNA仍為陽性者，可診斷為慢性HBV感染?？煞譃椋?/p>

慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、攜帶者、隱匿性慢性乙型肝炎?實(shí)驗(yàn)室診斷

?生物化學(xué)檢查：ALT、AST、血清白蛋白、PT、膽堿酯酶、AFP

?血清學(xué)檢查

?HBVDNA、基因型和變異檢測：定量檢測、分型和耐藥突變檢測?影像學(xué)診斷?病理學(xué)診斷第8頁/共29頁治療慢性乙型肝炎治療的總體目標(biāo)

最大限度地長期抑制HBV，減輕肝細(xì)胞炎癥壞死及肝纖維化，延緩和減少肝臟失代償、肝硬化、HCC及其并發(fā)癥的發(fā)生，從而改善生活質(zhì)量和延長存活時(shí)間。慢性乙型肝炎治療

抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和抗氧化、抗纖維化和對(duì)癥治療。

抗病毒治療是關(guān)鍵，只要有適應(yīng)證，且條件允許，就應(yīng)進(jìn)行規(guī)范的抗病毒治療。第9頁/共29頁干擾素：直接抗病毒作用和免疫調(diào)節(jié)作用清除病毒。我國已批準(zhǔn)普通IFNα（2α、2b和1b）和聚乙二醇干擾素α（2α和2b）用于治療慢性乙型肝炎。

HBV基因型與疾病進(jìn)展和干擾素α治療效果有關(guān)。與C基因型感染者相比，B基因型感染者較早出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，較少進(jìn)展為慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。HBeAg陽性患者對(duì)干擾素α治療的應(yīng)答率，B基因型高于C基因型；A基因型患者高于D基因型

。治療第10頁/共29頁治療核苷（酸）類藥物：競爭性抑制HBVDNA聚合酶；參與新的HBVDNA鏈合成過程中，終止新鏈合成。目前已應(yīng)用于臨床的抗HBV核苷（酸）類藥物有3類，我國已上市4種。核苷（酸）類似物L(fēng)-核苷類似物無環(huán)磷酸酯環(huán)戊烯拉米夫定LMV阿德福韋酯ADV恩替卡韋ETV恩曲他濱ETB替諾福韋TDF阿巴卡韋ABV替比夫定LdT

克立夫定CLV第11頁/共29頁治療耐藥是核苷酸類藥物的共性耐藥檢測的意義?治療前檢測，有助于臨床判斷用藥是否有效；?治療中每3~6個(gè)月檢測，有助于觀察療效，及時(shí)調(diào)整用藥。EASLClinicalPracticeGuidelines：ManagementofchronichepatitisB.EuropeanAssociationfortheStudyoftheLiver.JHepatol,2009,50:227-242.第12頁/共29頁HBV基因分型和耐藥突變基因檢測產(chǎn)品介紹第13頁/共29頁乙型肝炎病毒分型和耐藥突變基因檢測試劑盒

（PCR-反向點(diǎn)雜交法）國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2011第3401179號(hào)第14頁/共29頁樣本處理芯片制備第15頁/共29頁產(chǎn)品用途在抗病毒治療前和治療中對(duì)血清/血漿中的HBV進(jìn)行基因分型和耐藥突變基因檢測12區(qū)分中國和其他亞洲國家常見的HBV-B、C、D基因型檢測HBV3類抗病毒藥物5個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn)的6種突變類型第16頁/共29頁HBV耐藥突變基因檢測的臨床意義1.抗病毒藥物治療前的藥物選擇在慢性乙肝患者抗病毒藥物治療前，進(jìn)行耐藥突變基因檢測，可以指導(dǎo)臨床醫(yī)生合理選擇抗病毒藥物，真正實(shí)現(xiàn)個(gè)體化診治。2.抗病毒藥物治療中的藥效監(jiān)測在慢性乙肝患者抗病毒藥物治療過程中，進(jìn)行耐藥突變基因檢測，可以監(jiān)測抗病毒藥物治療效果并及時(shí)調(diào)整治療方案。第17頁/共29頁HBV基因分型的臨床意義1.預(yù)測疾病進(jìn)展與C基因型感染者相比，B基因型感染者較早出現(xiàn)HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換，較少進(jìn)展為慢性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝細(xì)胞癌。2.治療方案的選擇

HBeAg陽性患者對(duì)干擾素α治療的應(yīng)答率，B基因型高于C基因型；A基因型患者高于D基因型3.流行病學(xué)調(diào)查研究第18頁/共29頁1.準(zhǔn)確性：檢測105例臨床慢性HBV感染陽性樣本，結(jié)果與測序比較顯示為相同的基因型和耐藥突變類型，準(zhǔn)確率為100%。2.特異性：檢測50例臨床HBV陰性樣本結(jié)果全部為陰性；檢測非HBV感染性病原體DNA，包括C型肝炎病毒（HCV）、乙型腦炎病毒、梅毒螺旋體和HIV，結(jié)果均為陰性。3.靈敏度：能穩(wěn)定檢測血清HBV的最低檢出限為1.0×103IU/mL。4.精密度：檢測2.0×103IU/mL的血清HBV，批內(nèi)和批間的一致性好。5.穩(wěn)定性：產(chǎn)品有效期為6個(gè)月，在有效期內(nèi)產(chǎn)品性能穩(wěn)定。產(chǎn)品性能指標(biāo)第19頁/共29頁產(chǎn)品使用產(chǎn)品操作流程第20頁/共29頁產(chǎn)品使用HBV膜條探針陣列圖rt=reversetranscriptase，逆轉(zhuǎn)錄酶。以逆轉(zhuǎn)錄酶編碼氨基酸的順序命名各檢測位點(diǎn)。如：rt180L表示逆轉(zhuǎn)錄酶編碼氨基酸第180位為亮氨酸。CC為顯色控制點(diǎn)。第21頁/共29頁試驗(yàn)成立的條件

顯色控制點(diǎn)CC正常顯色。陽性質(zhì)控品正常顯色同時(shí)陰性質(zhì)控品除CC外其他所有陣列位點(diǎn)不顯色。結(jié)果判讀

根據(jù)顯色（藍(lán)色斑點(diǎn)）出現(xiàn)的陣列位點(diǎn)直接判讀HBV的基因型和耐藥突變類型。示例：產(chǎn)品使用第22頁/共29頁產(chǎn)品使用結(jié)果判讀示例第23頁/共29頁交叉耐藥突變與核苷類似物藥物的關(guān)系表注釋：①耐藥水平分高、中、低三級(jí)，以體外實(shí)驗(yàn)IC50的變化倍數(shù)計(jì)算（變化倍數(shù)是相比較于野生株而言）；IC50指：最大藥物抑制濃度的一半。②低：IC50＜5×；中：IC50為5×~20×；高：IC50＞20×。LMVLdTADVTDFETVrtL180M中中//低rtM204V/I高高//中rtV/M207I中低///rtA181V中中中低中rtN236T低/中//MarcChany,T.JakeLiang.DrugtargetsandmolecularmechanismsofdrugresistanceinchronichepatitisB.Gastroenterology,2007(132):1574-1585.產(chǎn)品使用第24頁/共29頁適用人群及科室適用人群：慢性乙肝患者的用藥指導(dǎo)及療效監(jiān)測科室：檢驗(yàn)科、感染科、消化內(nèi)科、肝病科等使用原則：慢性乙肝患者抗病毒藥物治療前進(jìn)行檢測，確定HBV基因型和是否發(fā)生耐藥突變，指導(dǎo)選擇敏感的治療藥物；在抗病毒治療過程中建議3-6個(gè)月進(jìn)行一次檢測，實(shí)時(shí)監(jiān)控耐藥突變的發(fā)生。第25頁/共29頁檢測后的處理

----慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）

對(duì)于接受拉米夫定治療的患者，一旦檢出基因型耐藥或HBVDNA開始升高時(shí)就加用阿德福韋酯聯(lián)合治療，抑制病毒更快、耐藥發(fā)生較少、臨床結(jié)局較好。