大腸埃希菌耐藥因子傳遞實(shí)驗(yàn)影響因素的探究

大腸埃希菌耐藥因子傳遞實(shí)驗(yàn)影響因素的探究吳佳軒;高陽(yáng);鄭群【摘要】目的利用第二課堂實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，探究耐藥因子傳遞實(shí)驗(yàn)的影響因素，摸索最佳接合條件，提高大腸埃希菌接合效率.方法通過(guò)耐鏈霉素大腸埃希菌和耐卡那霉素大腸埃希菌接合傳遞實(shí)驗(yàn)，摸索最佳接合條件，包括接合時(shí)間、細(xì)菌濃度、供受體配比等結(jié)果時(shí)間因素對(duì)接合效率的影響很大,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)接合效率不斷提高，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析90min為最佳時(shí)間.濃度因素也有影響，供受體2:5的配比優(yōu)于其他兩組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).結(jié)論濃度和時(shí)間是最大的兩個(gè)影響因素，供受比2:5,時(shí)間90min為接合效率最高的條件.【期刊名稱】《繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育》【年(卷)，期】2019(033)002【總頁(yè)數(shù)】2頁(yè)(P137-138)【關(guān)鍵詞】大腸埃希菌;耐藥因子;接合【作者】吳佳軒;高陽(yáng);鄭群【作者單位】首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，北京100069;首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，北京100069;首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，北京100069【正文語(yǔ)種】中文【中圖分類(lèi)】G642抗生素的問(wèn)世，為細(xì)菌感染性疾病提供了最有力的治療手段，但隨著抗菌藥物的大量出現(xiàn)和抗生素的濫用，耐藥菌株逐漸增多，細(xì)菌耐藥性甚至多重耐藥性愈發(fā)嚴(yán)重并引起人們的關(guān)注［1］。細(xì)菌耐藥性通常表現(xiàn)為交叉耐藥和多重耐藥兩種特性，細(xì)菌從單一耐藥發(fā)展為多重耐藥，是不同藥物分別作用或耐藥基因隨質(zhì)粒等傳播的結(jié)果［2-3］。遺傳學(xué)研究揭示，細(xì)菌耐藥尤其多重耐藥性是由于一種染色體以外的遺傳因子一R質(zhì)粒(resistanceplasmid)所致，這種耐藥性可以通過(guò)接合(conjugation)轉(zhuǎn)移給敏感菌株，使后者獲得耐藥性［4］。以大腸埃希菌為例，引起多重耐藥的一個(gè)重要原因是大腸埃希菌獲取外源性耐藥基因，其中最主要的一種方式是細(xì)菌接合，而接合性質(zhì)粒作為一種可以獨(dú)立復(fù)制也可以移動(dòng)的基因元件，在細(xì)菌接合中起到關(guān)鍵的作用［5］，因此細(xì)菌接合實(shí)驗(yàn)對(duì)探究細(xì)菌多重耐藥性機(jī)制十分重要。本實(shí)驗(yàn)室是基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)室，承擔(dān)病原生物學(xué)與免疫學(xué)的實(shí)驗(yàn)教學(xué)任務(wù)，長(zhǎng)期以來(lái)一直致力于拓寬思路，更好的培養(yǎng)學(xué)生的綜合能力與科研素質(zhì)，利用第二課堂開(kāi)辟實(shí)驗(yàn)平臺(tái)，培養(yǎng)本科生的科學(xué)思維和科研能力。本研究小組將耐藥因子傳遞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更深層次的改良和探索，摸索最佳接合條件，包括接合時(shí)間、細(xì)菌濃度、供受體菌的不同配比等，通過(guò)對(duì)大腸埃希菌接合效率的影響因素探索，獲得更高的接合效率，更深刻地了解細(xì)菌的耐藥機(jī)制及耐藥基因的傳播機(jī)制。1材料與方法1.1材料1.1.1細(xì)菌。抗卡那霉素的大腸埃希菌為實(shí)驗(yàn)供體菌，抗鏈霉素的大腸埃希菌為實(shí)驗(yàn)受體菌，前者含有R質(zhì)粒，供受體菌均購(gòu)自中科院微生物研究所，保存于本實(shí)驗(yàn)室-80°C冰箱內(nèi)。常規(guī)復(fù)蘇細(xì)菌，傳代三次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌進(jìn)行測(cè)定，調(diào)整細(xì)菌濃度至0.8x109/ml備用。1.1.2培養(yǎng)基。LB培養(yǎng)基：稱量普通瓊脂培養(yǎng)基干粉9.9g，瓊脂1.0g，并加入300ml蒸餾水，進(jìn)行滅菌，待培養(yǎng)基60^左右，加入鏈霉素-卡那霉素混合液1.95ml（鏈霉素1.5ml，卡那霉素0.45ml，二者為2.5萬(wàn)單位/ml），倒入平皿中，待冷卻后進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)。普通肉湯管：稱量2g干粉肉湯培養(yǎng)基，加入100ml蒸餾水并混勻，然后微波爐高溫加熱，使其融化，立即分裝于5ml試管中，每試管2ml,滅菌，進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)后存放于4°C冰箱備用。含卡那霉素固體培養(yǎng)基：制作方法同LB培養(yǎng)基，僅加入卡那霉素液（卡那霉素0.45ml,2.5萬(wàn)單位/ml）。含鏈霉素固體培養(yǎng)基：制作方法同LB培養(yǎng)基，僅加入鏈霉素液（鏈霉素1.5ml,2.5萬(wàn)單位/ml）。1.1.3儀器。生物安全柜（Escoclassbsc），高壓蒸汽滅菌鍋（MSL-3780），恒溫培養(yǎng)箱（Memmert500），分光光度儀，水浴箱，微波爐等。1.1.4抗生素與生化制劑?？敲顾兀?00萬(wàn)單位/干粉，購(gòu)自華北制藥股份有限公司），鏈霉素（50萬(wàn)單位/注射液/2ml,購(gòu)自江蘇東臺(tái)市制藥廠），普通瓊脂培養(yǎng)基干粉，營(yíng)養(yǎng)瓊脂，干粉肉湯培養(yǎng)基，生理鹽水等。1.2方法1.2.1菌株初篩。取凍存于-80C冰箱的大腸埃希菌供體菌、大腸埃希菌受體菌，接種于普通肉湯管中復(fù)蘇，36C培養(yǎng)16-24小時(shí)，常規(guī)傳代三次，調(diào)整細(xì)菌濃度至0.8x109/ml。供體菌接種于含卡那霉素固體培養(yǎng)基，受體菌接種于含鏈霉素固體培養(yǎng)基，37C培養(yǎng)16-24小時(shí)，分別挑選出單個(gè)生長(zhǎng)旺盛的菌落接種于普通肉湯管，繼續(xù)傳代。1.2.2R因子接合傳遞實(shí)驗(yàn)。供體菌與受體菌分別按體積量1:5、2:5、3:5共計(jì)3個(gè)比例混合，同時(shí)把每個(gè)配比設(shè)置6個(gè)時(shí)間點(diǎn)30min、45min、60min、90min、120min、24h于37C恒溫培養(yǎng)，進(jìn)行接合傳遞實(shí)驗(yàn)，在設(shè)定的時(shí)間點(diǎn)將對(duì)應(yīng)配比混合液均勻涂在LB上，于37C恒溫箱中培養(yǎng)16-24小時(shí)，最后用無(wú)菌生理鹽水沖洗菌落于測(cè)量管中，利用分光光度計(jì)測(cè)量其OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次，結(jié)果取實(shí)驗(yàn)平均值。2結(jié)果2.1供體菌與受體菌接合時(shí)間對(duì)傳遞實(shí)驗(yàn)的影響如圖（圖1）所示，供體菌與受體菌三個(gè)不同濃度配比均隨接合時(shí)間的延長(zhǎng)，接合效率越高，24小時(shí)重組菌達(dá)到高峰。對(duì)各時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，各組的60min和90min比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）,24h與120min比較，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其余各時(shí)間點(diǎn)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），考慮到實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中受學(xué)時(shí)限制，因此接合90min為最佳接合時(shí)間。2.2供體菌與受體菌濃度比例對(duì)傳遞實(shí)驗(yàn)的影響如圖（圖1）所示，1:5、2:5、3:5三個(gè)不同的供體菌與受體菌濃度配比，在90min、120min、24h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果顯示，2:5的配比優(yōu)于其他兩組，經(jīng)組間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而1:5、3:5兩組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明最佳的供受體菌濃度配比為2:5。圖1大腸埃希菌接合傳遞實(shí)驗(yàn)結(jié)果3討論細(xì)菌接合是細(xì)菌間基因轉(zhuǎn)移和多重耐藥菌產(chǎn)生的一種重要方式，研究細(xì)菌接合能夠更深入的了解耐藥菌的產(chǎn)生機(jī)制［5］。本實(shí)驗(yàn)主要是通過(guò)對(duì)耐鏈霉素大腸埃希菌和耐卡那霉素大腸埃希菌進(jìn)行接合傳遞實(shí)驗(yàn)，探究影響接合效率的因素。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，時(shí)間因素對(duì)接合效率的影響很大，接合時(shí)間少于45min培養(yǎng)不出接合子，推測(cè)可能是由于時(shí)間過(guò)短，耐藥質(zhì)粒無(wú)法完成從供體菌到受體菌的轉(zhuǎn)移，因此沒(méi)有接合子的形成。隨著接合時(shí)間的延長(zhǎng)，接合效率不斷提高，24h時(shí)達(dá)到高峰，但此時(shí)間點(diǎn)的菌落生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，無(wú)法得到單一接合子菌落進(jìn)行測(cè)量。推測(cè)可能是由于單耐藥菌在24h里繁殖過(guò)多，導(dǎo)致抗生素選擇能力下降。供體菌受體菌的濃度比例也對(duì)接合效率產(chǎn)生一定影響，發(fā)生接合的必要條件之一就是供體菌和受體菌間的接觸［6］，合適的濃度配比可以達(dá)到最佳的接合效率。供受比在2:5時(shí)，接合子最多，達(dá)到3:5時(shí)，接合效率反而下降，推測(cè)可能是由于供體菌的生長(zhǎng)會(huì)對(duì)接合菌產(chǎn)生生存壓力而降低效率，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。綜上所述，對(duì)于耐鏈霉素和耐卡那霉素大腸埃希菌的接合實(shí)驗(yàn)來(lái)說(shuō)，濃度和時(shí)間是最大的兩個(gè)影響因素，供受比為2:5,時(shí)間為90min為最佳條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)于后續(xù)的細(xì)菌接合機(jī)制、耐藥因子傳遞機(jī)制、多重耐藥機(jī)制的研究可以提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。本實(shí)驗(yàn)研究是利用第二課堂項(xiàng)目由本科學(xué)生自主完成，第二課堂既是第一課堂的有效補(bǔ)充，也是提高學(xué)生綜合能力的有效途徑［7-8］。通過(guò)第二課堂實(shí)踐，讓醫(yī)學(xué)生參與科研訓(xùn)練和科學(xué)實(shí)驗(yàn)，有助于醫(yī)學(xué)生科學(xué)思維的培養(yǎng)、科研能力的提升、專業(yè)知識(shí)的拓寬，從而全面提高能力和素質(zhì)。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)實(shí)驗(yàn)課的教學(xué)效果也產(chǎn)生了影響，本研究可以作為設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)在課堂教學(xué)中展開(kāi)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)貫穿基本的科研設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果清晰，對(duì)于教學(xué)效果的改善，學(xué)生們的理解都有很大的幫助。參考文獻(xiàn)【相關(guān)文獻(xiàn)】［1］朱陣，曹明澤，張吉麗，等.細(xì)菌耐藥性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2015,42(12):33713376.［2］徐春泉，周翠，徐琦煜，等.大腸埃希菌毒力因子檢測(cè)及其與耐藥相關(guān)性研究［J］.疾病監(jiān)測(cè)，2010,25(7):542-545.［3］高璐琰，楊鐘，武瑞兵，等.細(xì)菌耐藥性研究進(jìn)展［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2013,40(7):162-166.［4］李明遠(yuǎn)，徐志凱.醫(yī)學(xué)微生物學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2015:51-54,62-64.ThomasCM.Paradigmsofplasmidorganization[J].MolecularMicrobiology,2000,37(3):485-491.翁夢(mèng)薇，計(jì)徐，鄭衛(wèi)江，等