大腸桿菌紫外誘變實(shí)驗(yàn)

大腸桿菌紫外誘變實(shí)驗(yàn)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹砍醪秸莆照T變方案的設(shè)計(jì)和紫外誘變的實(shí)驗(yàn)手段。理解自發(fā)突變和紫外誘變的機(jī)理，分析不同誘變目的、誘變手段和誘變篩選在誘變應(yīng)用中的關(guān)系。了解誘變育種在微生物工業(yè)中的作用。【實(shí)驗(yàn)原理】微生物菌種質(zhì)量?jī)?yōu)劣對(duì)發(fā)酵工業(yè)具有至關(guān)重要的作用，由于自然界中的菌種一般在生產(chǎn)上都有不同程度的缺陷，而且自然突變頻率低，突變幅度小，單純依靠自然界中微生物群體來(lái)進(jìn)行的自然選擇有很大的局限性，往往不能滿足實(shí)際生產(chǎn)的需要。因此現(xiàn)在的微生物發(fā)酵生產(chǎn)菌種絕大多數(shù)都是經(jīng)過(guò)人工改造的，而菌種改造有誘變改造和基因改造兩方面。雖然現(xiàn)在基因工程菌已經(jīng)成為越來(lái)越重要的菌種改造方式，但通過(guò)物理化學(xué)誘變對(duì)菌種品質(zhì)進(jìn)行改造仍然是工業(yè)生產(chǎn)菌重要的來(lái)源。誘變分為物理誘變和化學(xué)誘變。物理誘變采用紫外光、X射線、射線、射線、射線、快中子和超聲波等，其中紫外光誘變因其效果好、實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而成為應(yīng)用最廣泛的物理誘變劑。而化學(xué)誘變則是采用一些可以和DNA起作用，改變其分子結(jié)構(gòu)，最終引起遺傳改變的化學(xué)物質(zhì)對(duì)誘變對(duì)象進(jìn)行處理，得到誘變菌種的方法。實(shí)驗(yàn)室中常用的有亞硝酸、硫酸二乙酯、亞硝酸胍等（這3種誘變劑誘變效果依次增加，毒性也依次增大）。物理誘變往往被分為電離輻射和非電離輻射，常用的電離輻射有X射線、射線、射線、快中子等。電離輻射的特點(diǎn)是穿透力強(qiáng)，對(duì)生物作用分為直接作用和間接作用。輻射的直接作用是指輻射所產(chǎn)生的直接物理?yè)p傷，是由于能量量子直接與染色體作用而造成的原始損傷，是一種物理作用；而輻射的間接作用則是一種化學(xué)作用，是由于生物細(xì)胞中的水分子受到輻射作用產(chǎn)生各種自由基，這些自由基和溶質(zhì)分子或直接和染色體發(fā)生作用產(chǎn)生遺傳損傷。由于不同作用的時(shí)效差別，輻射的作用過(guò)程大體可分為物理、物理化學(xué)、化學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)等4個(gè)階段，時(shí)效發(fā)生可以從10-12s到幾年。輻射中常采用的劑量單位為倫琴（R）。一個(gè)倫琴相當(dāng)于在00C及101325Pa（760mmHg）下，每立方厘米干燥空氣中能產(chǎn)生2.082109個(gè)離子對(duì)的電離劑量。此外還有拉德（rad）、爾格（erg）、居里（Ci）等單位。其換算關(guān)系如下：1rad=100erg/g=10-2J/kg=60241017MeV/g1erg=6.241011eV1Ci=3.701010次衰變/秒非電離輻射最典型的就是紫外線，其電磁波譜位置為40~390nm。而由于DNA分子的紫外吸收峰位于260nm。因而波長(zhǎng)在200~300nm之間的紫外線被用于紫外誘變。紫外誘變時(shí)的劑量與所用紫外燈管的功率以及照射距離和照射時(shí)間相關(guān)，實(shí)驗(yàn)中往往采用改變照射時(shí)間來(lái)改變照射劑量。由于照射致死率在95%~99%的時(shí)候回復(fù)突變株出現(xiàn)率最高，因而實(shí)踐中多用70%~80%的致死率進(jìn)行誘變。化學(xué)誘變和物理誘變相比主要的差別是誘變的特異性強(qiáng)，往往專一作用于DNA分子的特定結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)誘變主要分為4大類：堿基類似物、烷化劑、移碼突變劑和其他類。由于不同的化學(xué)誘變劑性能差別很大，在使用前必須對(duì)影響其效果的溫度、PH值、光照、溶劑等做清楚的分析，同時(shí)對(duì)其半衰期、毒性及防護(hù)也要充分了解，這樣才能保證使用的有效性和人體安全性?；瘜W(xué)誘變的劑量是由使用濃度和處理時(shí)間決定的，操作中可以根據(jù)需要選擇高濃度短時(shí)間處理或是低濃度長(zhǎng)時(shí)間處理。在誘變中制定好誘變方案是很重要的，誘變育種包括誘變和篩選兩步。首先制定一個(gè)明確的篩選目標(biāo)，因?yàn)檎T變是不定向的，我們必須采用定向的篩選方法將我們所需要的菌株從原始菌和突變株中分離出來(lái)，同時(shí)還應(yīng)考慮選出的菌種在生長(zhǎng)速度、溫度適應(yīng)、產(chǎn)孢子等方面不能產(chǎn)生過(guò)多不適應(yīng)生產(chǎn)的變化。在充分考慮了實(shí)驗(yàn)的工作量要求后結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室的人力、物力和時(shí)間要求提出誘變和篩選方案。在篩選方法選擇中要考慮到兼顧篩選色工作量和可信度。當(dāng)篩選方法可信度高時(shí)，往往檢測(cè)方法是比較繁瑣的（尤其是涉及一些蛋白質(zhì)或氨基酸含量變化的突變類型）。這時(shí)為了提高篩選工作量往往降低篩選的可信度，減少篩選的繁瑣程度，而在復(fù)篩中進(jìn)一步加以確定。根據(jù)篩選目的和實(shí)驗(yàn)室條件選用合適的誘變劑。篩選方案確定后，不要經(jīng)常改變，保持工作的穩(wěn)定性，這樣有利于總結(jié)提高。本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌為材料，選擇紫外線為誘變劑，進(jìn)行誘變處理：篩選青霉素抗性菌，繪制致死曲線并計(jì)算誘變率?！緦?shí)驗(yàn)用具及材料】1.菌種大腸桿菌（Escherchiacoli）2.實(shí)驗(yàn)試劑及培養(yǎng)基BP培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基），見(jiàn)附錄I。青霉素BP培養(yǎng)基，見(jiàn)附錄II。生理鹽水，見(jiàn)附錄III。3.其他用具培養(yǎng)皿、三角瓶、離心管、試管、吸管、取液器、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、紫外線照射箱等。【實(shí)驗(yàn)方法及步驟】1.菌體準(zhǔn)備（1）細(xì)菌培養(yǎng)：接種E.coli到BP液體培養(yǎng)基（500mL三角瓶裝100mL培養(yǎng)基），置370C、200r/min培養(yǎng)16-18h，這時(shí)搖瓶中的菌液密度為107-108個(gè)菌/mL。（2）收集菌體：將三角瓶中的菌液轉(zhuǎn)入離心管中，4000r/min離心10min。離心后，倒去上清液，加入100mL無(wú)菌生理鹽水溶液和玻璃珠將細(xì)菌沉淀打勻，待用（取用之前務(wù)必?fù)u勻）。2.細(xì)菌計(jì)數(shù)（1）菌液稀釋：取三角瓶中的菌液0.5mL，采用10倍稀釋法，稀釋到10-4-10-6。（2）平皿涂布：分取3個(gè)稀釋度的菌液各0.1mL加入BP固體培養(yǎng)基平皿中，用無(wú)菌涂棒將菌液涂勻。每個(gè)稀釋度涂布2個(gè)平皿。將平皿置于370C培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)過(guò)夜。（3）細(xì)菌統(tǒng)計(jì)：對(duì)培養(yǎng)后的平皿進(jìn)行活菌統(tǒng)計(jì)，依照附錄IV中的統(tǒng)計(jì)原則進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，算出原菌液中的菌密度。3.自發(fā)突變?nèi)∪瞧恐?.1mL菌液加入到含有青霉素的BP固體培養(yǎng)基平皿中，涂布3個(gè)平皿。依照步驟2）進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。1）誘變處理由于紫外誘變引起的DNA變化有光復(fù)活作用，因而在誘變實(shí)驗(yàn)中最好在紅光下進(jìn)行操作，操作后將涂布好的平皿用報(bào)紙包好后置于370C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，操作過(guò)程如下：（1）分別吸取三角瓶中菌液3mL于4個(gè)無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)。將培養(yǎng)皿放在10-15W的紫外燈下：距離30cm左右。（2）在誘變前先打開(kāi)紫外燈穩(wěn)定15-30min（使紫外燈輸出功率穩(wěn)定后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使致死曲線更準(zhǔn)確），將待處理的4培養(yǎng)皿連蓋放在紫外燈下滅菌1min，將4個(gè)培養(yǎng)皿開(kāi)蓋后進(jìn)行紫外照射，分別在15s、30s、1min和2min的時(shí)候?qū)⑴囵B(yǎng)皿的蓋子蓋上，然后關(guān)上紫外燈（如果有條件，應(yīng)將平皿放在磁力攪拌器上，在照射過(guò)程中對(duì)菌液進(jìn)行攪拌，使菌液均勻便于紫外線的作用）。（3）分別對(duì)照射5s、30s、1min和2min的4個(gè)培養(yǎng)皿做菌液稀釋計(jì)數(shù)。分別稀釋到10-4、10-3、10-2和10-1進(jìn)行2個(gè)稀釋度的涂布，每個(gè)涂布2個(gè)培養(yǎng)皿，進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)，結(jié)合步驟2進(jìn)行致死曲線繪制（如果有條件，應(yīng)該做“33”計(jì)數(shù)，應(yīng)做3個(gè)稀釋度3個(gè)重復(fù)樣的計(jì)數(shù)）。（4）將照射后的4個(gè)培養(yǎng)皿中的菌液0.1mL分別加入到含有青霉素的BP固體培養(yǎng)基平皿中，涂布3個(gè)平皿。依照步驟2）進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。2）光復(fù)活實(shí)驗(yàn)操作基本同于步驟4）誘