基因工程技術(shù)演示

基因工程技術(shù)演示第1頁/共15頁1、反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)

2、反向PCR3、復(fù)合PCR

4、不對稱PCR

5、嵌套PCR6、實(shí)時定量PCRPCR的技術(shù)類型第2頁/共15頁P(yáng)CR技術(shù)的基本原理類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先待擴(kuò)增DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下的這種循環(huán)的不斷重復(fù)。第3頁/共15頁P(yáng)CR的操作步驟①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93-95℃左右一定時間后,使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結(jié)合,為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后,溫度降至55℃左右,引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合；③引物的延伸：DNA模板-引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈。注:每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍第4頁/共15頁P(yáng)CR的反應(yīng)體系1、緩沖溶液Mg2+是DNA聚合酶的激活劑2、耐熱DNA聚合酶3、脫氧核糖三磷酸核苷酸(dNTPs)4、模板DNA5、上游引物、下游引物第5頁/共15頁（1）、PCR反應(yīng)緩沖液①M(fèi)g2+是DNA聚合酶的激活劑。②1.5mmol/L-2.5mmol/L反應(yīng)體系。③Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降；Mg2+過高影響反應(yīng)特異性。④Mg2+可與負(fù)離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、⑤EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度。第6頁/共15頁（2）Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)

0.5-5U/100L

酶量增加使反應(yīng)特異性下降;酶量過少影響反應(yīng)產(chǎn)量。（3）dNTP

①dNTP濃度取決于擴(kuò)增片段的長度②四種dNTP濃度應(yīng)相等,一般為50-200mol/L③濃度過高易產(chǎn)生錯誤堿基的摻入，濃度過低則降低反應(yīng)產(chǎn)量④dNTP可與Mg2+結(jié)合，使游離的Mg2+濃度下降，影響DNA聚合酶的活性。第7頁/共15頁（4）模板

①單、雙鏈DNA均可。②不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類。③一般100ngDNA模板/100L。④模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。（5）引物濃度

0.1-1mol/L

濃度過高易導(dǎo)致模板與引物錯配,反應(yīng)特異性下降。第8頁/共15頁P(yáng)CR引物的設(shè)計(jì)原則①引物長度一般以15～30bp為宜,過短則降低特異性，過長則會引起引物間退火而影響有效擴(kuò)增。②避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)，避免序列內(nèi)有較長的回文結(jié)構(gòu)，使引物自身不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。③G/C和A/T堿基均勻分布，G/C含量在45～55%之間，引物堿基序列盡可能選擇堿基隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤或嘧啶連續(xù)排列。④要避免兩個引物間特別是3′末端堿基序列互補(bǔ)以及同一引物自身3′末端堿基序列互補(bǔ)的，使它們不能形成引物二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)。⑤引物3′末端堿基一般應(yīng)與模板DNA嚴(yán)格配對，并且3′末端為G、C或T時引發(fā)效率較高。⑥引物5`末端堿基可不與模板DNA匹配，可添加與模板無關(guān)的序列(如限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列、ATG起始密碼子或啟動子序列等)，便于克隆和表達(dá)，但其保護(hù)堿基有一定的要求。⑦引物的堿基順序不能與非擴(kuò)增區(qū)有同源性。第9頁/共15頁P(yáng)CR循環(huán)的一般參數(shù)（1）變性使雙鏈DNA解鏈為單鏈,95℃3～5分鐘

(2)退火

溫度由引物長度和GC含量決定,適宜的退火溫度大約低于引物Tm值45-55℃

，介于45-55℃

。增加溫度能減少引物與模板的非特異性結(jié)合;降低溫度可增加反應(yīng)的靈敏性。（3）延伸

72℃，延伸時間由擴(kuò)增片段長度決定（4）循環(huán)次數(shù)

主要取決于模版DNA的濃度一般為25-35次次數(shù)過多：擴(kuò)增效率降低錯誤摻入率增加第10頁/共15頁標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件10×緩沖液10μL4種dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA

0.1～2μgTaqDNA聚合酶2.5UMg2+

1.5mmol/L第11頁/共15頁P(yáng)CR反應(yīng)的注意事項(xiàng)（一）防止污染試劑小量分裝吸頭及EP管一次性使用器皿及工作區(qū)域要分開，無菌操作（二）設(shè)立對照陽性對照：陽性模板陰性對照：陰性模板試劑對照：除模板外的所有組分第12頁/共15頁P(yáng)CR反應(yīng)的特點(diǎn)靈敏度高皮克(pg=10-12)量級擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個RFU細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌簡便、快速一次性加好反應(yīng)液，2～4h完成擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA第13頁/共15頁P(yáng)CR技術(shù)的應(yīng)用1.基礎(chǔ)研究⑴基因或cDNA克?。簭幕驍?shù)據(jù)庫中獲得某一基因或cDNA核苷酸序列,用PCR方法擴(kuò)增并克隆該基因或cDNA。⑵基因表達(dá)：用RT-PCR檢測某一特定基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。2.醫(yī)學(xué)⑴感染性疾病病原體的診斷：HIV、結(jié)核桿菌、乙肝病毒等。⑵遺傳病相關(guān)基因檢測：鐮刀型細(xì)胞貧血、血友病