基因工程的基本操作程序教學

基因工程的基本操作程序教學第1頁/共50頁抗蟲棉的培育的過程：第2頁/共50頁基因工程的基本操作程序（1）目的基因的獲?。?）（3）將目的基因導入受體細胞（4）目的基因的檢測與鑒定基因表達載體的構建第3頁/共50頁一、目的基因的獲取1.目的基因：2.獲取方法：（1）從基因文庫中獲取目的基因；（2）利用PCR技術擴增目的基因；（3）通過DNA合成儀用化學方法直接合成主要指的是編碼蛋白質的結構基因第4頁/共50頁補：原核細胞的基因結構編碼區(qū)下游非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游啟動子終止子補：真核細胞的基因結構內含子外顯子編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游RNA聚合酶的始結合位點RNA聚合酶的末結合位點第5頁/共50頁結構基因外顯子內含子轉錄、加工修飾mRNA能夠編碼蛋白質的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質的序列叫做內含子內含子：外顯子：第6頁/共50頁（一）從基因文庫中獲取目的基因（序列未知）1.基因文庫

基因文庫

基因組文庫部分基因文庫（cDNA文庫）基因文庫中不是直接保管相應基因，而是保存受體菌，菌中含基因。將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導入到受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。第7頁/共50頁基因組文庫的構建模式圖第8頁/共50頁部分基因文庫的構建模式圖第9頁/共50頁基因組文庫和部分基因文庫的比較文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內含子基因多少物種間基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以第10頁/共50頁解旋酶催化1)解旋模板2)合成互補子鏈

以母鏈為模板進行堿基配對(在DNA聚合酶的催化下,利用游離的脫氧核苷酸進行)母鏈（舊鏈）子鏈（新鏈）子代DNA:同時進行(邊解旋邊復制)組成3)形成新的DNA分子補：DNA復制過程：作用：把單個脫氧核苷酸連接成鏈(形成磷酸二酯鍵)第11頁/共50頁2.利用PCR技術擴增目的基因1概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復制___________的核酸合成技術。2原理：DNA復制原料：模板DNA；DNA引物；四種脫氧核苷酸；熱穩(wěn)定DNA聚合酶多聚酶鏈式反應體外特定DNA片段3前提：已知目的基因的一段核苷酸序列第12頁/共50頁PCR技術的操作過程a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成________b、退火（復性55℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈d.重復a.b.c步驟：每重復一次，目的基因增加___倍一第13頁/共50頁PCR技術的操作過程第14頁/共50頁PCR技術的操作過程PCR反應體系中目的基因成指數(shù)(2n)形式擴增第15頁/共50頁PCR技術擴增與DNA復制的比較DNA復制PCR技術場所原理條件解旋方式酶特點結果堿基互補配對原則堿基互補配對原則四種脫氧核苷酸、模板、酶、ATP四種脫氧核苷酸、模板、酶、引物DNA在高溫下變性解旋解旋酶催化解旋半保留復制、邊解旋邊復制半保留復制、全解旋再復制體外復制主要在細胞核內大量的DNA片段形成整個DNA分子熱穩(wěn)定的DNA聚合酶細胞內的DNA聚合酶、解旋酶等第16頁/共50頁

過程：變性、退火、延伸三步曲變性：90～95℃退火：55～60℃延伸：70～75℃第17頁/共50頁3.人工合成法利用DNA合成儀人工合成的前提：基因較小，核苷酸序列已知蛋白質的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列基因的核苷酸序列目的基因化學合成推測推測思考：化學法合成的目的基因含內含子、啟動子和終止子嗎？第18頁/共50頁課堂小結1、從基因文庫中獲取2、利用PCR技術擴增3、人工合成種類基因組文庫：含有一種生物的全部基因部分基因文庫：只包含了一種生物的部分基因，如：cDNA文庫歸納：獲取目的基因的方法第19頁/共50頁思考：為什么要構建基因表達載體？（1）使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在并可以遺傳給下一代；（2）使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。二、構建表達載體第20頁/共50頁思考：作為基因工程表達載體，只需含有目的基因就可以完成任務嗎？

不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他控制元件，如啟動子、終止子和標記基因等。

第21頁/共50頁2.基因表達載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標記基因第22頁/共50頁啟動子：終止子：標記基因：位于基因首端的一段特殊的DNA片段，它是RNA聚合酶識別和結合的部位，有了它才能驅動基因轉錄出mRNA。位于基因尾端的一段特殊的DNA片段，能終止mRNA的轉錄。鑒別受體細胞中是否含有目的基因，從而將有目的基因的細胞篩選出來。第23頁/共50頁相同點：不同點：思考：載體與表達載體的異同都有標記基因和復制原點。表達載體在載體基礎上增加了目的基因、啟動子、終止子三部分結構。第24頁/共50頁基因表達載體的構建過程質粒DNA分子限制酶切割兩個切口獲得目的基因DNA連接酶連接重組DNA分子（重組質粒）同一種一個切口兩個黏性末端用同一種限制酶分別切割目的基因個質粒，使之露出相同的粘性末端，并用DNA連接酶使之連接第25頁/共50頁三、將目的基因導入受體細胞（一）轉化：目的基因進入_________內，并且在受體細胞內維持_____和_____的過程受體細胞穩(wěn)定表達（二）方法將目的基因導入植物細胞將目的基因導入動物細胞將目的基因導入微生物細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞第26頁/共50頁1.將目的基因導入植物細胞農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法第27頁/共50頁（1）農(nóng)桿菌轉化法①特點：

Ti質粒上的T-DNA可以轉移到受體細胞，并整合到受體細胞染色體的DNA上。易感染雙子葉植物和裸子植物，對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。第28頁/共50頁②轉化過程:Ti質粒目的基因構建表達載體導入植物細胞插入植物細胞染色DNA表達新性狀轉入農(nóng)桿菌第29頁/共50頁基因槍法又稱微彈轟擊法，是利用壓縮氣體產(chǎn)生的動力，將包裹在金屬顆粒表面的表達載體DNA打入受體細胞中，使目的基因與其整合并表達的方法。（2）基因槍法適用于單子葉植物第30頁/共50頁（3）花粉通道法植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃谥参锸芊酆?，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道進入受體細胞。適用于被子植物第31頁/共50頁2.將目的基因導入動物細胞（1）方法：顯微注射法（將基因表達載體提純，用顯微儀注射到受精卵中）思考：為什么要用受精卵而不用體細胞？第32頁/共50頁（2）操作程序:提純含目的基因表達載體取受精卵顯微注射移植到輸卵管或子宮受精卵發(fā)育新性狀動物第33頁/共50頁常用法：常用菌：微生物作受體細胞原因：過程：Ca2+處理大腸桿菌感受態(tài)細胞表達載體與感受態(tài)細胞混合感受態(tài)細胞吸收DNA3.將目的基因導入微生物細胞Ca2+處理大腸桿菌繁殖快、多為單細胞、遺傳物質相對少第34頁/共50頁受體生物植物動物微生物受體細胞導入方法受精卵體細胞受精卵細胞/個體農(nóng)桿菌轉化法基因槍法花粉管通道法顯微注射技術用Ca2+處理成感受態(tài)細胞小結：將目的基因導入受體細胞第35頁/共50頁四、目的基因的檢測與鑒定導入過程完成后，全部受體細胞都能攝入重組DNA分子嗎？1真正能攝入重組DNA分子的受體細胞很少。2目的基因進入受體細胞后，是否都能穩(wěn)定維持和表達？不一定，需要檢測第36頁/共50頁四、目的基因的檢測與鑒定檢測:是否插入目的基因是否轉錄是否翻譯鑒定:分子水平鑒定個體生物學水平鑒定第37頁/共50頁轉基因生物的DNA探針15N15N14N14N（1）檢測是否插入了目的基因基因探針：放射性同位素等標記的DNA分子方法——DNA分子雜交技術（DNA與DNA）變性變性1、檢測——分子水平的檢測第38頁/共50頁變性方法——DNA與mRNA雜交技術（2）檢測目的基因是否轉錄出了mRNA探針15N15N轉基因生物的mRNA14N14N1、檢測——分子水平的檢測第39頁/共50頁1、檢測——分子水平的檢測提?。?）檢測目的基因是否翻譯成蛋白質方法——抗原-抗體雜交蘇云金桿菌Bt毒素蛋白將Bt毒蛋白注射小鼠體內從小鼠血管抽出血液分離出抗Bt毒素的抗體抗體蛋白質

出現(xiàn)雜交帶脫分化組織培養(yǎng)第40頁/共50頁（二）鑒定（個體生物學水平）抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等第41頁/共50頁類型步驟檢測內容方法結果顯示分子檢測第一步目的基因是否進入受體細胞DNA分子雜交（DNA和DNA之間）是否成功顯示出雜交帶第二步目的基因是否轉錄出mRNA分子雜交技術（DNA和mRNA之間）是否成功顯示出雜交帶第三步目的基因是否翻譯出蛋白質抗原—抗體雜交是否成功顯示出雜交帶個體水平鑒定包括抗蟲、抗病的接種實驗，以確定是否有抗性以及抗性的程度；基因工程產(chǎn)品與天然產(chǎn)品的活性比較，以確定功能是否相同等。目的基因的表達和檢測第42頁/共50頁歸納:基因工程的基本操作程序獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學方法人工合成構建基因表達載體目的基因、啟動子、終止子、標記基因將目的基因導入受體細胞感受細胞法（微生物）、農(nóng)桿菌轉化法（植物）、顯微注射法（動物）目的基因的檢測與鑒定檢測：是否插入、轉錄、翻譯；個體第43頁/共50頁課堂練習1、有關基因工程的敘述中，錯誤的是()A、DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來

B、限制性內切酶用于目的基因的獲得

C、目的基因須由運載體導入受體細胞

D、人工合成目的基因不用限制性內切酶A第44頁/共50頁課堂練習2、下列屬于獲取目的基因的方法的是()①利用mRNA反轉錄形成②從基因組文庫中提?、蹚氖荏w細胞中提?、芾肞CR技術⑤利用DNA轉錄 ⑥人工合成

A.①②③⑤B.①②⑤⑥C.①②③④D.①②④⑥D第45頁/共50頁課堂練習3、有關基因工程的敘述正確的是（）

A、限制