天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)

天津大學(xué)生物化學(xué)核酸化學(xué)第1頁/共111頁第五章核酸化學(xué)第一節(jié)核酸的概述

第二節(jié)核苷酸

第三節(jié)核酸的結(jié)構(gòu)

第四節(jié)核酸的提取、分離和測(cè)定

第五節(jié)核酸的變性、復(fù)性與雜交

第2頁/共111頁第一節(jié)核酸的概述1．染色體和基因2．核酸第3頁/共111頁第一節(jié)核酸的概述（染色體和基因1）在生物細(xì)胞核中存在著一種能被堿性染料著色的螺旋集縮體，它是由核酸、組蛋白、非組蛋白等組成，稱此物質(zhì)為染色體。經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為，染色體和基因（遺傳因子）間有平行現(xiàn)象，基因存在于染色體上，基因在遺傳中具有完整性，隨染色體的分裂、配對(duì)而進(jìn)行獨(dú)立的分配。第4頁/共111頁第一節(jié)核酸的概述（染色體和基因2）第5頁/共111頁第一節(jié)核酸的概述（染色體和基因3）復(fù)制分開第6頁/共111頁第一節(jié)核酸的概述（1核酸的發(fā)現(xiàn)）1868年，從外科繃帶上的膿細(xì)胞的細(xì)胞核中分離得到一種含磷較高的酸性物質(zhì)，稱之為核素。（nuclein）核素實(shí)質(zhì)是一種核糖核蛋白。瑞士科學(xué)家F.Miescher第7頁/共111頁1889年，Altmann首先制備了不含蛋白的核酸制品，并引入“核酸”這一名詞。20世紀(jì)20年代測(cè)定了核酸的化學(xué)組成，并將核酸分為DNA和RNA。1943年，E.Chargaff的工作：嘌呤：嘧啶=1：1，由此推理出堿基配對(duì)的理論。1944年，Avery的肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，證明遺傳物質(zhì)即為DNA。1953年，Watson-Crick建立了DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。遺傳密碼的闡明、核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)、核酸的合成與分析技術(shù)、基因重組技術(shù)等的建立形成了分子生物學(xué)的基本完整體系。第一節(jié)核酸的概述（2核酸的研究史）第8頁/共111頁第一節(jié)核酸的概述（核酸的種類）核糖核酸（ribonucleicacid-RNA）

轉(zhuǎn)移RNA(transferRNA-tRNA)

信使RNA(messengerRNA-mRNA)

核糖體RNA（ribosomalRNA-rRNA）脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid-DNA）第9頁/共111頁第一節(jié)核酸的概述（核酸的分布）真核生物原核生物

DNA細(xì)胞核（95%）線粒體、葉綠體（5%）核質(zhì)區(qū)（擬核）

RNA細(xì)胞質(zhì)（75%）線粒體、葉綠體（15%）細(xì)胞核（10%）細(xì)胞質(zhì)第10頁/共111頁第一節(jié)核酸的概述（核酸的功能）DNA功能：遺傳信息的載體，負(fù)責(zé)遺傳信息的貯存和發(fā)布。RNA功能：三者共同參與遺傳信息的表達(dá)。

第11頁/共111頁第一節(jié)核酸的概述（核酸的組成）核酸核苷酸磷酸核苷戊糖堿基水解核蛋白蛋白質(zhì)這樣看核酸是一種高聚核苷酸，它的基本結(jié)構(gòu)單位是核苷酸。第12頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(總）1．核糖2．堿基3．核苷4．核苷酸5．多磷核苷酸（ATP）核苷核酸核苷酸堿基許多個(gè)戊糖磷酸第13頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(1戊糖）組成核酸的戊糖有兩種

組成DNA

組成RNA第14頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(2堿基1）核酸中的堿基分兩類：（1）嘧啶堿：胞嘧啶（C）尿嘧啶（U）胸腺嘧啶（T）（2）嘌呤堿：腺嘌呤（A）鳥嘌呤（G）第15頁/共111頁尿嘧啶U胸腺嘧啶T胞嘧啶CDNA特有RNA特有

嘧啶環(huán)第二節(jié)核苷酸(2堿基2[嘧啶1]）第16頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(2堿基2[嘧啶2]）NNHNH2O

胞嘧啶Cytosine(C)NHNHOO

尿嘧啶Uracil(U)NHNHOO胸腺嘧啶Thymine(T)注意與書上圖畫法的區(qū)別第17頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(2堿基3[嘌呤1]）鳥嘌呤G腺嘌呤A

嘌呤環(huán)第18頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(2堿基3[嘌呤2]）NNNHNNH2腺嘌呤Adenine(A)NHNNHNONH2鳥嘌呤Guanine(G)注意與書上圖畫法的區(qū)別第19頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(3核苷1）核苷是一種糖苷，由戌糖和堿基縮合而成糖與堿基之間以糖苷鍵相連接。糖的第一位上的碳原子（C1）與嘧啶堿的第一位上的氮原子（N1）或嘌呤堿的第九位上的氮原子（N9）相連，所以糖與堿基間的連鍵是N-C鍵，一般稱之為N-糖苷鍵。蛋白質(zhì)與糖連接時(shí)，天冬酰氨的氨基與半羧醛羥基間形成的為N-糖苷鍵第20頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(3核苷2）糖與堿基之間以C-N糖苷鍵連接第21頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(4核苷酸1）核苷中的戌糖羥基被磷酸酯化，就形成核苷酸作為DNA或RNA結(jié)構(gòu)單元的核苷酸分別是5′-磷酸-脫氧核糖核苷和5′-磷酸-核糖核苷第22頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(4核苷酸2）磷酸堿基戊糖第23頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(4核苷酸3）H2O堿基磷酸戊糖糖苷鍵脂鍵第24頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(4核苷酸4）M-單(D-二；T－三）；P-磷酸RNA的名稱為某（單、二、三）苷酸，DNA在某（單、二、三）前加脫氧兩字。如AMP稱腺苷—磷酸(或腺苷酸），dAMP稱為脫氧腺苷—磷酸（脫氧腺苷酸）。八種核苷酸如下表所示第25頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(5多磷核苷酸1）參與核酸生物合成的直接原料不是一磷酸核苷酸，而是三磷酸核苷酸，如ATP（三磷酸腺苷酸）。ATP上的磷酸殘基用α、β、γ來編號(hào)。ATP含有兩個(gè)高能磷酸酯鍵（～P），其水解時(shí)釋放出的能量為7.3千卡/克分子（普通磷酸酯鍵為2千卡/克分子）。ATP在細(xì)胞能量代謝中起著及其重要的作用。第26頁/共111頁第二節(jié)核苷酸(5多磷核苷酸2）(腺嘌呤核糖核苷三磷酸)O-POO-NNNNNH2OHHOHHOHHOCH2O-POO-O-POO-三磷酸腺苷(ATP)～～αβγ第27頁/共111頁第三節(jié)核酸的結(jié)構(gòu)一、DNA的結(jié)構(gòu)

二、RNA的結(jié)構(gòu)

第28頁/共111頁一、DNA的結(jié)構(gòu)1(總）（一）DNA的的堿基組成

（二）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)

（三）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)

（四）DNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)

第29頁/共111頁（一）DNA的堿基組成堿基組成的規(guī)律：1．A=T，G=CA+G=C+T2．沒有組織和器官的特異性3．具有種的特異性4．年齡、營養(yǎng)狀態(tài)和環(huán)境的改變不影響DNA的堿基組成第30頁/共111頁（二）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)1各核苷酸殘基沿多核苷酸鏈排列的順序叫核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)。連接鍵：3，5一磷酸二酯鍵連接起來的直線形或環(huán)形分子。DNA沒有側(cè)鏈。第31頁/共111頁脫H2O脂鍵相連3`，5`-磷酸二酯鍵首尾3`5`5｀3｀連接鍵第32頁/共111頁（二）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)3(線條縮寫)DNA線條縮寫:戊糖5`-磷酸PA核苷酸5`3`首端末端PPPPPPAGCTGCOH3`-OH

核苷酸順序又稱堿基順序，是蛋白質(zhì)與核酸結(jié)構(gòu)的生物語言。鹼基第33頁/共111頁（二）DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)4(字母簡(jiǎn)寫)DNA字母簡(jiǎn)寫:

5`

…

APGPCPTPGPCP…3`

或

5`

…

AGCTGC…3`第34頁/共111頁（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1(總)1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的要點(diǎn)

2．雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素3．DNA雙螺旋的不同類型第35頁/共111頁（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)2公認(rèn)的為1953年watson和crick提出的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型第36頁/共111頁（二）DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)3此模型的建立主要基于兩方面的根據(jù)（1）堿基組成A=T，C=G，并證明A與T之間可生成兩個(gè)氫鍵，而C與G之間三個(gè)氫鍵。（2）X衍射結(jié)構(gòu)分析：不同來源的DNA纖維具有相似的X光衍射圖譜。第37頁/共111頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)1（1）（1）DNA分子是由兩條方向相反的平行的多核苷酸鏈構(gòu)成。即p5’-糖3‘-p的結(jié)構(gòu)與p3’-糖5‘-p的結(jié)構(gòu)相對(duì);兩條鏈的糖－磷酸主鏈都是右手螺旋，有一共同的螺旋軸。第38頁/共111頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)1（2）螺旋表面有一條大溝和一條小溝大溝小溝第39頁/共111頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)2（1）（2）兩條鏈由堿基間的氫鍵相連，堿基對(duì)與螺旋軸垂直,與糖環(huán)平面垂直;堿基在糖環(huán)的內(nèi)側(cè)，磷酸基在糖環(huán)的外側(cè)；相鄰堿基對(duì)平面間的距離是0.34nm，相鄰核苷酸彼此相差360，雙螺旋的每轉(zhuǎn)有10對(duì)核苷酸，每轉(zhuǎn)高3.4nm。第40頁/共111頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)3（3）堿基成對(duì)有一定的規(guī)律：

A-T，C-G或T-A，G-CA與T之間為二個(gè)氫鍵，C與G之間為三個(gè)氫鍵雙螺旋DNA分子整個(gè)長(zhǎng)度的直徑相同，為2nm第41頁/共111頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)3雙螺旋DNA分子整個(gè)長(zhǎng)度的直徑相同，為2nm第42頁/共111頁1．DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)4（4）一個(gè)鏈的堿基順序確定后，則另一條鏈必有相對(duì)應(yīng)的堿基順序。堿基互補(bǔ)原則具有極重要意義，DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、反轉(zhuǎn)錄等過程的分子基礎(chǔ)都是堿基互補(bǔ)配對(duì)。第43頁/共111頁2．雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素1（1）氫鍵（2）離子鍵及范德華力（3）堿基堆積力第44頁/共111頁2．雙螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定因素2（1）氫鍵：兩條鏈間堿基的相互作用，A與T之間為二條氫鍵，C與G之間為三條氫鍵。氫鍵作用力很弱，但DNA分子中存在大量氫鍵，因此氫鍵為一重要穩(wěn)定因素。（2）離子鍵及范德華力：DNA分子中磷酸基因在生理?xiàng)l件下解離，使DNA成為一種多陰離子，這有利于它與帶正電荷的其它陽離子基團(tuán)發(fā)生靜電作用，這樣減少雙鏈間的靜電排斥，有利于雙螺旋的穩(wěn)定。（3）堿基堆積力：目前普遍認(rèn)為堆積堿基間的疏水作用是穩(wěn)定DNA結(jié)構(gòu)的更重要的因素。大量堿基層層堆積，兩相鄰堿基的平面十分貼近，于是使雙螺旋結(jié)構(gòu)內(nèi)部形成一個(gè)強(qiáng)大的疏水區(qū)，與介質(zhì)中的小分子隔開，有利于互補(bǔ)堿基之間氫鍵的形成。第45頁/共111頁3．DNA雙螺旋的不同類型1B型DNA（B－DNA）:在相對(duì)濕度為92%時(shí),所得到的DNA鈉鹽纖維。A型DNA（A－DNA）:在相對(duì)溫度低于75%時(shí)，獲得的DNA鈉鹽纖維。此外還有Z－DNA等。第46頁/共111頁3．DNA雙螺旋的不同類型2第47頁/共111頁（四）DNA的三結(jié)構(gòu)

當(dāng)研究某些小病毒、線粒體、葉綠體及某些細(xì)菌中分離出來降解的DNA時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們的雙螺旋二級(jí)結(jié)構(gòu)還可進(jìn)一步緊縮成閉鏈環(huán)狀或開鏈環(huán)狀以及麻花狀等，這是DNA形成的三級(jí)結(jié)構(gòu)。松弛形解鏈環(huán)形負(fù)超螺旋第48頁/共111頁二、RNA的分子結(jié)構(gòu)1（一）RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)（二）RNA的堿基組成（三）RNA的類型（四）RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)第49頁/共111頁（一）RNA一級(jí)結(jié)構(gòu)由幾十個(gè)至幾千個(gè)AMP，GMP，CMP和UMP四種核苷酸借磷酸二酯鍵相連的多核苷酸鏈，其中不含側(cè)鏈。第50頁/共111頁（二）RNA的堿基組成含腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、和尿嘧啶四種堿基，尚含有多種“稀有堿基”和特殊形式的核苷。其中以各種甲基化的堿基和“假尿嘧啶核苷”尤為豐富。假尿苷這些不尋常的成分可能與tRNA的生物學(xué)功能有一定的關(guān)系第51頁/共111頁（三）RNA的類型（rRNA1）含量：75-80%存在：與蛋白質(zhì)結(jié)合成核蛋白的形式，存在于細(xì)胞質(zhì)的核蛋白體中。功能：以核蛋白體的形式在蛋白質(zhì)生物合成中提供合適的工作場(chǎng)所。分子量:它的分子量都比較大，大腸桿菌核糖體中有三類rRNA（它們的沉降系數(shù)分別為5S、16S、23S）；動(dòng)物細(xì)胞核糖體rRNA有四類（5S、5.8S、18S和28S）。第52頁/共111頁（三）RNA的類型（rRNA2）大腸桿菌5SRNA的結(jié)構(gòu)第53頁/共111頁（三）RNA的類型（tRNA）含量：約占10－15%存在：tRNA溶于“胞液”部分中，它們以自由狀態(tài)或以氨基酸結(jié)合狀態(tài)而存在。分子量：都較小。功能：蛋白質(zhì)的生物合成中起選擇性運(yùn)輸原料（氨基酸）的作用，因此把tRNA叫受體RNA。第54頁/共111頁（三）RNA的類型（mRNA1）含量:占總RNA的5%存在：在細(xì)胞核中以DNA為模板被合成以后，可能暫存于核仁內(nèi)，也可能立即轉(zhuǎn)移到胞質(zhì)中，并以每分子mRNA與幾個(gè)或幾十個(gè)核蛋白體結(jié)合成串珠樣的多核蛋白體形式而存在。特點(diǎn)：一般都很不穩(wěn)定，代謝活躍，更新迅速，壽命較短，種類很多。功能:在蛋白質(zhì)生物合成中起傳遞遺傳信息的作用，故也叫信息RNA（iRNA）。第55頁/共111頁（三）RNA的類型（mRNA2）真核單順反子5’-末端有“帽子”3’-末端有polyA片段原核多順反子5’-末端無“帽子”3’-末端無polyA片段順反子：mRNA上具有翻譯功能的核苷酸順序。polyA片段：指10-200個(gè)多聚腺苷酸，這與mRNA順利通過核膜進(jìn)入胞漿有關(guān)，也與mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到核糖體的過程有關(guān)，也有人認(rèn)為與病毒侵染性有關(guān)。

“帽子”結(jié)構(gòu)：5’-末端的G被甲基化，通過焦磷酸與另一個(gè)發(fā)生了核糖上甲基化的核苷酸以5’、5’-磷酸二酯鍵相連,此結(jié)構(gòu)對(duì)mRNA的翻譯活性是重要的。

第56頁/共111頁（三）RNA的類型（mRNA3）第57頁/共111頁（四）RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)1(總)（1）由四臂四環(huán)組成（2）葉柄是氨基酸臂（3）有反密碼環(huán)（4）左臂連接（D環(huán)）（5）右側(cè)有一個(gè)TφC環(huán)（6）含有修飾堿基tRNA的三葉草型結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（總）D環(huán)反密碼環(huán)TφC環(huán)可變環(huán)第58頁/共111頁（四）RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)2(1)（1）tRNA一般由四臂四環(huán)組成。分子由A-U、G-C堿基對(duì)構(gòu)成的雙螺旋區(qū)叫做臂；不能配對(duì)部分叫環(huán)。葉子臂123第59頁/共111頁（四）RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)2(2)（2）三葉草的葉柄叫做氨基酸臂，它包括3，端接受氨基酸的部位—CpCpAOH載運(yùn)氨基酸第60頁/共111頁（四）RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)2(3)（3）位于氨基酸臂對(duì)面的反密碼環(huán)含有組成該tRNA反密碼子的三個(gè)核苷酸。反密碼子環(huán)

反密碼子第61頁/共111頁（四）RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)2(4)（4）左臂連接一個(gè)二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)），環(huán)上含有二氫尿嘧啶。D環(huán)第62頁/共111頁（四）RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)2(5)（5）右側(cè)有一個(gè)TΨC環(huán)（含有TΨC順序，φ代表假尿苷）和一個(gè)可變環(huán)，不同tRNA的可變環(huán)上核苷酸的數(shù)目變化較大。TΨC第63頁/共111頁（四）RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)2(5)（6）tRNA分子中含有修飾堿基，但多少不等。在某些位置上的核苷酸對(duì)于所有的tRNA都是同樣的，或變化很少叫做不變核苷酸。稀有堿基第64頁/共111頁（五）RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)1tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu):倒寫的L字母氨基酸的接受端3，-端-CCA反密碼子第65頁/共111頁（五）RNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)2tRNA的三級(jí)結(jié)構(gòu)2第66頁/共111頁第四節(jié)核酸的提取、分離和測(cè)定一、RNA的分離提取二、DNA的提取和分離

三、核酸含量的測(cè)定

第67頁/共111頁一、RNA的分離提取1目前最常用的為酚提取法：即用緩沖液飽和的酚溶液直接處理組織或細(xì)胞，以除去其中的蛋白質(zhì)和DNA若加入適量十二烷基硫酸鈉或其它去污劑可進(jìn)一步抑制核糖核酸酶，并使蛋白質(zhì)去除得更加干凈。將得到的RNA提取液用乙醇反復(fù)沉淀數(shù)次，溶解后進(jìn)行透析，再冷凍干燥。提取不同種類的RNA時(shí)，也可將各種亞細(xì)胞部分事先分開（因?yàn)椴煌N類的RNA存在于細(xì)胞中的不同部位），然后分別從核蛋白體中提取rRNA，從多核蛋白體中提取mRNA，從去除這些成分及其它顆粒后的細(xì)胞液中提取tRNA。第68頁/共111頁一、RNA的分離提取21．密度梯度離心法22．柱層析法3．凝膠電泳法第69頁/共111頁一、RNA的分離提取3(1)離心管中放30%--5%的蔗糖溶液。欲分離RNA溶液放在蔗糖溶液面上。經(jīng)高速離心數(shù)小時(shí)后，分子大小不同的RNA即分散于不同密度的蔗糖部位中。應(yīng)用啡啶溴紅—氯化銫密度梯度平衡超離心，可分開不同構(gòu)象的DNA、RNA和蛋白質(zhì)。1．密度梯度離心法15％蔗糖10％蔗糖20％蔗糖30％蔗糖第70頁/共111頁一、RNA的分離提取3(2)1．密度梯度離心法2石蠟油蛋白質(zhì)開環(huán)形及線性DNA閉環(huán)形質(zhì)粒DNARNA用垂直轉(zhuǎn)頭65000轉(zhuǎn)6h，，角轉(zhuǎn)頭45000轉(zhuǎn)36h，離心后，蛋白質(zhì)在最上面，RNA沉淀在底部，超螺旋DNA沉淀較快，開鏈或環(huán)形DNA沉淀較慢。此法分離的DNA純度較高，可供DNA重組等實(shí)驗(yàn)用。如需更純品，可再進(jìn)行一次氯化銫密度梯度離心。第71頁/共111頁一、RNA的分離提取42．柱層析法常用的支持體為二乙胺乙基（DEAE）纖維素（離子交換），葡聚糖凝膠等（凝膠過濾）因?yàn)楹怂岷秃塑账崾莾尚噪娊赓|(zhì)，在一定的pH值條件下各解離基團(tuán)的解離情況不同，即有與蛋白質(zhì)相似的等電點(diǎn)（南大P147）。第72頁/共111頁一、RNA的分離提取53．凝膠電泳法不同種類的RNA分子所帶電荷與其質(zhì)量之比都非常接近，故用一般電泳方法不易分開。若以某些凝膠為支持體進(jìn)行電泳，由于凝膠的分子篩作用可影響不同RNA的泳動(dòng)速度，則可得到較好的分離效果。第73頁/共111頁二、DNA的提取和分離0.14mol法:處理方法結(jié)果濃NaCl溶液（1-2M）提取組織中的核蛋白稀釋至0.14mol后DNA核蛋白的沉出RNA核蛋白則不沉出濃NaCl溶解DNA核蛋白氯仿或酚除去其中的蛋白質(zhì)乙醇沉淀提取溶液中的DNA

蔗糖密度梯度離心法分開各種DNACSCl或Cs2SO2濃溶液的密度梯度離心法分開單股和雙股DNA第74頁/共111頁三、核酸含量的測(cè)定1紫外吸收：嘌呤堿與嘧啶堿有共軛雙鍵，使堿基核苷、核苷酸和核酸在240－290nm紫外波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，最大吸收值在260nm附近。不同核苷酸有不同的吸收特性，所以可以用紫外分光光度計(jì)定量及定性測(cè)定。第75頁/共111頁三、核酸含量的測(cè)定2對(duì)待測(cè)樣品是否純品可用260nm與280nm的OD值，從OD260/280的比值即可判斷。純的DNA的比值應(yīng)為1.8，純RNA為2.0，如樣品中含雜蛋白，測(cè)量比值明顯下降。通常1OD值相當(dāng)于50μg/ml雙螺旋DNA或40μg/ml單螺旋DNA（或RNA）或20μg/ml寡核苷酸計(jì)算。不純的樣品可用瓊脂糖凝膠電泳分離出區(qū)帶后，經(jīng)啡啶溴紅染色可粗略估計(jì)其含量。第76頁/共111頁瓊脂糖凝膠電泳圖三、核酸含量的測(cè)定2第77頁/共111頁第五節(jié)核酸的變性、復(fù)性與雜交一、變性二、復(fù)性三、雜交四、核酸序列分析第78頁/共111頁一、變性1定義：指核酸雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，變成單鏈，它并不涉及共價(jià)鍵（磷酸二酯鍵）的斷裂。變性因素：熱變性、酸堿變性等。第79頁/共111頁一、變性2第80頁/共111頁一、變性3（Tm值1）通常把DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)失去一半時(shí)的溫度稱該DNA的溶點(diǎn)或溶解溫度，用Tm表示，DNA的Tm值一般在70－850C之間。變性的相對(duì)量溫度0C60801001.01.21.41.60TmTmTm100%Polyd(A-T)Polyd(G-C)DNA第81頁/共111頁一、變性3（Tm值2）Tm值的大小與下列因素有關(guān)：

（1）DNA的均一性（2）G-C含量（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度第82頁/共111頁一、變性3（Tm值3）影響Tm值大小的因素1（1）DNA的均一性：一般均一性越高，Tm值的變動(dòng)范圍越小。（2）G-C含量：G-C含量越高，Tm值越大，Tm與G-C含量成正比關(guān)系。因?yàn)镚-C比A-T更穩(wěn)定（氫鍵）。Tm與所含G-C的多少的關(guān)系，可用經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算不同DNA的Tm：

（G＋C）％＝(Tm－69.3)×2.44第83頁/共111頁一、變性3（Tm值4）Tm與所含G-C的多少有關(guān)影響Tm值大小的因素2第84頁/共111頁一、變性3（Tm值5）（3）介質(zhì)中的離子強(qiáng)度：一般離子強(qiáng)度較低，DNA的Tm值也較低，范圍也越窄。溫度0C70801001.21.41.5901.11.3A2600.010.020.050.20.10.51.0影響Tm值大小的因素3大腸桿菌DNA在不同KCl濃度下的Tm第85頁/共111頁二、復(fù)性1定義：變性DNA在適當(dāng)條件下，又可使兩條彼此分開的鏈重新締合成雙螺旋結(jié)構(gòu)。高溫變性緩慢冷卻熱復(fù)性第86頁/共111頁二、復(fù)性2DNA復(fù)性后，許多物化性質(zhì)又得到恢復(fù)，生物活性可以得到部分恢復(fù)。但將熱變性的DNA驟然冷卻，不能復(fù)性，只有緩慢冷卻時(shí)才可以復(fù)性。高溫變性緩慢冷卻熱復(fù)性急速冷卻復(fù)性失敗第87頁/共111頁二、復(fù)性3（影響因素）1．DNA濃度：濃度高時(shí)，兩條互補(bǔ)鏈彼此相碰的機(jī)會(huì)增加，易于復(fù)性。2．溫度：加熱變性的DNA，當(dāng)溫度超過Tm后，如迅速冷卻到低溫時(shí)不能復(fù)性，但當(dāng)溶液維持在Tm以下的較高溫度時(shí)，則可復(fù)性，一般比Tm低250C左右時(shí)最佳。3．DNA片段大小的影響：大的線狀單鏈，其擴(kuò)散速度受到妨礙，減少了互補(bǔ)鏈的碰撞機(jī)會(huì)。第88頁/共111頁三、核酸的雜交1概念：兩種來源不同，具有互補(bǔ)堿基序列的多核苷酸片段在溶液中冷卻時(shí)，可以再形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱為雜交作用。DNA和DNA雜交以及DNA和RNA雜交在核酸技術(shù)中占有十分重要的地位。第89頁/共111頁三、核酸的雜交2

（一）核酸研究的主要工具酶（二）核酸的雜交技術(shù)第90頁/共111頁（一）核酸研究的主要工具酶1．核糖核酸酶類（RNA酶類）2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶）3．非專一性核酸酶類第91頁/共111頁1．核糖核酸酶類（RNA酶類1）

（1）牛胰RNA酶（RNaseA或RNaseI）

（2）RNA酶T1（RNaseT1）第92頁/共111頁1．核糖核酸酶類（RNA酶類2）

專一作用RNA，而不作用于DNA;其分子量14,000，最適pH7.0-8.2，十分耐熱;具有高度的專一性，作用點(diǎn)為嘧啶核苷－3，—磷酸與其他核苷酸之間的連鍵，生成3，－嘧啶核苷或以3，－嘧啶核苷酸結(jié)尾的寡核苷酸（南大P152）。PPPPPPC(U)BGA(G)BCOHRNaseIRNaseI（1）牛胰RNA酶（RNaseA或RNaseI）：第93頁/共111頁1．核糖核酸酶類（RNA酶類3）

比RNaseI更具有專一性，其作用點(diǎn)為鳥嘌呤核苷－3，-磷酸與其他核苷酸之間的連鍵，產(chǎn)物為3，-鳥苷酸或以其結(jié)尾的寡核苷酸。其分子量較小，耐酸耐熱。PPPPPPC(U)BGA(G)BCOHRNaseIRNaseIRNaseT1（2）RNA酶T1（RNaseT1）第94頁/共111頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶1）（1）牛胰脫氧核糖核酸酶（DnaseI）（2）牛胰脫氧核糖核酸酶（DNaseII）（3）限制性內(nèi)切酶(限制酶)

第95頁/共111頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶2）（1）牛胰脫氧核糖核酸酶（DnaseI）：此酶無堿基專一性，它切斷雙鏈DNA或單鏈DNA成為以5，－磷酸為末端的寡核苷酸，平均長(zhǎng)度為四個(gè)核苷酸，需Mg2+，最適pH7-8。（2）牛脾脫氧核糖核酸酶（DNaseII）：也無堿基專一性，降解DNA成為以3，—磷酸為末端的寡聚核苷酸，平均長(zhǎng)度為六個(gè)核苷酸，最適pH4-5，需0.3mol/L的Na+激活。Mg2+可以抑制此酶的活性。第96頁/共111頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶3-1）是1979年，Arber、Smith和Nathams等人在細(xì)菌體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類對(duì)DNA具有極高堿基專一性的內(nèi)切酶。是DNA順序測(cè)定，基因分離和基因體外重組等研究中十分重要的工具酶。這類酶主要降解外源的未經(jīng)特殊修飾的DNA，但不降解自身細(xì)胞的DNA。一般識(shí)別順序包含4-6個(gè)堿基對(duì)。（3）限制性內(nèi)切酶(限制酶)第97頁/共111頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶3-2）

大多數(shù)限制性內(nèi)切酶的識(shí)別順序具有回文結(jié)構(gòu)（反向重復(fù)序列）。（3）限制性內(nèi)切酶(限制酶)2TTAGCACGTGCTAAAATCGTGCACGATT反向重復(fù)3，5，3，5，第98頁/共111頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶3-3）大多數(shù)酶切割后形成粘末端（3）限制性內(nèi)切酶(限制酶)3GAATTCCTTAAG3，5，3，5，EcoRIGAATTCCTTAAG3，5，3，5，+粘性末端粘性末端第99頁/共111頁2．脫氧核糖核酸酶類（DNA酶3-4）少數(shù)酶切割后形成平整末端（3）限制性內(nèi)切酶(限制酶)3GTPyPuACCAPuPyTG3，5，3，5，HindII平整末端GTPyPuACCAPuPyTG3，5，3，5，+第100頁/共111頁3．非專一性核酸酶類1（1）蛇毒磷酸二酯酶（2）牛脾磷酸二酯酶第101頁/共111頁3．非專一性核酸酶類2（1）

對(duì)RNA、DNA都有作用，是從核苷酸鏈的3，—羥基端開始，逐個(gè)切開5，－核苷酸與相鄰核苷酸之間的酯鍵，得到5，－核苷酸。（1）蛇毒磷酸二酯酶PPPH2OOHPPPOHOH+第102頁/共111頁3．非專一性核酸酶類2（2）

可作用RNA和DNA，是從5，-羥基端開始，逐個(gè)切開3，-核苷酸與相鄰核苷酸之間的酯鍵，得3，—核苷酸。PPPH2OOH+（2）牛脾磷酸二酯酶PPOHPPPOH第103頁/共111頁（二）核酸的雜交技術(shù)1意義：核酸雜交可以在液相或固相上進(jìn)行，是基因工程和分子生物學(xué)的重要技術(shù)之一。是鑒定陽性重組體、篩選基因、確定DNA