第十三章免疫細胞分離與功能檢及應用

第十三章免疫細胞分離

與免疫細胞功能檢測及應用

中南大學湘雅醫(yī)學院檢驗系臨床微生物學免疫學教研室李聞文2012，9

概述免疫細胞是指參與免疫應答或與免疫應答有關的細胞。主要包括淋巴細胞、單核-吞噬細胞、樹突狀細胞、各種粒細胞、紅細胞和肥大細胞等。

各種類型免疫缺陷癥、自身免疫病及腫瘤等可出現(xiàn)淋巴細胞或亞群的數(shù)量和功能的變化。檢測數(shù)目、比例和功能，可以判斷機體細胞免疫水平，對臨床認識疾病、探討其發(fā)病機制、觀察病情變化、判斷預后、考核療效和防治疾病等有重要意義。第一節(jié)免疫細胞分離

一、外周血單個核細胞分離外周血單個核細胞（peripheralbloodmononuclearcells，PBMC）主要指淋巴細胞和單核細胞。外周血細胞密度血小板1.030～1.035粒細胞1.092紅細胞1.093淋巴細胞和單核細胞1.075～1.090（一）聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-Hypaque）分層液法

（二）Percoll分層液法

Percoll是經(jīng)過聚乙烯吡咯烷酮（PVP）處理的硅膠顆粒混懸液。對細胞無毒性和刺激性，經(jīng)高速離心后形成從管口至管底一個連續(xù)的密度梯度。二、淋巴細胞的分離

從上面分離的淋巴細胞還含一定量的單核細胞（一）單核細胞去除法單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。分離淋巴細胞的方法有：

1.貼壁粘附法

2.羰基鐵粉吞噬法3.吸附柱過濾法(二)淋巴細胞亞群分離

淋巴細胞是復雜的不均一群體，根據(jù)表面標志又可分為多個亞群。1.E花環(huán)沉降法2.尼龍棉柱分離法3.親和板結(jié)合分離法4.熒光激活細胞分離儀分離法5.磁性微球分離法第二節(jié)淋巴細胞表面標志的檢測及亞群分類

淋巴細胞有不同功能亞群，根據(jù)形態(tài)不能區(qū)分，主要檢測表面標志，對T細胞、B細胞、NK細胞及其相關亞群的檢測，判斷機體的細胞免疫水平。通過簇分化抗原（CD）相應單克隆抗體。表面標志亞群是通過一個或幾個CD抗原定義出來的細胞亞群。

CD抗原特異性CD抗原特異性CD2E受體、全部T細胞和NK細胞CD3成熟T細胞CD4Th細胞、M?、HIV受體CD8Tc、Ts細胞、部分NK細胞CD25活化T細胞、IL-2受體CD28活化T細胞

一、T細胞表面標志及亞群

在機體細胞免疫反應中T細胞起主導作用，CD3是各亞群T細胞共有，不同T細胞有不同CD分子。1.輔助性T細胞Th1主要分泌IL-2、IFN-γ或TNF-β等細胞因子輔助細胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應，本身具有明顯的細胞毒作用；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6或IL-10等細胞因子輔助體液免疫，參與速發(fā)型超敏反應，本身無明顯細胞毒作用。方法：用PHA刺激熒光標記的細胞因子抗體進行胞內(nèi)染色，用流式細胞儀檢測。2.細胞毒性T細胞根據(jù)分泌細胞因子特性分為Tc1和Tc2。檢測方法同Th細胞，還可測表面標志CD3+CD8+CD30-為Tc1，CD3+CD8+CD30+為Tc2。3.調(diào)節(jié)性T細胞目前認為主要包括兩類,自然存在與誘導產(chǎn)生，典型標志是CD4+CD25+Foxp3+。

二、B細胞表面標志的檢測B細胞活化后轉(zhuǎn)變?yōu)闈{細胞，分泌抗體，執(zhí)行體液免疫功能。B細胞的mIG、Fc受體、補受體、EBV受體和小鼠紅細胞受體是B細胞的重要標志，以mIg為特有，是鑒定B細胞的可靠指標。CD分子有CD19，20，21，22，23，其中有些是共有，有些是活化B細胞特有?？捎脽晒?、免疫組化法或流式細胞儀進行檢測。

CD19為成熟B細胞表面標志，結(jié)合CD5分為B1（CD5+）和B2（CD5-）兩個亞群，其比較見表13-1：特點B1（CD9+CD5+）Ｂ2（CD9+CD5-）發(fā)生時間早晚分布（成年）腹腔、胸腔周圍免疫器官針對抗原多糖抗原蛋白質(zhì)抗原抗體產(chǎn)生細菌抗原及自身抗原廣譜抗原抗體種類IgM﹥﹥IgGIgG＞＞IgM更新情況自我更新不斷新生（骨髓）表13-1

B1與B2細胞的比較第三節(jié)抗原提呈細胞表面標志檢測

抗原提呈細胞（antigen-presentingcell,APC）是能攝取、加工、處理抗原的一類細胞。巨噬細胞、樹突狀細胞和B細胞為專職細胞，內(nèi)皮細胞、上皮細胞和激活的T細胞為非專職細胞。

一、單核-吞噬細胞系統(tǒng)單核-吞噬細胞系統(tǒng)（mononuclearphagocytesystem,MPS）包括骨髓內(nèi)的前單核細胞、外周血中的單核細胞和組織內(nèi)的巨噬細胞。巨噬細胞存在于全身各組織器官，不同部位其名稱不同。不同組織中的單核吞噬細胞

組織部位細胞名稱骨髓干細胞→單核母細胞→前單核細胞骨髓和血液單核細胞各種組織(巨噬細胞)組織細胞（結(jié)締組織）、枯否（Kupffer)細胞（肝）、破骨細胞（骨）、肺泡巨噬細胞（肺）、游走及固定巨噬細胞（淋巴結(jié)）、小膠質(zhì)細胞（神經(jīng)組織）、游走及固定巨噬細胞（脾）、固定巨噬細胞（骨髓）

二、樹突狀細胞

樹突狀細胞（dendriticcell,DC）是一大類專職抗原提呈細胞，主要有髓系和淋巴系兩種來源。其特點是數(shù)量少，樹突狀突起多，提呈抗原能力強。不同部位有不同名稱。不同部位的樹突狀細胞細胞名稱簡稱體內(nèi)分布濾泡樹突狀細胞FDC淋巴濾泡并指狀細胞IDC淋巴組織胸腺依賴區(qū)胸腺樹突狀細胞TDC胸腺朗罕細胞LC表皮粒層及基層，胃腸上皮層間質(zhì)性樹突狀細胞InterstitialDC實質(zhì)性器官間質(zhì)的毛細血管附近第四節(jié)淋巴細胞功能檢測淋巴細胞分為T、B淋巴細胞和NK細胞，NK細胞是非特異性免疫的淋巴細胞亞群。根據(jù)細胞表面標志及淋巴因子檢測細胞數(shù)量并不能代表其功能。一、T淋巴細胞功能檢測淋巴細胞功能檢測可分為體內(nèi)試驗和體外試驗。體內(nèi)試驗主要是進行遲發(fā)型超敏反應，體外試驗主要包括淋巴細胞的增殖試驗、細胞毒試驗以及分泌淋巴因子能力的測定。（一）T細胞增殖試驗T細胞在體外受抗原或絲裂原刺激后，細胞的代謝和形態(tài)發(fā)生變化，胞內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸合成增加，發(fā)生一系列增殖反應，并轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞。非特異性絲裂原有PHA、ConA和PWM；常用抗原刺激物有破傷風類毒素、PPD和白念等。1.形態(tài)學檢查法

分離PBMC，與適量PHA混合，37℃，3天。取培養(yǎng)細胞做涂片染色，借助光學顯微鏡檢測。觀察細胞大小、核與胞質(zhì)的比例、胞質(zhì)的染色性及有無核仁等特征。

分別計數(shù)轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化淋巴細胞，共計算200個細胞，計算轉(zhuǎn)化率，可反映細胞免疫功能，正常人為60%～80%，＜50%為降低。轉(zhuǎn)化率=×100%

形態(tài)學方法簡便易行，只需光學顯微鏡，但易受主觀因素的影響，重復性和準確性較差。2.3H-TdR摻入法T細胞在轉(zhuǎn)化過程中與DNA合成呈正相關。在終止培養(yǎng)前8-16小時，將3H標記的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）加入到培養(yǎng)液中，被轉(zhuǎn)化的淋巴細胞攝取而摻入到新合成的DNA中，用液體閃爍儀測定淋巴細胞內(nèi)放射性核素量，通過脈沖數(shù)(cpm)和刺激指數(shù)(SI)，判斷淋巴細胞的轉(zhuǎn)化程度。

SI=該法敏感性高，客觀性強，重復性好，但需一定的設備，且存在放射性核素污染。3.MTT比色法MTT是一種甲氮唑鹽，可作為細胞內(nèi)線粒體琥珀酸脫氫酶的底物參與反應，形成藍黑色甲臢產(chǎn)物，甲臢被隨后加入的鹽酸異丙醇或二甲基亞砜完全溶解，酶標儀測定細胞培養(yǎng)物A570nm值。甲臢生成量與細胞增殖水平呈正相關。刺激指數(shù)(SI)判斷淋巴細胞增殖程度。

SI=敏感性雖不及3H-TdR摻入法，但操作簡便，無放射性污染。（二）T細胞分泌功能測定T細胞在體外培養(yǎng)，加入各種絲裂原或抗原刺激物后分泌各種細胞因子，可以反應T細胞功能。（三）T細胞介導的細胞毒試驗將靶細胞（腫瘤細胞）按一定比例與待檢CTL混合，共溫一定時間，觀察腫瘤細胞被殺傷情況。1.形態(tài)學檢查法待檢CTL細胞與相應的靶細胞混合共育后，以瑞氏染色液染色，用顯微鏡計數(shù)殘留的腫瘤細胞數(shù)，通過計算CTL細胞對腫瘤細胞生長的抑制率，判斷效應細胞的殺傷活性。2.51Cr釋放法用Na251CrO4標記靶細胞，若靶細胞被殺，51Cr釋放出來，計數(shù)儀測定51Cr放射活性可判斷淋巴細胞的殺傷活性。（四）體內(nèi)試驗該試驗可檢測對某抗原的特異性免疫應答，也可作為受試者總體細胞免疫功能。

1.特異性抗原皮膚試驗：如OT試驗。2.PHA皮膚試驗：將定量PHA注射到受試者前臂內(nèi)皮，可非特異性刺激T細胞發(fā)生母細胞轉(zhuǎn)化，呈現(xiàn)以單個核細胞浸潤為主的炎性反應，一般在注射后6～12小時局部出現(xiàn)紅斑和硬結(jié)，24～48小時達到高峰，?﹥1.5cm為陽性。二、B淋巴細胞功能檢測（一）溶血空斑試驗1.原理將SRBC免疫的小鼠脾臟制成單個細胞懸液，與SRBC在瓊脂糖凝膠內(nèi)混合后倒于小平皿或玻片，脾細胞中的抗體生成細胞釋放SRBC抗體，在補體參與下，可溶解SRBC，形成溶血空斑。每一個空斑代表一個脾細胞，空斑大小代表抗體產(chǎn)生量，空斑多少代表脾細胞數(shù)。

溶血空斑現(xiàn)象

2.方法學（1）經(jīng)典溶血空斑形成試驗：分為直接法和間接法。直接法測IgM型抗體，間接法因IgG、IgA結(jié)合抗原能力低，再加入抗鼠Ig抗體，與鼠脾細胞產(chǎn)生的IgG、IgA形成免疫復合物，在補體作用下溶解紅細胞。（2）被動溶血空斑試驗：指抗體形成細胞產(chǎn)生的Ig與SRBC上的抗原結(jié)合，在補體參與下出現(xiàn)溶血反應。直接法示意圖備注：補體是與致敏紅細胞一起加入的抗體生成細胞產(chǎn)生IgG、IgA抗Ig抗體﹜﹜→→免疫復合物SRBC補體溶血空斑間接法示意圖

（二）酶聯(lián)免疫斑點試驗其原理為抗原包被固相載體，加入待檢的抗體產(chǎn)生細胞，可誘導抗體的產(chǎn)生，加入酶標二抗體，與一抗體形成復合物，沉積于抗體形成細胞上，通過底物顯色反應的深淺，可測定出生成的抗體量，也可計算出斑點形成細胞數(shù)。三、自然殺傷細胞活性測定（一）形態(tài)學法

以人PBMC或小鼠脾細胞為效應細胞，與靶細胞按一定比例混合溫育后，用臺盼藍或伊紅染色死細胞，計算出靶細胞的死亡率即為NK細胞活性。

（二）酶釋放法

乳酸脫氫酶（LDH）是活細胞胞質(zhì)內(nèi)含酶之一，正常情況下LDH不能通過細胞膜，當靶細胞受NK細胞攻擊而損傷時，LDH從胞質(zhì)中釋出，測定培養(yǎng)液中的LDH可得知NK細胞殺傷靶細胞的活性。第五節(jié)其他免疫細胞功能檢測技術

吞噬細胞指中性粒細胞、巨噬細胞和單核細胞。一、中性粒細胞功能的檢測（一）趨化功能檢測

中性粒細胞在趨化因子作用下產(chǎn)生趨化運動。

OOOＯＯ↓↓↓↓．．．．．．．．待測細胞趨化因子有孔濾膜←←←1.濾膜滲透法（Boyden小室法）：上室為待測細胞，下室為趨化因子，中間為有孔濾膜，作用后，取濾膜清洗、固定和染色，在鏡下觀察濾膜孔距離。

2.瓊脂糖平板法：將瓊脂糖溶液倒于玻片上制成瓊脂糖凝膠平板，一排打三個孔，中間加中性粒細胞，左側(cè)孔加趨化因子，右側(cè)孔加對照液，溫育，判斷細胞定向移動能力。瓊脂糖平板趨化因子中性粒細胞對照液↗↗↗

（二）吞噬和殺菌功能的測定1.顯微鏡檢查法

將白細胞與葡萄球菌或白念懸液混合后溫育、涂片、固定、染色，在油鏡下觀察靶細胞對細菌吞噬情況，計算吞噬率和殺菌率。殺菌率（%）=×100吞噬率（%）=×1