分子遺傳課件071110第五章 轉(zhuǎn)錄

第五章轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄transcription

是指以DNA為模板,在依賴于DNA的RNA聚合酶的催化下,以ATP、GTP、CTP和TTP4種核苷三磷酸為原料合成RNA的過(guò)程。除了某些RNA病毒采用復(fù)制的方式復(fù)制RNA外，所有生物的RNA都經(jīng)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生。轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生3種RNA

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生攜帶蛋白質(zhì)合成信息的信使RNA(mRNA)、特異的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)和形成蛋白質(zhì)合成場(chǎng)所的核糖體RNA(rRNA)。除了這3種主要的RNA形式以外，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物還包括一些其他的RNA分子。這些RNA分子往往具有結(jié)構(gòu)功能或催化功能。轉(zhuǎn)錄過(guò)程中兩條DNA鏈的不同作用轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，DNA雙鏈中的一條鏈為模板，稱為模板鏈templatestrand。與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈為編碼鏈codingstrand或信息鏈sensestrand。信息鏈的序列和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列相同。第五章轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄過(guò)程中兩條DNA鏈的不同作用轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，DNA雙鏈中的一條鏈為模板，稱為模板鏈templatestrand。與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈為編碼鏈codingstrand或信息鏈sensestrand。信息鏈的序列和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列相同。轉(zhuǎn)錄單位DNA上轉(zhuǎn)錄起始區(qū)稱為啟動(dòng)子promoter。轉(zhuǎn)錄起始的第一個(gè)堿基稱為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)startpoint。轉(zhuǎn)錄起始于啟動(dòng)子，至終止子終止。由啟動(dòng)子到終止子的序列稱為轉(zhuǎn)錄單位transcriptionunit。第五章轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄過(guò)程中兩條DNA鏈的不同作用轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，DNA雙鏈中的一條鏈為模板，稱為模板鏈templatestrand。與模板鏈互補(bǔ)的DNA鏈為編碼鏈codingstrand或信息鏈sensestrand。信息鏈的序列和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的序列相同。轉(zhuǎn)錄單位DNA上轉(zhuǎn)錄起始區(qū)稱為啟動(dòng)子promoter。轉(zhuǎn)錄起始的第一個(gè)堿基稱為轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)startpoint。轉(zhuǎn)錄起始于啟動(dòng)子，至終止子終止。由啟動(dòng)子到終止子的序列稱為轉(zhuǎn)錄單位transcriptionunit。信息鏈的上游和下游RNA聚合酶合成RNA的方向?yàn)?’→3’,從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)沿RNA聚合酶運(yùn)動(dòng)的方向稱為下游downstream，轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)編號(hào)為+1,下游依次為+2,+3…。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)沿RNA聚合酶運(yùn)動(dòng)方向相反的方向?yàn)樯嫌蝩pstream，上游的第一個(gè)核苷酸為-1。第五章轉(zhuǎn)錄第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶真細(xì)菌RNA聚合酶大小與形狀真細(xì)菌只有一種RNA聚合酶，負(fù)責(zé)三種RNA的轉(zhuǎn)錄。分子量480kDa，大小9.5nm×9.5nm×16nm。該酶表面，形成一條約2.5nm寬的通道(或稱為溝)，是容納DNA分子的場(chǎng)所。數(shù)量和轉(zhuǎn)錄速度一個(gè)大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，大約有7000個(gè)RNA聚合酶分子，其中有2000～5000個(gè)酶分子在參與RNA的合成。37℃時(shí)，合成RNA的速度為40nt/s。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶1.大腸桿菌RNA聚合酶亞基組成和全酶組裝由α(37kDa)、β(151kDa)、β′(156kDa)和σ(70kDa)4種亞基組成，全酶(holoenzyme)共5個(gè)亞基，為α2ββ′σ。其中的α2ββ′為核心酶(coreenzyme)。全酶的組裝過(guò)程為α2+β+β′+σ。

各亞基的功能

β亞基可能具有與底物(NTP及新生RNA鏈)結(jié)合的能力利福霉素通過(guò)與β亞基結(jié)合，可阻斷新生的RNA鏈轉(zhuǎn)移至RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，阻斷新生RNA鏈的第三或第四個(gè)核苷酸的添加，從而阻斷轉(zhuǎn)錄的起始。鏈霉溶菌素可通過(guò)與β亞基的結(jié)合抑制延伸反應(yīng)。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶1.大腸桿菌RNA聚合酶

各亞基的功能

β亞基可能具有與底物(NTP及新生RNA鏈)結(jié)合的能力利福霉素通過(guò)與β亞基結(jié)合，可阻斷新生的RNA鏈轉(zhuǎn)移至RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，阻斷新生RNA鏈的第三或第四個(gè)核苷酸的添加，從而阻斷轉(zhuǎn)錄的起始。鏈霉溶菌素可通過(guò)與β亞基的結(jié)合抑制延伸反應(yīng)。β′亞基可能與模板結(jié)合肝素通過(guò)與β′結(jié)合，并與β′亞基競(jìng)爭(zhēng)DNA的結(jié)合位點(diǎn)而抑制轉(zhuǎn)錄。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶1.大腸桿菌RNA聚合酶

各亞基的功能

β亞基可能具有與底物(NTP及新生RNA鏈)結(jié)合的能力利福霉素通過(guò)與β亞基結(jié)合，可阻斷新生的RNA鏈轉(zhuǎn)移至RNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，阻斷新生RNA鏈的第三或第四個(gè)核苷酸的添加，從而阻斷轉(zhuǎn)錄的起始。鏈霉溶菌素可通過(guò)與β亞基的結(jié)合抑制延伸反應(yīng)。β′亞基可能與模板結(jié)合肝素通過(guò)與β′結(jié)合，并與β′亞基競(jìng)爭(zhēng)DNA的結(jié)合位點(diǎn)而抑制轉(zhuǎn)錄。

β和β′亞基提供RNA聚合酶活性中心，一級(jí)結(jié)構(gòu)與真核生物RNA聚合酶大亞基有同源性第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶1.大腸桿菌RNA聚合酶

各亞基的功能

β亞基可能具有與底物(NTP及新生RNA鏈)結(jié)合的能力β′亞基可能與模板結(jié)合

β和β′亞基提供RNA聚合酶活性中心，一級(jí)結(jié)構(gòu)與真核生物RNA聚合酶大亞基有同源性α亞基可能參與全酶的組裝及全酶識(shí)別啟動(dòng)子，還參與RNA聚合酶與一些調(diào)控因子間的作用第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶1.大腸桿菌RNA聚合酶

各亞基的功能

β亞基可能具有與底物(NTP及新生RNA鏈)結(jié)合的能力β′亞基可能與模板結(jié)合

β和β′亞基提供RNA聚合酶活性中心，一級(jí)結(jié)構(gòu)與真核生物RNA聚合酶大亞基有同源性α亞基可能參與全酶的組裝及全酶識(shí)別啟動(dòng)子，還參與RNA聚合酶與一些調(diào)控因子間的作用σ亞基使全酶識(shí)別啟動(dòng)子，并與啟動(dòng)子結(jié)合σ亞基的功能σ亞基使全酶識(shí)別啟動(dòng)子，并與啟動(dòng)子結(jié)合沒(méi)有σ亞基時(shí)

核心酶具有與DNA非特異結(jié)合的能力，稱為松馳型結(jié)合。結(jié)合常數(shù)為1011L/mol，半衰期為60分鐘。結(jié)合力是DNA的磷酸基團(tuán)與蛋白質(zhì)的堿性基團(tuán)間的非特異性吸附作用。有σ亞基時(shí)全酶與DNA的非特異結(jié)合下降。結(jié)合常數(shù)為107L/mol，半衰期在1秒以下。而與啟動(dòng)子的特異結(jié)合能力大大提高，結(jié)合常數(shù)達(dá)1014L/mol，半衰期長(zhǎng)達(dá)數(shù)小時(shí)。且全酶與不同啟動(dòng)子間的結(jié)合力不同，相差可達(dá)近百倍。T4和T7噬菌體RNA聚合酶與大腸桿菌RNA聚合酶的比較分子組成

T4和T71條多肽鏈,分子量100kDa；

大腸桿菌

5條多肽鏈,分子量480kDa。合成速度T4和T7200nt/s大腸桿菌40nt/s功能復(fù)雜性T4和T7簡(jiǎn)單,只識(shí)別DNA的少數(shù)幾個(gè)啟動(dòng)子。大腸桿菌復(fù)雜，能識(shí)別1000個(gè)以上轉(zhuǎn)錄單位的啟動(dòng)子，有些轉(zhuǎn)錄單位可被直接轉(zhuǎn)錄，有些需要蛋白質(zhì)輔助因子的參與。有些輔助因子只參與一種轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄，有些輔助因子則參與多種轉(zhuǎn)錄單位的轉(zhuǎn)錄。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶1.大腸桿菌RNA聚合酶2.σ因子種類和命名

目前至少發(fā)現(xiàn)了5種σ因子，均根據(jù)其分子量命名，如70kDa命名為σ70、32kDa命名為σ32。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶1.大腸桿菌RNA聚合酶2.σ因子種類和命名

目前至少發(fā)現(xiàn)了5種σ因子，均根據(jù)其分子量命名，如70kDa命名為σ70、32kDa命名為σ32?？莶輻U菌B.Subtilis的σ因子枯草桿菌的RNA聚合酶與大腸桿菌結(jié)構(gòu)相同，也是α2ββ′σ，有10種左右的σ因子。有些σ因子存在于生長(zhǎng)期細(xì)胞，負(fù)責(zé)生長(zhǎng)期基因的轉(zhuǎn)錄，如σABCDHL。有些σ因子只出現(xiàn)在噬菌體感染或由正常生長(zhǎng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)檠挎郀顟B(tài)等特殊情況下，如σEFGK負(fù)責(zé)孢子形成期基因的轉(zhuǎn)錄。正常生長(zhǎng)狀態(tài)下的σA因子分子量為43kDa,故也稱為σ43。σ70的結(jié)構(gòu)與識(shí)別的啟動(dòng)子σ70的結(jié)構(gòu)與識(shí)別的啟動(dòng)子σ70的結(jié)構(gòu)

從N端到C端有4個(gè)保守區(qū)，這些區(qū)在其他σ因子中也存在；

2區(qū)與4區(qū)的氨基酸殘基分別和啟動(dòng)子-10區(qū)和-35區(qū)的核苷酸殘基相接觸，2區(qū)的另一部分氨基酸殘基是DNA解鏈所必需的；

N端的1區(qū)則阻止2區(qū)和4區(qū)在沒(méi)有RNA聚合酶的核心酶存在時(shí)結(jié)合于DNA；

位于1區(qū)和2區(qū)之間的氨基酸殘基（361-390)和核心酶相互作用。σ70的結(jié)構(gòu)與識(shí)別的啟動(dòng)子σ70的結(jié)構(gòu)

σ70識(shí)別的啟動(dòng)子σ70因子識(shí)別的啟動(dòng)子有強(qiáng)弱之分，即不同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄合成RNA的頻率有高有低。

啟動(dòng)子的強(qiáng)弱很大程度上取決于啟動(dòng)子的序列和RNA聚合酶之間的親和力。

E.coli的乳糖操縱子比較弱，而編碼rRNA的6個(gè)rrn操縱子就屬于強(qiáng)者。盡管有其他因素影響RNA聚合酶起始轉(zhuǎn)錄的快慢，但絕大多數(shù)強(qiáng)啟動(dòng)子序列和-35及-10區(qū)共有序列非常一致。如乳糖操縱子啟動(dòng)子的-10區(qū)為T(mén)ATGTT和共有序列TATAAT相比兩個(gè)堿基不同，如果將其突變，使之和共有序列相同，乳糖操縱子的表達(dá)將增加。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶1.大腸桿菌RNA聚合酶2.σ因子種類和命名

枯草桿菌B.Subtilis的σ因子σ70的結(jié)構(gòu)與識(shí)別的啟動(dòng)子σ54識(shí)別的啟動(dòng)子

σ54識(shí)別的啟動(dòng)子序列和其他的σ因子有明顯的區(qū)別，一個(gè)保守序列位于-10區(qū)，另一個(gè)位于-20區(qū)。在沒(méi)有核心酶的情況下，σ54因子就能與啟動(dòng)子結(jié)合

。

第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶1.大腸桿菌RNA聚合酶2.σ因子3.σ因子的更替對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控3.σ因子的更替對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控在細(xì)菌受到外界環(huán)境的急劇影響或芽胞菌生活方式改變時(shí)，會(huì)產(chǎn)生σ因子更替的現(xiàn)象

環(huán)境溫度升高引起σ因子的更替

溫度升高時(shí)，正常狀態(tài)下表達(dá)的基因會(huì)關(guān)閉或表達(dá)水平下降，rpoH表達(dá)σ32，σ32識(shí)別熱激基因(heatshockgene)的啟動(dòng)子，使其表達(dá)。溫度升高，細(xì)胞內(nèi)會(huì)有一些蛋白質(zhì)發(fā)生變性，為σ32的表達(dá)提供信號(hào)。溫度變化劇烈，細(xì)胞周質(zhì)或膜的變性蛋白提供信號(hào)，表達(dá)σE。

熱激蛋白能提高菌體對(duì)高溫的抵抗能力，其中有些蛋白質(zhì)屬于分子伴侶(chaperons)。氮缺乏引起σ因子的更替銨缺乏，表達(dá)σ54，使與氮代謝有關(guān)的基因表達(dá)。3.σ因子的更替對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控在細(xì)菌受到外界環(huán)境的急劇影響或芽胞菌生活方式改變時(shí)，會(huì)產(chǎn)生σ因子更替的現(xiàn)象

環(huán)境溫度升高引起σ因子的更替

氮缺乏引起σ因子的更替銨缺乏，表達(dá)σ54，使與氮代謝有關(guān)的基因表達(dá)。σE(枯草桿菌中的σD)因子的更替可引起與化學(xué)趨向性和鞭毛結(jié)構(gòu)有關(guān)基因表達(dá)3.σ因子的更替對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控在細(xì)菌受到外界環(huán)境的急劇影響或芽胞菌生活方式改變時(shí)，會(huì)產(chǎn)生σ因子更替的現(xiàn)象

環(huán)境溫度升高引起σ因子的更替

氮缺乏引起σ因子的更替σE(枯草桿菌中的σD)因子的更替可引起與化學(xué)趨向性和鞭毛結(jié)構(gòu)有關(guān)基因表達(dá)SPO1噬菌體σ因子的更替對(duì)早中晚期三個(gè)階段基因表達(dá)的調(diào)控早期基因表達(dá)中，使用宿主的聚合酶α2ββ′σ34。早期基因宿主基因啟動(dòng)子相同。在早期還表達(dá)用于中期基因表達(dá)的σ因子(gp28)。中期基因表達(dá)(早期表達(dá)4-5分鐘后),用gp28作為σ因子。中期表達(dá)用于晚期基因表達(dá)的σ因子(gp33和gp34)。

晚期基因表達(dá)(8-12分鐘后),使用gp33和gp34作為σ因子。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶二、真核生物的RNA聚合酶真核生物RNA聚合酶的種類分三類，RNA聚合酶Ⅰ對(duì)鵝膏蕈堿(α-amanitine)不敏感、RNA聚合Ⅱ?qū)Z膏蕈堿敏感，動(dòng)物細(xì)胞RNA聚合酶Ⅲ對(duì)高濃度鵝膏蕈堿敏感。酵母和昆蟲(chóng)的RNA聚合酶Ⅲ不受抑制。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶二、真核生物的RNA聚合酶種類分三類，RNA聚合酶Ⅰ對(duì)鵝膏蕈堿(α-amanitine)不敏感、RNA聚合Ⅱ鵝膏蕈堿敏感，動(dòng)物細(xì)胞RNA聚合酶Ⅲ對(duì)高濃度鵝膏蕈堿敏感。酵母和昆蟲(chóng)的RNA聚合酶Ⅲ不受抑制。功能

RNA聚合酶Ⅰ位于核仁，活性所占比例最大，負(fù)責(zé)rRNA(5.8S、18S和28S)的轉(zhuǎn)錄。

RNA聚合酶Ⅱ位于核質(zhì)，主要負(fù)責(zé)不均一核RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)和mRNA的轉(zhuǎn)錄。

RNA聚合酶Ⅲ位于核質(zhì)，活性所占比例最小，負(fù)責(zé)tRNA、5SRNA、Alu序列和其他小RNA的轉(zhuǎn)錄。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶二、真核生物的RNA聚合酶結(jié)構(gòu)

分子量為500kDa或更大。由8至14個(gè)亞基組成。釀酒酵母RNA聚合酶Ⅱ由10多個(gè)亞基組成，其中最大的三個(gè)亞基與細(xì)菌的RNA聚合酶有同源性。種類功能

RNA聚合酶Ⅰ位于核仁，活性所占比例最大，負(fù)責(zé)rRNA(5.8S、18S和28S)的轉(zhuǎn)錄。

RNA聚合酶Ⅱ位于核質(zhì)，主要負(fù)責(zé)不均一核RNA(heterogeneousnuclearRNA,hnRNA)和mRNA的轉(zhuǎn)錄。

RNA聚合酶Ⅲ位于核質(zhì)，活性所占例最小，負(fù)責(zé)tRNA、5SRNA、Alu序列和其他小RNA的轉(zhuǎn)錄。第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子一、原核生物的RNA聚合酶二、真核生物的RNA聚合酶結(jié)構(gòu)

分子量為500kDa或更大。由8至14個(gè)亞基組成。釀酒酵母RNA聚合酶Ⅱ由10多個(gè)亞基組成，其中最大的三個(gè)亞基與細(xì)菌的RNA聚合酶有同源性。種類功能

有一個(gè)C末端結(jié)構(gòu)域(carboxyterminaldomain,CTD)，保守序列為T(mén)yr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser，稱為C端重復(fù)七肽，只出現(xiàn)于RNA聚合酶Ⅱ中，酵母中有26個(gè)重復(fù)，哺乳動(dòng)物有50個(gè)。第五章轉(zhuǎn)錄第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子第二節(jié)啟動(dòng)子啟動(dòng)子promoter能夠與RNA聚合酶全酶結(jié)合并準(zhǔn)確有效地起始轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列稱為啟動(dòng)子。除了RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)外，啟動(dòng)子中還有一些調(diào)節(jié)蛋白因子的結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子的強(qiáng)弱決定著某一基因的表達(dá)強(qiáng)度

與RNA聚合酶親和力高的啟動(dòng)子，起始頻率和效率高。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子啟動(dòng)子中含有可與RNA聚合酶結(jié)合的序列

原核生物的基因組中，能被RNA聚合酶識(shí)別的最小長(zhǎng)度為12bp。這12bp的長(zhǎng)度不一定是連續(xù)排列的，可以被其他的序列隔開(kāi)。間隔序列的長(zhǎng)度本身就可以提供部分信息。比較不同啟動(dòng)子序列，得到了啟動(dòng)子中同源性強(qiáng)的保守序列

同源性強(qiáng)的序列是啟動(dòng)子的功能所必需的，保守序列并不是在任何的啟動(dòng)子中均是相同的，存在著一定的靈活性，但一個(gè)啟動(dòng)子與保守序列的差別不應(yīng)超過(guò)1～2個(gè)堿基。對(duì)大腸桿菌100多個(gè)啟動(dòng)子序列比較發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子缺乏超過(guò)60bp的廣泛的保守序列第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子1.原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)(1)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)多數(shù)情況下（>90%)為嘌呤，常見(jiàn)序列為CAT,也有的是CGT，A（G）是轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。(2)-10區(qū)結(jié)構(gòu)：轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游的6bp保守序列，TATAAT。中心在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游-10bp處，范圍為-18～-9bp。100個(gè)啟動(dòng)子中頻率為T(mén)80A95T45A60A50T96或T80A95t45A60a50T96(小寫(xiě)字母示頻率低于54的堿基)。功能：-10區(qū)保守序列又稱Pribnow框。是RNA聚合酶的牢固結(jié)合位點(diǎn)，

故又稱為結(jié)合位點(diǎn)。富含AT對(duì)，易于形成開(kāi)放轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。(3)-35區(qū)結(jié)構(gòu)：保守序列為T(mén)TGACA,又稱Sextama框,位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游-35bp處。頻率為T(mén)82T84G78A65C54A45。功能：σ因子識(shí)別位點(diǎn),故稱識(shí)別位點(diǎn)。RNA聚合酶識(shí)別此區(qū)并與之結(jié)合，然后再與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。本區(qū)是啟動(dòng)子強(qiáng)弱決定因素。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子1.原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)(1)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(2)-10區(qū)(3)-35區(qū)結(jié)構(gòu)：保守序列為T(mén)TGACA,又稱Sextama框,位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游-35bp處。頻率為T(mén)82T84G78A65C54A45。功能：σ因子識(shí)別位點(diǎn),故稱識(shí)別位點(diǎn)。RNA聚合酶識(shí)別此區(qū)并與之結(jié)合，然后再與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。本區(qū)是啟動(dòng)子強(qiáng)弱決定因素。(4)-10區(qū)和-35區(qū)間的距離90%的原核生物為16～18bp。適宜的距離可以為RNA聚合酶提供合適的空間結(jié)構(gòu)，便于轉(zhuǎn)錄的起始。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子1.原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)(1)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(2)-10區(qū)(3)-35區(qū)結(jié)構(gòu)：保守序列為T(mén)TGACA,又稱Sextama框,位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游-35bp處。頻率為T(mén)82T84G78A65C54A45。功能：σ因子識(shí)別位點(diǎn),故稱識(shí)別位點(diǎn)。RNA聚合酶識(shí)別此區(qū)并與之結(jié)合，然后再與結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。本區(qū)是啟動(dòng)子強(qiáng)弱決定因素。(4)-10區(qū)和-35區(qū)間的距離90%的原核生物為16～18bp。適宜的距離可以為RNA聚合酶提供合適的空間結(jié)構(gòu)，便于轉(zhuǎn)錄的起始。典型的原核生物啟動(dòng)子-10區(qū)和-35區(qū)間的距離為17bp，-10區(qū)與轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)的距離為7bp。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子1.原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)(1)轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(2)-10區(qū)(3)-35區(qū)(4)-10區(qū)和-35區(qū)間的距離TTGACA16～18bpTATAAT5～8bpCTG

-35區(qū)-10區(qū)+1第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子1.原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.啟動(dòng)子功能的研究方法研究啟動(dòng)子功能的主要方法是啟動(dòng)子的突變使啟動(dòng)子的堿基序列發(fā)生變化，可以改變啟動(dòng)子的強(qiáng)弱，從而增強(qiáng)或減弱該啟動(dòng)子所控制的結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。下降突變

使啟動(dòng)子功能減弱或消失的突變。大多數(shù)突變都是下降突變。上升突變使啟動(dòng)子功能增強(qiáng)的突變。影響啟動(dòng)子功能的點(diǎn)突變都發(fā)生在兩個(gè)保守區(qū)內(nèi)

-10區(qū)和-35區(qū)。改變兩個(gè)保守區(qū)(-10區(qū)和-35區(qū))間的距離也改變啟動(dòng)子的強(qiáng)弱第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子1.原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.啟動(dòng)子功能的研究方法3.RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合采用足跡法(footprinting)研究RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別與結(jié)合足跡法原理：將DNA聚合酶與標(biāo)記的DNA結(jié)合，然后進(jìn)行內(nèi)切酶酶解，酶解片段進(jìn)行電泳，放射自顯影觀察受足跡法保護(hù)的序列。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合的區(qū)域?yàn)?20至-50；兩條鏈?zhǔn)躌NA聚合酶的保護(hù)程度不同，表明RNA聚合酶與兩條鏈的結(jié)合是不對(duì)稱的，說(shuō)明轉(zhuǎn)錄只需一條模板鏈。采用修飾堿基的方法研究RNA聚合酶緊密結(jié)合位點(diǎn)第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子1.原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.啟動(dòng)子功能的研究方法3.RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合采用足跡法(footprinting)研究RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別與結(jié)合采用修飾堿基的方法研究RNA聚合酶緊密結(jié)合位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)方法

先用堿基修飾試劑對(duì)DNA和RNA聚合酶的復(fù)合物進(jìn)行修飾，未與RNA聚合酶結(jié)合的DNA，相應(yīng)的堿基被修飾，而結(jié)合部分的堿基則不被修飾。分析未被修飾的堿基，即為與RNA聚合酶結(jié)合的部位?；蚴窍葘NA修飾，然后再與RNA聚合酶結(jié)合，分析那些不能與RNA聚合酶結(jié)合的片段。這些分析方法可以確定與RNA聚合酶緊密結(jié)合的位點(diǎn)。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子1.原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.啟動(dòng)子功能的研究方法3.RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合采用足跡法(footprinting)研究RNA聚合酶對(duì)啟動(dòng)子的識(shí)別與結(jié)合采用修飾堿基的方法研究RNA聚合酶緊密結(jié)合位點(diǎn)

RNA聚合酶緊密結(jié)合位點(diǎn)集中在啟動(dòng)子的-35區(qū)至-10區(qū)。結(jié)合突變研究結(jié)論確定，緊密結(jié)合區(qū)域長(zhǎng)12-15bp。采用修飾堿基法確定啟動(dòng)子中處于熔解狀態(tài)的部分有些修飾試劑不能修飾處于雙鏈狀態(tài)的堿基，但可修飾處于單鏈狀態(tài)的堿基。結(jié)論：-9至+3處于單鏈狀態(tài)。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子1.原核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.啟動(dòng)子功能的研究方法3.RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合DNA兩條鏈上的緊密結(jié)合位點(diǎn)不對(duì)稱在-10區(qū)上游的所有緊密結(jié)合位點(diǎn)均位于一條DNA鏈上，在雙鏈DNA中，這些緊密結(jié)合位點(diǎn)處于DNA的一側(cè)。這可使RNA聚合酶從DNA的一個(gè)側(cè)面接近并識(shí)別啟動(dòng)子并與之結(jié)合。另外，大部分的緊密結(jié)合位點(diǎn)位于編碼鏈上，少數(shù)位于模板鏈上，且都處于-10區(qū)的下游。可能是DNA雙鏈熔解后，使RNA聚合酶得以識(shí)別模板鏈上的位點(diǎn)并與其結(jié)合。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子二、真核生物的啟動(dòng)子

真核生物有三種RNA聚合酶(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)催化,在三種啟動(dòng)子控制下的對(duì)三類基因(Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅲ類)進(jìn)行三種方式的轉(zhuǎn)錄。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子二、真核生物的啟動(dòng)子1.RNA聚合酶Ⅰ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)RNA聚合酶Ⅰ轉(zhuǎn)錄的基因一種基因,三種rRNA(5.8S、18S和28S)的基因(rDNA)成簇存在，共同轉(zhuǎn)錄在一個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物上，然后經(jīng)加工成為三種rRNA。RNA聚合酶Ⅰ識(shí)別的啟動(dòng)子由轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游兩部分序列組成。與一般啟動(dòng)子不同,富含G、C對(duì),兩部分同源性85%。

核心啟動(dòng)子corepromoter

位于-45～+20bp，此序列足以使轉(zhuǎn)錄起始。

上游調(diào)控元件upstreamcontrolelement,UCE

位于-180～-107bp,可以大大提高核心啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始效率。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子二、真核生物的啟動(dòng)子1.RNA聚合酶Ⅰ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的基因

蛋白質(zhì)基因(mRNA)和部分核小RNA(smallnuclearRNA,snRNA)，啟動(dòng)子最復(fù)雜。該酶單獨(dú)不能起始轉(zhuǎn)錄，必須和其他的輔助因子共同作用才能起始轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶Ⅱ識(shí)別的啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游，由多個(gè)短序列元件組成，屬于通用型啟動(dòng)子，沒(méi)有組織特異性。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子二、真核生物的啟動(dòng)子1.RNA聚合酶Ⅰ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)(1)加帽位點(diǎn)capsite又稱轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(+1),A占50%,G占25%,C和T共占25%。-1常為C。沒(méi)有TATA框的啟動(dòng)子此區(qū)域?yàn)槠鹗甲?initiator,Inr)。Inr共有序列為PyPyAN(T/A)PyPy(其中有下畫(huà)線的堿基為十1位，Py為嘧啶)。(2)TATA框TATAbox又稱Golderg-Hogness框，位于-25～-35bp(-30bp)處。共有序列7bp,TATA(A/T)A(A/T)。比CAAT框和GC框轉(zhuǎn)錄起始效率低，具有定位起錄起始點(diǎn)的功能。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子二、真核生物的啟動(dòng)子1.RNA聚合酶Ⅰ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)(1)加帽位點(diǎn)capsite(2)TATA框TATAbox又稱Golderg-Hogness框，位于-25～-35bp(-30bp)處。共有序列7bp,TATA(A/T)A(A/T)。比CAAT框和GC框轉(zhuǎn)錄起始效率低，具有定位起錄起始點(diǎn)的功能。(3)CAAT框CAATbox位于-75bp(-70～-80bp)處。共有序列GG(C/T)CAATCT。離轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)距離長(zhǎng)短對(duì)其作用影響不大,正反方向排列均能起作用。決定啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的效率及頻率。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子二、真核生物的啟動(dòng)子1.RNA聚合酶Ⅰ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)(1)加帽位點(diǎn)capsite(2)TATA框TATAbox(3)CAAT框CAATbox位于-75bp(-70～-80bp)處。共有序列GG(C/T)CAATCT。離轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)距離長(zhǎng)短對(duì)其作用影響不大,正反方向排列均能起作用。決定啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的效率及頻率。(4)GC框GCboxGC框位于-90bp附近,核心序列為GGGCGG。(5)八聚體核苷酸元件octamerelementATTTGCAT。(6)κB元件共有序列：GGGACTTTCC。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子二、真核生物的啟動(dòng)子1.RNA聚合酶Ⅰ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)(1)加帽位點(diǎn)capsite(2)TATA框TATAbox(3)CAAT框CAATbox(4)GC框GCboxGC框位于-90bp附近,核心序列為GGGCGG。(5)八聚體核苷酸元件octamerelementATTTGCAT。(6)κB元件共有序列：GGGACTTTCC。(7)ATF元件共有序列：GTGACGT。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子二、真核生物的啟動(dòng)子1.RNA聚合酶Ⅰ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)啟動(dòng)子元件元件的距離各元件間的距離對(duì)啟動(dòng)子的功能沒(méi)有太大影響。但如果距離太近(<10bp)或太遠(yuǎn)(>30bp)，就會(huì)影響啟動(dòng)子的功能。啟動(dòng)子元件的組合不同的啟動(dòng)子中，啟動(dòng)子元件的數(shù)目、位置和排列方式不同。1個(gè)八聚體元件,2個(gè)GC框,1個(gè)CAAT框,1個(gè)TATA框6個(gè)GC框2個(gè)八聚體元件,2個(gè)CAAT框,1個(gè)TATA框第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子二、真核生物的啟動(dòng)子1.RNA聚合酶Ⅰ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)3.RNA聚合酶Ⅲ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)3.RNA聚合酶Ⅲ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄的基因

轉(zhuǎn)錄5SrRNA、tRNA和部分snRNA(U6)的基因。這三種基因的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)是不同的，因此RNA聚合酶Ⅲ要想識(shí)別不同的啟動(dòng)子，必須和其他的輔助因子共同作用。內(nèi)部啟動(dòng)子

5SrRNA和tRNA基因的啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)下游,+55至+80bp處,為內(nèi)部啟動(dòng)子。內(nèi)部啟動(dòng)子可分為兩類。第一類內(nèi)部啟動(dòng)子含A框(boxA)和C框(boxC)，兩個(gè)保守區(qū)域間由其他序列隔開(kāi)。第二類內(nèi)部啟動(dòng)子含A框(boxA)和B框(boxB)。RMA聚合酶Ⅲ識(shí)別的位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的啟動(dòng)子含三個(gè)短序列元件，分別為T(mén)ATA框、近端序列元件(proximalsequenceelement,PSE)和八聚體核苷酸元件。RNA聚合酶只需要轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)加上一段含TATA框的短序列就能起始轉(zhuǎn)錄。PSE和OCT元件能大大提高其轉(zhuǎn)錄效率。內(nèi)部啟動(dòng)子

5SrRNA和tRNA基因的啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)下游,+55至+80bp處,為內(nèi)部啟動(dòng)子。內(nèi)部啟動(dòng)子可分為兩類。第一類內(nèi)部啟動(dòng)子

含A框(boxA)和C框(boxC)，兩個(gè)保守區(qū)域間由其他序列隔開(kāi)。第二類內(nèi)部啟動(dòng)子

含A框(boxA)和B框(boxB)。間隔序列長(zhǎng)短差異很大，但如果間隔序列過(guò)短，會(huì)影響啟動(dòng)子的功能。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)也可影響轉(zhuǎn)錄起始的效率，緊接轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游序列的突變會(huì)影響轉(zhuǎn)錄的起始。第三類啟動(dòng)子-位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游的啟動(dòng)子

含三個(gè)短序列元件，分別為T(mén)ATA框、近端序列元件(proximalsequenceelement,PSE)和八聚體核苷酸元件。RNA聚合酶只需要轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)加上一段含TATA框的短序列就能起始轉(zhuǎn)錄。PSE和OCT元件能大大提高其轉(zhuǎn)錄效率。第二節(jié)啟動(dòng)子一、原核生物的啟動(dòng)子二、真核生物的啟動(dòng)子1.RNA聚合酶Ⅰ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)2.RNA聚合酶Ⅱ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)3.RNA聚合酶Ⅲ的啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)4.研究真核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能的方法研究啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能的方法主要有缺失、點(diǎn)突變和足跡法。在分析得到了啟動(dòng)子的功能序列后，還要弄清與之結(jié)合的蛋白質(zhì)及兩者間的相互作用。在研究真核生物啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)與功能時(shí)，還要用一系列方法。4.研究真核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能的方法(1)卵細(xì)胞系統(tǒng)oocytesystem方法將DNA直接注射入爪蟾(X.laevis)卵細(xì)胞的細(xì)胞核，分析和觀察RNA的轉(zhuǎn)錄情況。局限性

試驗(yàn)條件受卵細(xì)胞內(nèi)條件的限制。適用范圍

可以用來(lái)分析DNA片段的特性，不能用于分析蛋白質(zhì)因子與DNA間的結(jié)合。(2)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)transfectionsystem方法

將外源DNA導(dǎo)入轉(zhuǎn)染的細(xì)胞并使之表達(dá)。特點(diǎn)

表達(dá)可分為瞬時(shí)表達(dá)和整合表達(dá)。由于轉(zhuǎn)錄是在細(xì)胞內(nèi)完成的，可以看成是一種體內(nèi)試驗(yàn)系統(tǒng)。但外源基因又不是細(xì)胞所固有的，和細(xì)胞固有基因的表達(dá)尚有差別。使用多種宿主細(xì)胞，可提高該系統(tǒng)的應(yīng)用價(jià)值。4.研究真核生物啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)與功能的方法(3)轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)transgenicsystem方法

轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)將外源基因整合入動(dòng)物的生殖細(xì)胞，使外源基因在部分或全部組織中表達(dá)。特點(diǎn)

該系統(tǒng)和轉(zhuǎn)染系統(tǒng)有一些相同的局限性，即外源基因常以多拷貝存在，整合的位置也和內(nèi)源性基因不同。(4)體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)invitrosystem方法

體外轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)是一種經(jīng)典的方法。它應(yīng)用體外轉(zhuǎn)錄的方法，結(jié)合缺失突變和點(diǎn)突變，來(lái)篩選哪些序列是啟動(dòng)子的功能所必需的，哪些序列對(duì)啟動(dòng)子的功能有影響，以及哪些輔助因子對(duì)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子中的某一片段有何種作用。第五章轉(zhuǎn)錄第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子第二節(jié)啟動(dòng)子第三節(jié)終止子在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，提供轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的序列稱為終止子terminator。第三節(jié)終止子一、原核生物的終止子終止子和啟動(dòng)子不同，真正起終止作用的不是DNA序列本身，而是轉(zhuǎn)錄生成的RNA。大腸桿菌有兩種類型的終止子

一類為內(nèi)在終止子(intrinsicterminator)，只有核心酶和終止子就足以使轉(zhuǎn)錄終止，不依賴其他輔助因子，稱為不依賴ρ因子的終止子。另一類終止子必須在ρ因子(ρfactor)的存在下核心酶才能終止轉(zhuǎn)錄，因此稱為的ρ因子終止子(ρ-dependentterminator)。不依賴ρ因子的終止子在結(jié)構(gòu)上有兩個(gè)特征一是形成一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(haipin)，二是發(fā)夾結(jié)構(gòu)末端緊跟著6個(gè)連續(xù)的Ｕ串。發(fā)夾結(jié)構(gòu)莖的底部有一富含GC對(duì)的區(qū)域，新生的發(fā)夾結(jié)構(gòu)可使RNA聚合酶的聚合反應(yīng)暫停。第三節(jié)終止子一、原核生物的終止子依賴ρ因子的終止子終止位點(diǎn)的上游序列：AUCGCUACCUCAUAUCCGCACCUCCUCAAACGCUACCUCGACCAGAAAGGCGUCUCUU第三節(jié)終止子一、原核生物的終止子二、真核生物的終止子不同的RNA聚合酶有不同的終止子

RNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ有類似于原核生物的終止元件。RNA聚合酶Ⅱ是否有類以的終止元件目前還不十分清楚。RNA聚合酶Ⅰ的終止子序列為18bp，可被輔助因子識(shí)別RNA聚合酶Ⅲ的終止子類似原核生物，也具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)和U串。發(fā)夾結(jié)構(gòu)中有段富含GC對(duì)的序列。U串為4個(gè)，轉(zhuǎn)錄常在第二處終止，也有的在第三或第四個(gè)U處終止。第五章轉(zhuǎn)錄第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子第二節(jié)啟動(dòng)子第三節(jié)終止子第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制轉(zhuǎn)錄是由DNA指導(dǎo)的RNA合成的過(guò)程，可分為起始、和延伸和終止三個(gè)階段。第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始轉(zhuǎn)錄的起始是RNA聚合酶識(shí)別啟動(dòng)子并與之結(jié)合從而啟動(dòng)RNA合成的過(guò)程。第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始1.原核生物轉(zhuǎn)錄的起始細(xì)菌內(nèi)，極少數(shù)RNA聚合酶核心酶分子呈游離狀態(tài)，大多數(shù)核心酶與DNA分子松馳結(jié)合形成松馳型復(fù)合物核心酶對(duì)啟動(dòng)子無(wú)特殊的親和力。核心酶與σ因子結(jié)合形成全酶后，對(duì)啟動(dòng)子的親和力大大提高，形成緊密型復(fù)合物全酶對(duì)啟動(dòng)子的親和力決定了啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄的效率不同啟動(dòng)子和全酶的親和力不同，親和力差距最大可達(dá)100倍左右。全酶在很長(zhǎng)的基因組(E.coli4.2×106bp)中，尋找到60bp啟動(dòng)子的機(jī)制有三種模式第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始1.原核生物轉(zhuǎn)錄的起始全酶在很長(zhǎng)的基因組(E.coli4.2×106bp)中，尋找到60bp啟動(dòng)子的機(jī)制有三種模式(1)隨機(jī)擴(kuò)散模式全酶與DNA呈松馳型結(jié)合時(shí)，結(jié)合和解離的速度很快，不斷結(jié)合與解離直到全酶尋找到啟動(dòng)子并與之發(fā)生緊密型結(jié)合。這種模式要求RNA聚合酶快速隨機(jī)擴(kuò)散，但實(shí)際測(cè)到的體外擴(kuò)散速率太慢。(2)RNA聚合酶以隨機(jī)擴(kuò)散的方式與基因組DNA結(jié)合后，以一種置換的方式尋找啟動(dòng)子與RNA聚合酶結(jié)合的序列直接被另一段序列代替，酶分子很快地更換與之結(jié)合的序列，直到發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子并與啟動(dòng)子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始1.原核生物轉(zhuǎn)錄的起始全酶在很長(zhǎng)的基因組(E.coli4.2×106bp)中，尋找到60bp啟動(dòng)子的機(jī)制有三種模式(1)隨機(jī)擴(kuò)散模式(2)RNA聚合酶以隨機(jī)擴(kuò)散的方式與基因組DNA結(jié)合后，以一種置換的方式尋找啟動(dòng)子與RNA聚合酶結(jié)合的序列直接被另一段序列代替，酶分子很快地更換與之結(jié)合的序列，直到發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子并與啟動(dòng)子形成穩(wěn)定的復(fù)合物。(3)RNA聚合酶分子在DNA分子上隨機(jī)滑動(dòng)，直到發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)子并與之結(jié)合第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始1.原核生物轉(zhuǎn)錄的起始起始過(guò)程(1)RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合形成封閉型啟動(dòng)子復(fù)合物(2)-10區(qū)附近的DNA發(fā)生溶解，形成12～17bp的單鏈區(qū)，形成開(kāi)放型啟動(dòng)子復(fù)合物RNA聚合酶與大約75bpDNA(-55～+20bp)相互接觸。(3)RNA聚合酶上的起始位點(diǎn)和延伸位點(diǎn)被相應(yīng)的核苷酸前體占據(jù)，在β亞基的催化下形成第一個(gè)磷酸二酯鍵，形成三元復(fù)合物。(4)σ因子解離，形成起始延伸復(fù)合物initialelogationcomplex

核心酶與55bp(-35～+20bp)DNA相互接觸。第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始1.原核生物轉(zhuǎn)錄的起始2.真核生物轉(zhuǎn)錄的起始(1)RNA聚合酶Ⅰ的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶Ⅰ起始轉(zhuǎn)錄需要兩種輔助因子UBF1和SL1UBF1和SL1識(shí)別與結(jié)合的序列

UBF1由1條多肽鏈組成，可特異地識(shí)別核心啟動(dòng)子和UCE中富含GC對(duì)的區(qū)域。SL1單獨(dú)不能識(shí)別特異DNA序列，UBF1與DNA結(jié)合后，SL11可結(jié)合DNA。輔助因子與DNA結(jié)合后，RNA聚合酶Ⅰ與核心啟動(dòng)子結(jié)合，起始轉(zhuǎn)錄。SL1的功能

SL1含4種蛋白質(zhì)，其中有TATA框結(jié)合蛋白TBP。SL1類似于原核生物的σ因子，可與啟動(dòng)子特異結(jié)合，保證RNA聚合酶(三種)定位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始1.原核生物轉(zhuǎn)錄的起始2.真核生物轉(zhuǎn)錄的起始(1)RNA聚合酶Ⅰ的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶Ⅰ起始轉(zhuǎn)錄需要兩種輔助因子UBF1和SL1UBF1和SL1識(shí)別與結(jié)合的序列

SL1的功能

SL1含4種蛋白質(zhì)，其中有TATA框結(jié)合蛋白TBP。SL1類似于原核生物的σ因子，可與啟動(dòng)子特異結(jié)合，保證RNA聚合酶(三種)定位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)。UBF沒(méi)有種屬特異性，SL1有種屬特異性(2)RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶Ⅱ起始轉(zhuǎn)錄需要輔助因子參與酶和輔助因子組成基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置basaltranscriptionapparatus，可以起始Ⅱ類基因轉(zhuǎn)錄。通用啟動(dòng)子與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子參與構(gòu)成基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置通用啟動(dòng)子genericpromoter

是指RNA聚合酶Ⅱ可起始轉(zhuǎn)錄的最短的啟動(dòng)子序列，它可以在任何細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，沒(méi)有組織特異性?；A(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子basaltranscriptionfactor基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子basaltranscriptionfactor1.TFⅡD由TBP與TBP相關(guān)因子(TBP-associatedfactors,TAFs)組成。識(shí)別TATA框及其上游序列。TBP結(jié)合DNA的小溝，其他因子與大溝結(jié)合。TBP保護(hù)TATA框的一個(gè)螺旋，在-37～-25bp。TBP大小38kDa,TAFs結(jié)合后，保護(hù)-45～-10bp。TAFs大小為230kDa或稍小，總數(shù)>8個(gè)。2.TFⅡA幾個(gè)亞基組成，為34、19、14kDa。共約100kDa。3.TFⅡB一個(gè)亞基，33kDa,它的結(jié)合，使保護(hù)區(qū)域擴(kuò)展至-10～+10bp區(qū)域。表明其與TATA框下游結(jié)合。4.TFⅡF210kDa,2種亞基，大亞基RAP76,74kDa,有依賴ATP的DNA螺旋酶活性，可能參與DNA雙鏈的熔解。小亞基RAP38,30kDa,同σ因子與核心酶結(jié)合的部位有同源性，與RNA聚合酶Ⅱ緊密結(jié)合。TFⅡF功能：將RNA聚合酶Ⅱ與其他輔助因子組成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。RNA聚合酶Ⅱ與復(fù)合物結(jié)合后保護(hù)區(qū)在模板鏈上擴(kuò)展至+15bp處，在非模板鏈至+20bp處。TFⅡF與復(fù)合物結(jié)合可使護(hù)區(qū)域擴(kuò)展至+30bp?；A(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子basaltranscriptionfactor1.TFⅡD2.TFⅡA3.TFⅡB4.TFⅡF5.TFⅡE180kDa,2種亞基,34kDa,56kDa。6.TFⅡH230kDa,5種亞基組成,90kDa,62kDa,43kDa,41kDa,35kDa。具有解旋酶活性，能夠利用ATP水解所釋放的能量將雙螺旋DNA的兩條鏈分開(kāi)，暴露出轉(zhuǎn)錄模板鏈和轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，為轉(zhuǎn)錄創(chuàng)造條件。還有蛋白激酶活性，能夠?qū)TP的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給RNA聚合酶Ⅱ最大的亞基C端的重復(fù)結(jié)構(gòu)域CTD，使多個(gè)Ser磷酸化，這對(duì)轉(zhuǎn)錄起始完成后將RNA聚合酶Ⅱ從起始復(fù)合物中釋放出來(lái)十分重要。7.TFⅡJ(2)RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶Ⅱ起始轉(zhuǎn)錄需要輔助因子參與酶和輔助因子組成基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置basaltranscriptionapparatus，可以起始Ⅱ類基因轉(zhuǎn)錄。通用啟動(dòng)子與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子參與構(gòu)成基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置通用啟動(dòng)子genericpromoter

是指RNA聚合酶Ⅱ可起始轉(zhuǎn)錄的最短的啟動(dòng)子序列，它可以在任何細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，沒(méi)有組織特異性?；A(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子basaltranscriptionfactor參與不含TATA框啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始的轉(zhuǎn)錄因子(1)TFⅡD識(shí)別起始子，并與之特異結(jié)合。(2)TFⅡI(3)YY1含有鋅指結(jié)構(gòu)，與含有CCAT的序列有親和力。(2)RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始RNA聚合酶Ⅱ起始轉(zhuǎn)錄需要輔助因子參與

通用啟動(dòng)子與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子參與構(gòu)成基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄裝置參與不含TATA框啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始的轉(zhuǎn)錄因子其他轉(zhuǎn)錄因子(1)SP1SP1由1個(gè)亞基組成，分子量為105kDa,可結(jié)合6bp的區(qū)域，識(shí)別GC框。(2)CTF家族由1個(gè)基因經(jīng)不同的加工方式而形成，對(duì)CAAT有相同的親和力。(3)CP1對(duì)α-球蛋白及晚期腺病毒的CAAT框親和力高。(4)CP2對(duì)γ-纖維蛋白基因的CAAT框親和力高。(5)CP3(6)C/EBF識(shí)別GCAAT。(7)ACF識(shí)別CCAAT。第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始1.原核生物轉(zhuǎn)錄的起始2.真核生物轉(zhuǎn)錄的起始(1)RNA聚合酶Ⅰ的轉(zhuǎn)錄起始(2)RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄起始(3)RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄起始(2)RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄起始兩類內(nèi)部啟動(dòng)子tRNA和5SrRNA基因啤酒酵母轉(zhuǎn)錄tRNA的轉(zhuǎn)錄因子

TFⅢB和TFⅢC。(1)TFⅢB為三聚體，組分之一TBP，組分之二TFⅡB相關(guān)因子BRFTFⅡB-relatedfactor,序列類似于TFⅡB。(2)TFⅢC由6條多肽鏈組成，總分子量高達(dá)600kDa。tRNA基因轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物組裝步驟(1)TFⅢC結(jié)合于啟動(dòng)子A盒和B盒，對(duì)B盒的親和力較高；(2)TFⅢB結(jié)合于A盒上游約50bp處，并和TFⅢC相互作用；(3)一旦TFⅢB結(jié)合，RNA聚合酶Ⅲ就結(jié)合于TFⅢB-TFⅢC-DNA復(fù)合物，然后TFⅢC離開(kāi)DNA，以便不影響起始轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)錄5SrRNA的轉(zhuǎn)錄因子

TFⅢA、TFⅢB和TFⅢC。第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始二、轉(zhuǎn)錄的延伸轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)堿基為CAT，第一個(gè)堿基為A原核生物中，催化RNA合成的可能是β亞基在酶分子上有兩個(gè)核苷酸結(jié)合位點(diǎn)，一是起始核苷酸位點(diǎn)，一是延伸核苷酸位點(diǎn)。當(dāng)兩個(gè)位點(diǎn)都與模板互補(bǔ)的核苷酸結(jié)合后，第一個(gè)磷酸二酯鍵才能形成。延伸過(guò)程中需要對(duì)DNA超螺旋及雙螺旋狀態(tài)進(jìn)行改變，以利于轉(zhuǎn)錄。RNA合成的速度是40nt/s第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始二、轉(zhuǎn)錄的延伸三、轉(zhuǎn)錄的終止轉(zhuǎn)錄終止包括新生RNA鏈的釋放及RNA聚合酶與DNA解離。第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始二、轉(zhuǎn)錄的延伸三、轉(zhuǎn)錄的終止1.轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制1.轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制有兩類終止機(jī)制，依賴ρ因子和不依賴ρ因子終止。不依賴因子的終止，依靠終止子本身結(jié)構(gòu)終止。依賴ρ因子的終止機(jī)制(1)ρ因子分子量為46kDa,為六聚體，分子量為270kDa；(2)ρ因子與RNA聚合酶濃度比為1:10時(shí)，呈現(xiàn)最大活性；(3)ρ因子有依賴RNA

ATPase活性，RNA要大于50nt；(4)ρ因子在終止子上游的某一處與RNA結(jié)合；(5)原核生物中，轉(zhuǎn)錄與翻譯同時(shí)進(jìn)行，ρ因子的終止作用可被核糖體的存在而阻礙。第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制一、轉(zhuǎn)錄的起始二、轉(zhuǎn)錄的延伸三、轉(zhuǎn)錄的終止1.轉(zhuǎn)錄終止的機(jī)制2.抗終止作用（1)定義抗終止作用是一種基因表達(dá)的調(diào)控方式，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，RNA聚合酶閱讀通過(guò)終止子，繼續(xù)終止子下游的基因轉(zhuǎn)錄的現(xiàn)象。(2)發(fā)現(xiàn)抗終止作用首次發(fā)現(xiàn)于λ噬菌體。宿主RNA聚合酶首先轉(zhuǎn)錄兩個(gè)快早期基因，在抗終止作用下，轉(zhuǎn)而轉(zhuǎn)錄遲早期基因。這種轉(zhuǎn)變受N基因的控制。λ噬菌體及其抗終止作用（1)早期事件：早早期基因和晚早期基因的表達(dá)λ噬菌體λ噬菌體是大腸桿菌溫和噬菌體。λ噬菌體兩種感染方式：裂解周期和溶原當(dāng)λ噬菌體感染細(xì)胞，它可以選擇復(fù)制,最終裂解細(xì)胞(裂解周期)或者整合到基因組中成為潛伏(溶原）狀態(tài)。不管λ噬菌體是裂解還是溶原，感染的早期事件相同。λ噬菌體及其抗終止作用（1)早期事件：早早期基因和晚早期基因的表達(dá)感染后立即表達(dá)的基因?yàn)樵缭缙诨騈和cro

λ噬菌體進(jìn)入細(xì)胞及基因組環(huán)化后，啟動(dòng)子PL和PR被宿主RNA聚合酶啟動(dòng)。這些啟動(dòng)子位于基因cI基因兩側(cè)，轉(zhuǎn)錄是向外進(jìn)行的（即遠(yuǎn)離cI),分別在位于左側(cè)N基因和右側(cè)cro基因邊上的依賴ρ的轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)tL和tR1結(jié)束。TATAAT頭部基因尾部基因重組基因CⅢNcI

crocⅡOPQ

裂解基因

tL

PLPRtR1tR2NNNλ噬菌體感染后早期基因的表達(dá)。(1)起始，從啟動(dòng)子PL開(kāi)始的表達(dá)在tL終止，從PR開(kāi)始的右側(cè)表達(dá)在tR1（偶爾在tR2)終止，使早早期基因N和cro表達(dá)。(2)N是抗終止因子，允許通讀終止位點(diǎn)，因此晚早期基因表達(dá)，包括調(diào)節(jié)基因cⅡ和Q。圖中，環(huán)內(nèi)字母示意調(diào)節(jié)因子。λ噬菌體及其抗終止作用（1)早期事件：早早期基因和晚早期基因的表達(dá)抗終止因子N使晚早期基因表達(dá)

λ抗終止因子N允許從PL和PR開(kāi)始的轉(zhuǎn)錄越過(guò)終止位點(diǎn)。因此，一旦N被合成，從PL進(jìn)行的左側(cè)轉(zhuǎn)錄不僅使N基因，而且使cⅢ和一系列涉及重組功能的基因轉(zhuǎn)錄，而從PR進(jìn)行的右側(cè)右側(cè)轉(zhuǎn)錄不僅使

cro、cⅡ、O和P，而且還有調(diào)節(jié)晚期基因表達(dá)的Q表達(dá)。TATAAT頭部基因尾部基因重組基因CⅢNcI

crocⅡOPQ

裂解基因

tL

PLPRtR1tR2NNNλ噬菌體感染后早期基因的表達(dá)。(1)起始，從啟動(dòng)子PL開(kāi)始的表達(dá)在tL終止，從PR開(kāi)始的右側(cè)表達(dá)在tR1（偶爾在tR2)終止，使早早期基因N和cro表達(dá)。(2)N是抗終止因子，允許通讀終止位點(diǎn)，因此晚早期基因表達(dá)，包括調(diào)節(jié)基因cⅡ和Q。圖中，環(huán)內(nèi)字母示意調(diào)節(jié)因子。第五章轉(zhuǎn)錄第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子第二節(jié)啟動(dòng)子第三節(jié)終止子第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工rRNA和tRNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在著轉(zhuǎn)錄后加工

5’端為單磷酸，原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為三磷酸成熟分子比原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物小成熟分子含有異常堿基，原始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中沒(méi)有第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工1.rRNA的后加工rRNA（5S、16S和23S）和tRNA的基因混在一起排列在一個(gè)操縱子(rrn)中。大腸桿菌中有7個(gè)rrn操縱子。rrn中基因的排列規(guī)律16SrRNA、tRNA、23SrRNA、5SrRNA，最后為tRNA。中間的tRNA，7個(gè)rrn操縱子中，有4個(gè)為tRNA2GlU，其余的3個(gè)為tRNA1Trp和tRNA1Ala。rrn的位置多數(shù)位于復(fù)制起始點(diǎn)的兩側(cè)，轉(zhuǎn)錄方向與DNA的復(fù)制方向一致。rrn操縱子有兩個(gè)啟動(dòng)子，第一個(gè)為P1,位于16SrRNA序列上游300bp可能為主要的啟動(dòng)子。第二個(gè)啟動(dòng)子p2位于P1下游110bp。該操縱子轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物為30SRNA。

RNA聚合酶Ⅲ負(fù)責(zé)加工。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工1.rRNA的后加工2.tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工tRNA的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物要經(jīng)過(guò)多種加工處理后才能變?yōu)橛泄δ艿姆肿印Ｈ绱竽c桿菌的tRNA1Tyr。它由85個(gè)核苷酸組成。編碼基因有兩個(gè)拷貝，長(zhǎng)350個(gè)核苷酸。兩個(gè)基因拷貝間有200個(gè)核苷酸的間隔子。CCA有關(guān)的加工因CCA加工差異，可將tRNA基因分為兩種，一種具有CCA序列，稱為Ⅰ型；另一種沒(méi)有CCA序列，稱為Ⅱ型。Ⅰ型tRNA的CCA下游仍有一段序列，需在酶的作用下切除。Ⅱ型tRNA需在酶的作用下添加CCA序列。原核生物的tRNA多為Ⅰ型，少數(shù)噬菌體如T4為Ⅱ型。參與tRNA加工的酶

RNA酶P、RNA酶D、tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶和RNA酶Ⅲ。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工1.rRNA的后加工2.tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(1)RNA酶PRNaseP是一種內(nèi)切酶，能使tRNA操縱子和rRNA操縱子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的tRNA產(chǎn)生成熟的5′末端。RnaseP的組成含2個(gè)組份，一是20KDa的蛋白質(zhì)組份(C5蛋白)，一是由375個(gè)核苷酸組成的120KDa的RNA組分(M1RNA)。它們以緊密結(jié)合的核蛋白形式存在。這兩種組份高度保守，大腸桿菌的RNaseP成分可與人類的RNaseP成分能交叉重建為有活性的RNaseP。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工1.rRNA的后加工2.tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(1)RNA酶P功能該酶的專一性很強(qiáng)，只作用于tRNA前體，但無(wú)種屬特異性。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工1.rRNA的后加工2.tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(1)RNA酶P功能該酶的專一性很強(qiáng)，只作用于tRNA前體，但無(wú)種屬特異性。識(shí)別機(jī)制各種成熟的tRNA在5′端序列沒(méi)有同源性，但RNaseP均能使之產(chǎn)生正確的5′末端。因此，RNaseP識(shí)別的是tRNA的空間構(gòu)象，特別是5′端的構(gòu)象，并不識(shí)別切點(diǎn)附近的序列。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工1.rRNA的后加工2.tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(1)RNA酶P(2)RNA酶DRNaseD為核酸外切酶，能逐個(gè)切除tRNA3′多余的核苷酸，使CCA暴露。RNaseP存在時(shí)RNaseD可達(dá)最大活性。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工1.rRNA的后加工2.tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(1)RNA酶P(2)RNA酶D(3)tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶功能該酶能以ATP和CTP為前體，催化tRNA的3′端生成CCA。性質(zhì)該酶幾乎沒(méi)有種屬特異性。識(shí)別機(jī)制該酶識(shí)別tRNA的空間結(jié)構(gòu)。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工1.rRNA的后加工2.tRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(1)RNA酶P(2)RNA酶D(3)tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶(4)RNA酶ⅢRNaseⅢ和RNaseO、RNaseP2的功能相似，負(fù)責(zé)切開(kāi)間隔序列。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工二、真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工二、真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工1.rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工rRNA前體構(gòu)成真核生物有四種rRNA，即5.8SrRNA、18SrRNA、28SrRNA和5SrRNA。其中，前三者的基因組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄元，產(chǎn)生47S的前體，并很快轉(zhuǎn)變成45S前體。甲基化110多個(gè)甲基化位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中或以后被甲基化。甲基基團(tuán)主要是加在核糖上。18SrRNA上有39個(gè)，另外還有4個(gè)是在進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后甲基化的；74個(gè)在28SrRNA上。甲基化是45S前體上最終成為成熟rRNA區(qū)域的標(biāo)志。剪切剪切位點(diǎn)一個(gè)位于18SrRNA的5′邊，兩個(gè)位于18SrRNA和5.8SrRNA間的間隔區(qū)，另兩個(gè)位于5.8SrRNA和28SrRNA間的間隔區(qū)。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工二、真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工1.rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工2.mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工2.mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(1)加帽帽子結(jié)構(gòu)真核生物的帽子結(jié)構(gòu)可歸納為三種：m7GpppX為帽子0；m7GpppXm為帽1；m7GpppXmYm為帽3。帽子功能為核糖體識(shí)別mRNA提供信號(hào)；增加mRNA的穩(wěn)定性；與某些RNA病毒的正鏈RNA的合成有關(guān)。(2)加尾Poly(A)尾的性質(zhì)多數(shù)真核生物(酵母除外)的mRNA3′具有約為200bp長(zhǎng)的Poly(A)尾巴。Poly(A)尾巴不是由DNA所編碼，而是在轉(zhuǎn)錄后由RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶催化下，以ATP為前體，添加到mRNA的3′末端。poly(A)結(jié)合蛋白

poly(A)與poly(A)結(jié)合蛋白(PABP)結(jié)合。PABP的單體分子量為70KDa，可與poly(A)序列中的10～30個(gè)堿基結(jié)合。2.mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(2)加尾Poly(A)尾的性質(zhì)poly(A)結(jié)合蛋白R(shí)NA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶又稱為poly(A)聚合酶，分子量為300KDa。加尾識(shí)別位點(diǎn)與加尾機(jī)制

Poly(A)的添加位點(diǎn)并不在RNA轉(zhuǎn)錄終止的3′端，而是首先由一360KDa的內(nèi)切酶和其他因子識(shí)別切點(diǎn)上游13～20個(gè)堿基的AAUAAA和下游的GUGUGUG(有些情況例外)，然后切除一段序列，在此基礎(chǔ)上，由RNA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶催化添加Poly(A)。AAUAAA保守性很強(qiáng)，只有少數(shù)情況下有一個(gè)堿基的差異，這段序列的突變可阻止Poly(A)的形成。2.mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(2)加尾Poly(A)尾的性質(zhì)poly(A)結(jié)合蛋白R(shí)NA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶加尾識(shí)別位點(diǎn)和加尾機(jī)制

識(shí)別AAUAAA的特異因子由3個(gè)亞基組成，每個(gè)亞基均有和RNA非特異結(jié)合的能力，但單獨(dú)均沒(méi)有與AAUAAA特異結(jié)合的能力。三個(gè)亞基間的相互作用可能使其具備了特異識(shí)別AAUAAA的能力。特異因子與內(nèi)切酶及Poly(A)聚合酶形成復(fù)合物存在，由這一復(fù)合物先完成剪切過(guò)程，緊接著進(jìn)行Poly(A)的添加。2.mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(2)加尾Poly(A)尾的性質(zhì)poly(A)結(jié)合蛋白R(shí)NA末端腺苷酸轉(zhuǎn)移酶加尾識(shí)別位點(diǎn)和加尾機(jī)制

識(shí)別AAUAAA的特異因子Poly(A)聚合酶催化的加尾過(guò)程單獨(dú)的催化作用沒(méi)有特異性，與其他的兩個(gè)成分結(jié)合后才有特異性。Poly(A)聚合酶催化Poly(A)的生成可分為兩個(gè)階段，首先在mRNA的3′添加10個(gè)左右的Poly(A)，該過(guò)程嚴(yán)格依賴AAUAAA的存在，且是在特異因子的協(xié)助下完成的。第二個(gè)階段將Poly(A)尾延長(zhǎng)致全長(zhǎng)，這一過(guò)程不依賴AAUAAA，而是需要另外一個(gè)刺激因子識(shí)別已形成的Poly(A)并引導(dǎo)其延長(zhǎng)。2.mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工(2)加尾參與加尾的其他成分

U1snRNA(smallnuclearRNA),海膽12S因子(150kDa)Poly(A)功能

與mRNA的壽命有關(guān)。如去掉poly(A)的mRNA易被降解。但poly(A)的長(zhǎng)度與其壽命間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相關(guān)性。poly(A)與poly(A)結(jié)合蛋白的缺乏能阻止酶的水解。poly(A)的缺失可抑制體外翻譯的起始。Poly(A)的應(yīng)用

poly(A)在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中有很大的應(yīng)用價(jià)值。應(yīng)用mRNA的該特性，可用oligo(dT)為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；也可將oligo(dT)與載體相連，用于從總RNA中分離純化mRNA。第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工一、原核生物轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工二、真核生物的轉(zhuǎn)錄后加工1.rRNA的轉(zhuǎn)錄后加工2.mRNA的轉(zhuǎn)錄后加工3.后加工與mRNA的穩(wěn)定性3.后加工與mRNA的穩(wěn)定性(1)穩(wěn)定性與降解是一對(duì)矛盾，降解的酶是核酸酶核酸酶除參與后加工過(guò)程外，還負(fù)責(zé)過(guò)剩RNA的降解。(2)原核生物mRNA降解的方向?yàn)?′至3′，核酸酶E負(fù)責(zé)mRNA和小核糖體RNA的降解。(3)真核生物mRNA的穩(wěn)定性可能取決于去穩(wěn)定元件將這一元件與mRNA結(jié)合可引起該mRNA的降解。將一個(gè)去穩(wěn)定元件從mRNA分子中去掉，并不能增強(qiáng)其穩(wěn)定性，說(shuō)明可能在一個(gè)mRNA分子中有多個(gè)去穩(wěn)定元件。目前已發(fā)現(xiàn)了兩種類型的去穩(wěn)定元件。(4)不穩(wěn)定mRNA的結(jié)構(gòu)特征3′端區(qū)域有一約50堿基的富含AU的序列，稱為AU元件(AUrichelement,ARE)，其保守序列為AUUUA，重復(fù)七次。第五章轉(zhuǎn)錄第一節(jié)轉(zhuǎn)錄酶和轉(zhuǎn)錄因子第二節(jié)啟動(dòng)子第三節(jié)終止子第四節(jié)轉(zhuǎn)錄的機(jī)制第五節(jié)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的后加工第六節(jié)RNA的剪接第六節(jié)RNA的剪接不連續(xù)基因由編碼部分(外顯子)和不編碼部分(內(nèi)含子)組成。RNA剪接一個(gè)基因的外顯子和內(nèi)含子共同轉(zhuǎn)錄在一條轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，然后將內(nèi)含子去除而把外顯子連接起來(lái)形成成熟的RNA分子，這一過(guò)程稱為

RNA剪接(RNAsplicing)。5′剪接點(diǎn)或左剪接點(diǎn)內(nèi)含子上游的剪接點(diǎn)3′剪接或右剪接點(diǎn)內(nèi)含子下游方向的剪接點(diǎn)中部核心結(jié)構(gòu)在有些內(nèi)含子中，含有四個(gè)重復(fù)的保守序列，長(zhǎng)度為10～12個(gè)堿基。四個(gè)保守序列構(gòu)成一種二級(jí)結(jié)構(gòu)，在剪接中有重要作用，稱為中部核心結(jié)構(gòu)。第六節(jié)RNA的剪接第一類內(nèi)含子含有中部核心結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子稱為第一類內(nèi)含子(groupⅠ)，第一類內(nèi)含子在細(xì)胞器基因和核基因中都有，了解比較詳細(xì)的是纖毛原生動(dòng)物四膜蟲(chóng)(Tetrahymena)的rRNA的內(nèi)含子。第二類內(nèi)含子不含中部核心結(jié)構(gòu)的內(nèi)含子稱為第二類內(nèi)含子(groupⅡ)。如啤酒酵母線粒體細(xì)胞色素C氧化酶a亞基和b亞基的內(nèi)含子aI1、aI2、aI4和bI1。核基因mRNA前體的內(nèi)含子除含有第一類和第二類內(nèi)含子外，還有一種具有GAAT特征的邊界序列。tRNA基因的內(nèi)含子均位于反密碼環(huán)。剪接特點(diǎn)前三種內(nèi)含子在剪接機(jī)制上有共同的特點(diǎn)，而tRNA內(nèi)含子的剪接機(jī)制各有所異。不同的內(nèi)含子與外顯子的邊界序列有一定的共同特征。第六節(jié)RNA的剪接內(nèi)含子的去除及RNA的剪接基本有三種方式

在高等真核生物，核RNA內(nèi)含子的去