PCR技術(shù)分離目的基因課件

第二節(jié)PCR技術(shù)分離目的基因一PCR技術(shù)

1PCR的含義

PCR（polymerasechainreaction）：模仿細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的DNA復(fù)制過(guò)程，體外大量合成目的DNA片段，包括變性、退火、延伸三個(gè)步驟。2PCR反應(yīng)程序：（1）90－95℃模板變性（2）37－60℃引物與模板復(fù)性（退火）（3）70－75℃引物，合成模板鏈DNA的互補(bǔ)鏈循環(huán)25-35次加熱變性復(fù)性復(fù)溫DNA的變性和復(fù)性加熱或強(qiáng)酸、堿性作用可以使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂,雙鏈解離,形成單鏈DNA,這稱為DNA的變性。解除變性的條件后,變性的單鏈可以重新結(jié)合起來(lái),形成雙鏈,其原有的特性和活性可以恢復(fù),這稱DNA復(fù)性,也叫退火。

引物引物Mullis’ideaDNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年Taq

DNA聚合酶（thermusaquaticus)酶活性(%)溫度(℃)405060708090100100806040201988年Saiki等將耐熱DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技術(shù)PCR引物的設(shè)計(jì)原則:1.引物的特異性

引物與非特異擴(kuò)增序列的同源性不要超過(guò)70%或有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源。

2.長(zhǎng)度

寡核苷酸引物長(zhǎng)度為15~30bp。3.G+C含量

G+C含量一般為40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解鏈溫度，即在一定鹽濃度條件下，50%寡核苷酸雙鏈解鏈的溫度。Tm值最好接近72℃以使復(fù)性條件最佳。

4.堿基礎(chǔ)隨機(jī)分布

引物中四種堿基的分布最好是隨機(jī)的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不應(yīng)超過(guò)3個(gè)連續(xù)的G或C，因這樣會(huì)使引物在G+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。

5.引物自身

引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)牙引物本身復(fù)性。這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互補(bǔ)堿基不能大于3bp。

6.引物之間

兩引物之間不應(yīng)不互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3′端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一對(duì)引物間不應(yīng)多于4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。

ＲＴ－ＰＣＲ逆轉(zhuǎn)錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增RACE（RapidamplificationofcDNAends）cDNA末端的快速擴(kuò)增技術(shù)，是以mRNA為模板合成cDNA第一條鏈后用PCR技術(shù)擴(kuò)增出某個(gè)特異位點(diǎn)到3’或5’端之間未知序列的方法。3’-RACE5’-RACE目的基因的分離技術(shù)：基因文庫(kù)技術(shù)PCR技術(shù)插入突變法分離目的基因圖位克隆法分離目的基因（chromosomewalking）

酵母雙雜交技術(shù)分離目的基因

基因芯片技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)....第三節(jié)基因的化學(xué)合成在基因的化學(xué)合成中，首先要合成出有一定長(zhǎng)度的、具有特定序列結(jié)構(gòu)的寡核苷酸片段，然后再通過(guò)DNA連接酶的作用，使它們按照一定的順序共價(jià)地連接起來(lái)。目前已發(fā)展出來(lái)的有關(guān)寡核苷酸片段的化學(xué)合成方法有磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法，以及在后二者基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的固相合成法和自動(dòng)化法。磷酸二酯法（最早創(chuàng)立的DNA化學(xué)合成方法）基本原理：將兩個(gè)在5’或3’—末端各帶有適當(dāng)保護(hù)基團(tuán)的脫氧單核苷酸連接起來(lái)，形成一個(gè)兩端都被保護(hù)的二核苷酸