地中海貧血的分子基礎及產前診斷演示文稿

地中海貧血的分子基礎及產前診斷演示文稿當前1頁，總共66頁。優(yōu)選地中海貧血的分子基礎及產前診斷當前2頁，總共66頁。Thalassemia地中海貧血是全球最大的單基因遺傳病之一中國南方不同高發(fā)地區(qū)人群攜帶率1

~

23%研究背景當前3頁，總共66頁。全球血紅蛋白病人群負荷WHO地區(qū)人口(百萬)出生(百萬)純合子出生(千)非洲65030.0230美洲73017.55.0亞洲315084.0120.0歐洲78011.01.6大洋洲300.50.2合計5340143.0356.8當前4頁，總共66頁。中國南方地中海貧血人群攜帶率

地區(qū)攜帶率(%)

地貧β地貧

廣東8.532.54

廣西14.956.78

四川1.922.18

臺灣4.201.10

香港5.023.41Xu,etal.JClinPathol2004,57:517-22.

Cai,etal.ChiJEpidemiol

2002,23:281-5.

當前5頁，總共66頁。排序出生缺陷分析例數(shù)發(fā)生頻率(/萬)1先天性心臟病26019.662重型地貧20815.733多指20015.124肢體短縮1118.395唇裂/腭裂1098.24廣州市主要出生缺陷的發(fā)生率(1998-2001)

當前6頁，總共66頁。Pedigreefor-thalassemiainatypicalfamily.地中海貧血:常染色體隱性遺傳病當前7頁，總共66頁。地貧是嚴重致死、致殘性遺傳性血液病常染色體隱性遺傳病受累基因：地貧-珠蛋白基因（16p13.3）

β地貧-β珠蛋白基因（11p15.3）突變純合子：重型地貧-致死

中間型地貧

-致殘病理學基礎：/β鏈比例失衡當前8頁，總共66頁。地貧純合子：致死性出生缺陷重型地貧:胎兒水腫綜合征

早產死胎或出生前后死亡

可導致嚴重產科并發(fā)癥

無理想治療方法重型地貧

出生后1年內發(fā)病

多于未成年前因嚴重貧血而夭折

輸血和去鐵治療可維持,代價昂貴當前9頁，總共66頁。家系樣品采集現(xiàn)場中間型地貧是嚴重致殘性遺傳病當前10頁，總共66頁。研究地中海貧血的意義

重癥地貧患兒的出生是世界公認的公共衛(wèi)生問題

通過產前診斷阻止重癥患兒出生是首選預防措施

WHO優(yōu)先推薦在發(fā)展中國家實施預防的遺傳性疾病

預防地貧是中國南方高發(fā)區(qū)減少出生缺陷的戰(zhàn)略需求研究背景當前11頁，總共66頁。中國需要解決的研究主題

發(fā)展用于臨床和預防的分子診斷技術

高發(fā)地區(qū)人群中的遺傳流行病學調查

開展人群水平的地中海貧血預防當前12頁，總共66頁。指導制定計劃大人群監(jiān)控和預防用于基因分型用于產前診斷

診斷篩查預防地中海貧血的研究策略研究背景遺傳流行病學調查建立一系列診斷標準和診斷技術當前13頁，總共66頁。地中海貧血的臨床特征小細胞低色素性溶血型貧血(中、重度)黃疸肝脾腫大(脾大明顯)骨髓擴增發(fā)育遲緩合并感染Bart’s水腫胎(α地貧,宮內或出生后半小時內死亡)當前14頁，總共66頁。地中海貧血的血液學表型特征

RBC參數(shù)

MCVMCH

細胞形態(tài)變化

Hb電泳分析

HbA2

()或()HbBart’sHbH()HbE()當前15頁，總共66頁。地貧血象：紅細胞著色不足、異形紅細胞和骨髓成紅血細胞增多癥當前16頁，總共66頁。血紅蛋白電泳圖譜123451.正常人HB2.輕型地貧3.異常HBE雜合子4.新生兒HBBart’s(地貧標準型）5.HBHNormalAA2AEBart’sAFHA+-500V,25min當前17頁，總共66頁。地貧發(fā)生的分子病理學經典機制

α地貧:基因缺失使基因功能丟失地貧:結構基因變異使轉錄異常當前18頁，總共66頁。

-50kb-10kb0kb10kb20kb30kb

(--SEA)Deletion(-

4.2)Deletion(-

3.7)Deletion21導致α地貧的不同類型的基因缺失當前19頁，總共66頁。α

GlobingenesaffectedbythalassemiadeletionSilentcarrierThalassemiatraitHbHdiseaseHydropsfetalisNormal當前20頁，總共66頁。α地貧疾病嚴重程度的單倍型順序21T

2–

–1

2T1

–1T

––當前21頁，總共66頁。Hematologicaldataoftheproposituseandherfamilymembers.

Ι1Ι2Ⅱ1Ⅱ2Ⅱ3Ⅱ4Ⅱ5Ⅲ1Ⅲ2Sex/age(Y)F/49M/54M/33F/27F/25M/22F/35F/1M/5Hb(g/L)118150173126135135118112141RBC(×1012)5.634.965.706.234.514.575.876.095.02MCV(fL)64.585.788.162.187.882.363.056.278.5MCH(pg)21.030.230.420.229.929.520.118.428.1HbA(%)97.897.593.197.096.695.796.990.097.4HbA2(%)2.202.503.272.983.373.283.122.182.65HbF(%)003.6200007.790Genotype--11.1/ααΑα/ααΑα/αα--11.1/ααΑα/ααΑα/αα--11.1/αα--11.1/ααΑα/αα當前22頁，總共66頁。JiaSQ,etal.JClinPathol,2004;57:164-7.

當前23頁，總共66頁。DifferentpointmutationsreducingglobingeneexpressionEXON1IVS1

EXON2EXON3

IVS2PromotermutationRNAsplicingInitiationmutationFrameshiftNonsensePoly(A)signalRund.&Rachmilewitz.N.Engl.J.Med.

2005,353:1135-46.

當前24頁，總共66頁。世界上不同種族的常見β地貧突變類型

種族突變類型

地中海人

IVS-1,position110(GA)CD39,nonsense(CAGTAG)IVS-1,position1(GA)IVS-2,position745(CG)IVS-1,position6(TC)IVS-2,position1(GA)黑人

29,(AG);88,(CT)Poly(A),(AATAAAAACAAA)當前25頁，總共66頁。東南亞人,中國人

CD41-42,Frameshift(CTTT)IVS-2,position654(CT)

28,(AG);HbE(GA)CD17,nonsense(AAGTAG)IVS-1,position5(GC)亞洲印地安人

IVS-1,position5(GC)619-bpdeletionCD8-9,Frameshift(+G)IVS-1,position1(GT)CD41-42,Frameshift(CTTT)當前26頁，總共66頁。SexProbandfemale

Motherfemale

Father

maleBrothermale

Husband

maleRBC(x1012)5.7

4.84.75.86.4Hb(g/L)

139

105154144145MCV(fl)

73.6

68.288.273.467.1MCH(pg)23.6

21.833.024.722.8MCHC(g/L)

357

320374336340RDW(%)

0.149

0.1520.1320.1440.159HbA(%)

94.3

93.697.294.097.1HbA2(%)

5.7

6.42.86.02.9Genotype

β-90/βN

β-90/βNβN/βNβ-90/βNβN/βNβ/αratio

2.130

2.2193.7162.2385.341Resultsofbloodanalysis,DNAdiagnosisandmRNAdetectioninthefamilymembers.當前27頁，總共66頁。Sequencingofthe-globingeneamplifiedfromtheprobandHeterozygosityfortheCTsubstitutionatposition-90oftheβ-globingene當前28頁，總共66頁。近年來發(fā)現(xiàn)的部分中國南方新突變基因

突變α珠蛋白基因11.1大片段缺失α珠蛋白基因

2CD118(+TCA)β珠蛋白基因

90(C→T)β珠蛋白基因73(A→T)β珠蛋白基因28(A→C)β珠蛋白基因

CDs15/16(+G)β珠蛋白基因CD38(A)當前29頁，總共66頁。地中海貧血的產前診斷

胎兒取樣技術

DNA診斷技術

-地貧的診斷-地貧的診斷當前30頁，總共66頁。羊膜穿刺(amniocentesis)

抽取胎兒樣品示意圖當前31頁，總共66頁。植入前基因診斷

Preimplantationgeneticdiagnosis(PGD)超聲產前診斷

Prenataldiagnosis:Ultrasoundmeasurement

母體外周血分離胎兒細胞進行產前診斷

Prenataldiagnosis:Fetalcellsinthematernalcirculation母體血漿或血清中胎兒DNA分析

AnalysisoffetalDNAinmaternalplasmaandserum目前及今后的胎兒產前診斷新技術當前32頁，總共66頁。DingC,ChiuRW,LauTK,LeungTN,ChanLC,ChanAY,CharoenkwanP,NgIS,LawHY,MaES,XuX,WanapirakC,SanguansermsriT,LiaoC,AiMA,ChuiDH,CantorCR,LoYM.

MSanalysisofsingle-nucleotidedifferencesincirculatingnucleicacids:Applicationtononinvasiveprenataldiagnosis.

ProcNatlAcadSciUSA.200420;101(29):10762-7.當前33頁，總共66頁。單堿基延伸產物的質譜分析MFF父親的突變類型SABER:singleallelebaseextensionreaction當前34頁，總共66頁。分子量FMStandardprotocol

SABERprotocol在母血漿DNA中排除父親的β地貧突變——++雙親基因型不同：當前35頁，總共66頁。CaseCD41/42-CTTTIVS2654CTnt–28AGCD17ATStandardprotocolSABERFetalgenotypeWeeksgestation1FMN/N112FMN/N183F

MN/N214MFF

/N185MF

F

/M176FM

F/N117FM

F/N148FN/N79

FF/N1210MF

N/N1711F

F/N2012M&FN.A.N.A.N/N18鑒定母血漿DNA中的父親β地貧突變當前36頁，總共66頁。單倍型分析用于鑒定母血漿DNA中的父親等位基因CaseMotherFatherHBBmutantalleleHBBWTalleleSNPGallelePaternalHBBmutationFetalHBBgenotype3CCGCGC

N/N11CCGCGC

F/N12CCGCGC

N.A.N/N當前37頁，總共66頁。地中海貧血的產前診斷

胎兒取樣技術

DNA診斷技術

-地貧的診斷-地貧的診斷當前38頁，總共66頁。DNA診斷技術多重PCR（multiplexPCR）等位基因特異性性寡核苷酸雜交（ASO）反向點雜交（RDB）變性高效液相色譜（DHPLC）基于微孔板

(microtiterwell-based)高通量檢測

實時PCR(real-timePCR)當前39頁，總共66頁。

-50kb-10kb0kb10kb20kb30kb

(--SEA)Deletion(-

4.2)Deletion(-

3.7)Deletion21導致α地貧的不同類型的基因缺失當前40頁，總共66頁。Locationofprimersanddetectionof--SEAdeletionbygap-PCR當前41頁，總共66頁。Genotypingofthe--SEAallelesbyGap-PCR

當前42頁，總共66頁。ChongSS,etal.Blood.2000;95(1):360-2.當前43頁，總共66頁。寡核苷酸探針雜交技術當前44頁，總共66頁。ASO探針檢測

-地貧基因診斷結果當前45頁，總共66頁。PCRBBBBBBgDNAHybridizationDetectionStreptavidin-PODColorSignalMMembraneASONMNMNMSubstrate(TMB)反向點雜交技術當前46頁，總共66頁。RDBanalysis:applicationtorapidprenataldiagnosisforeightβthalassaemiamutations.GenotypeFatherCDs41-42(CTTT)/NMotherIVS-2-654(CT)/NFetusCDs41-42/IVS-2-654Normalcontrol

N/N當前47頁，總共66頁。Human-globingeneandthePCRamplicons5’UTREXON1IVS1EXON2IVS2IVS2EXON33’UTRFA(453bp)FB(364bp)FC(423bp)-90,-73,-29,-28cd2cd13-14,cd14-15,cd15-16,cd17cd26,cd27-28IVS1-1,IVS1-5cd37,cd38cd41-42,cd43cd71-72IVS2-5,IVS2-16IVS2-654,IVS2-666當前48頁，總共66頁。FragmentMutationpatternsNormalpatternsTotalMutationMutation+SNPHeterozygousHomozygousFA12221237FB5152224FC03227Total1740566868uniquelyprofiledDHPLCpatternsobservedfrom795DNAsamples當前49頁，總共66頁。實驗結果當前50頁，總共66頁。實驗結果當前51頁，總共66頁。實驗結果當前52頁，總共66頁。實驗結果當前53頁，總共66頁。實驗結果當前54頁，總共66頁。中國南方和β地中海貧血的預防計劃人群篩查預防計劃的策略

醫(yī)院水平(Hospital-based)的預防計劃

社區(qū)水平(community-based)的預防計劃

家系擴展篩查(screeningextendedfamilies)當前55頁，總共66頁。Carrierscreeningforandthalassemiainpregnancy:theresultsofan11-yearprospectiveprograminGuangzhouMaternalandNeonatalHospitalGuangzhouMaternalandNeonatalHospitalLiaoCLiJHuangYNLiQMFengQZhongHZCuiYYSouthernMedicalUniversityMoQHLiLYHuaLZhangJZZengRJiaSQXuXMPrenatDiagn2004,25:163-71當前56頁，總共66頁。地貧攜帶者篩查及產前診斷流程被檢對象（婚前或孕中期）血液學分析（MCV，HbA2變化）排除地貧地貧攜帶者遺傳咨詢，配偶檢查血液學分析（MCVHbA2變化）地貧攜帶者排除地貧遺傳咨詢雙親基因分析胎兒產前診斷當前57頁，總共66頁。年份篩查廣州總篩查孕婦數(shù)孕婦數(shù)丈夫數(shù)

篩查發(fā)現(xiàn)的檢測出的完成的產前陽性孕婦數(shù)陽性夫婦數(shù)診斷數(shù)α地貧

(%)β地貧(%)α地貧(%)β地貧(%)α/β地貧(%)α地貧(%)β地貧(%)1993398968393350232(5.8)129(3.2)13(3.7)8(2.3)10(2.9)12(92.3)7(87.5)1994456471617421265(5.8)164(3.6)18(4.3)8(1.9)9(2.1)16(88.9)8(100)1995390271751361227(5.8)142(3.6)17(4.7)7(1.9)12(3.3)15(88.2)7(100)1996499474460464285(5.7)181(3.6)19(4.1)8(1.7)12(2.6)17(89.5)8(100)1997439271989401250(5.7)158(3.6)21(5.2)7(1.7)10(2.5)18(85.7)7(100)1998453275378425263(5.8)172(3.8)17(4.0)8(1.9)12(2.8)17(100)8(100)1999501680141465285(5.7)186(3.7)24(5.2)8(1.7)14(3.0)23(95.8)8(100)OutcomesofscreeningprograminGZMNH1993-2003

當前58頁，總共66頁。年份篩查廣州總篩查孕婦數(shù)孕婦數(shù)丈夫數(shù)

篩查發(fā)現(xiàn)的檢測出的完成的產前陽性孕婦數(shù)陽性夫婦數(shù)診斷數(shù)α地貧

(%)β地貧(%)α地貧(%)β地貧(%)α/β地貧(%)α地貧(%)β地貧(%)2000449281817418256(5.7)172(3.8)21(5.0)7(1.7)16(3.8)21(100)7(100)2001452180152411254(5.6)164(3.6)17(4.1)8(1.9)12(2.9)17(100)8(100)2002469580667415260(5.6)163(3.4)16(3.9)8(1.9)11(2.7)16(100)8(100)2003412486393372227(5.5)152(3.6)15(4.0)6(1.6)13(3.5)15(100)6(100)Total49221

860758

4503

2804(5.7)

1783(3.6)

198(4.4)

83(1.8)

131(2.9)

187(95.8)

82(98.8)

(cont’d)當前59頁，總共66頁。診斷結果基因型例數(shù)正常

30雜合子(total)35CDs41-42(TCTT)/N14IVS-2-654(C>T)/N8-28(A>G)/N5CD17(A>T)/N3CD26(G>A)/N2-29(A>G)/N1CDs27-28(+C)/N1Unknown/NorNormal1Prenataldiagnosisin83fetusesat-riskforthalassemia當前60頁，總共66頁。診斷結果基因型例數(shù)純合子或雙重雜合子(總數(shù))18CDs41-42(TCTT)/IVS-2-654(C>T)6CDs41-42(TCTT)/-28(A>G)4CDs41-42(TCTT)/CD17(A>T)2IVS-2-654(C>T)/CD17(A>T)2CDs41-42(TCTT)/CDs41-42(TCTT)1CDs41-42(TCTT)/CDs27-28(+C)1IVS-2-654(C>T)/CDs71-72(+A)1IVS-2-654(C>T)/CD43(G>T)1總數(shù)83(cont’d)當前61頁，總共66頁。胎兒診斷

產前診斷例數(shù)

α地貧β地貧

總數(shù)

(%)

正常413069(25.6)攜帶者9235125(46.3)受累胎兒*541872(26.