qPCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR課件

1.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)原理及特點(diǎn)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是將熒光能量傳遞技術(shù)(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)應(yīng)用于常規(guī)PCR儀中,指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)或熒光染料,利用熒光信號(hào)積累,從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過(guò)程,最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板濃度進(jìn)行定量分析的方法。1.1

基本原理

在實(shí)時(shí)熒光定量PCR中,對(duì)整個(gè)PCR反應(yīng)擴(kuò)增過(guò)程進(jìn)行了實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)和連續(xù)地分析擴(kuò)增相關(guān)的熒光信號(hào),隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,監(jiān)測(cè)到的熒光信號(hào)的變化可以繪制成一條曲線。

在PCR反應(yīng)早期,產(chǎn)生熒光的水平不能與背景明顯地區(qū)別,而后熒光的產(chǎn)生進(jìn)入指數(shù)期、線性期和最終的平臺(tái)期。FQ-PCR可行性定量是在PCR擴(kuò)增的指數(shù)期進(jìn)行的。首先需設(shè)定一定熒光信號(hào)的域值,一般這個(gè)域值是以PCR反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為熒光本底信號(hào),熒光域值的缺省設(shè)置是3~15個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。域值→Ct↑

如果檢測(cè)到熒光信號(hào)超過(guò)域值則被認(rèn)為是真正的信號(hào),它可用于定義樣本的域值循環(huán)數(shù)(Ct)。

Ct(cyclethreshold)值的含義是:每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。

研究表明,每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系,Ct值隨著起始模板量的增加而線性降低,利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值。因此只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。(2)TaqMan熒光探針:該探針是一種寡核苷酸探針。

PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針,兩端分別標(biāo)記一個(gè)熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅基團(tuán)。當(dāng)探針與靶序列配對(duì)時(shí),熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收。PCR擴(kuò)增時(shí),Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解,使熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離,從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào),即每擴(kuò)增一條DNA鏈,就有一個(gè)熒光分子形成,實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。1.3

特點(diǎn)

一般PCR產(chǎn)物都需要經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳和溴化乙錠（EB）染色紫外光觀察結(jié)果或通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染檢測(cè),不僅需要多種儀器,而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力,所使用的染色劑溴化乙錠對(duì)人體又有害處,在這繁雜的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中會(huì)帶來(lái)假陽(yáng)性的污染。而熒光定量PCR克服了常規(guī)PCR的許多缺點(diǎn),有著如下顯著的優(yōu)點(diǎn):(1)特異性好。使用針對(duì)靶序列設(shè)計(jì)的特異性探針對(duì)定量分子進(jìn)行識(shí)別,具有很高的準(zhǔn)確性。同時(shí),靶序列由引物和探針雙重控制,特異性好、假陽(yáng)性低。(2)靈敏度高。熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)是綜合了PCR技術(shù)、熒光標(biāo)記技術(shù)、激光技術(shù)、數(shù)碼顯像技術(shù)為一體的技術(shù),因此大大提高了其檢測(cè)靈敏度。(3)線性關(guān)系好、線性范圍寬。由于熒光信號(hào)的產(chǎn)生和每次擴(kuò)增產(chǎn)物成一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系,通過(guò)熒光信號(hào)的檢測(cè)可以直接對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量。(4)操作簡(jiǎn)單、安全、自動(dòng)化程度高、防污染。擴(kuò)增和檢測(cè)在全封閉的同一管內(nèi)檢測(cè),不需要開蓋,降低了溴化乙錠的污染。同