常見微生物培養(yǎng)檢測技術

（優(yōu)選）常見微生物培養(yǎng)檢測技術當前1頁，總共40頁。細菌培養(yǎng)方式用人工方法,將細菌從自然界、動物體或病料中分離出來,研究細菌的形態(tài)、生理特性、生物學特性或制取細菌的某種代謝產(chǎn)物等,這對于傳染病的診斷和防治具有重要意義。根據(jù)不同標本及不同培養(yǎng)目的,可選用不同的接種和培養(yǎng)方法。常用的有分離培養(yǎng)和純培養(yǎng)兩種方法。當前2頁，總共40頁。(一)培養(yǎng)基的種類和常用培養(yǎng)基培養(yǎng)基的概念：將細菌所需的各種營養(yǎng)物質按一定比例混合在一起,并調節(jié)到適宜的PH,這種人工配制的適合細菌生長繁殖的細菌營養(yǎng)物,稱為培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制原則：培養(yǎng)基組分應適合細菌的營養(yǎng)特點營養(yǎng)營養(yǎng)協(xié)調理化條件適宜經(jīng)濟節(jié)約無菌當前3頁，總共40頁。1.培養(yǎng)基的種類按培養(yǎng)基的組成成分分類合成培養(yǎng)基、天然培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分類液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基按培養(yǎng)基的功能分類基礎培養(yǎng)基、營養(yǎng)培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基、選擇培養(yǎng)基、厭氧培養(yǎng)基。當前4頁，總共40頁。(1)基礎培養(yǎng)基含有培養(yǎng)一般細菌的最基本成分。又分為:液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基和半固體培養(yǎng)基三種。在液體(肉湯)培養(yǎng)基中,加入2%-3%瓊脂即為固體培養(yǎng)基,加入0.2%-0.5%瓊脂即為半固體培養(yǎng)基。當前5頁，總共40頁。(2)營養(yǎng)培養(yǎng)基于基礎培養(yǎng)基中加入高營養(yǎng)物質如葡萄糖、血液、血清、腹水、生長因子等,以滿足營養(yǎng)要求較高的細菌生長需要有的細菌還需加入特殊物質,如結核桿菌需加入雞蛋清、馬鈴薯、甘油等才能良好生長當前6頁，總共40頁。(3)選擇培養(yǎng)基利用細菌對某種物質敏感程度的不同,可在培養(yǎng)基中加入抑制某些細菌生長的藥物,而選擇性地讓欲分離的細菌旺盛生長的培養(yǎng)基,如膽鹽和薔薇色酸可以選擇性地抑制G+菌的生長,而不影響G－菌的生長。在培養(yǎng)基中加入二藥后可選擇性地分離出腸道桿菌。當前7頁，總共40頁。(4)鑒別培養(yǎng)基利用細菌分解底物及其代謝產(chǎn)物的不同,可在培養(yǎng)基中加入某種物質和指示劑,即制為鑒別培養(yǎng)基,以測定不同細菌的生化反應。紫黑色,具有金屬光澤的菌落麥康凱平板：紅色菌落當前8頁，總共40頁。(5)厭氣培養(yǎng)基將培養(yǎng)基與空氣及氧隔離,或降低培養(yǎng)基中的氧化還原電勢,供厭氧菌生長。除去培養(yǎng)基中氧的方法：降低培養(yǎng)基中氧化還原電勢：如肝湯或加入谷胱甘肽、硫基醋酸鹽等?；先パ醴ǎ喝缃剐詻]石子酸、好氧厭氧菌混合、種子發(fā)芽等。隔絕阻氧法：如液體石臘等。當前9頁，總共40頁。(二)細菌在培養(yǎng)基上的生長特征有關概念菌落:在固體培養(yǎng)基上,由單個細胞繁殖形成的肉眼可見的細菌集落,稱為菌落。菌苔:在固體培養(yǎng)基上,大量菌落密集生長,融合成一片,稱為菌苔。純培養(yǎng):挑取一個菌落到另一培養(yǎng)基桑培養(yǎng),稱為純培養(yǎng)。不同的微生物種類,其菌落特征不同。同一種菌在不同培養(yǎng)條件下菌落特征也不盡相同,細菌的生長特征有助于細菌的鑒定。當前10頁，總共40頁。細菌分離培養(yǎng)形式及培養(yǎng)結果當前11頁，總共40頁。細菌細胞壁的主要成分是:肽聚糖(peptidoglycan),又稱為粘肽(mucopeptide)或胞壁質(murein)。

丹麥病理學家革蘭(HansChristianGram)為證實病組織切片中有細菌存在,在1884年介紹了脫色后再進行復染的鑒別染色法,后來被稱為革蘭染色法革蘭陽性菌G＋(Grampositivebacteria)革蘭陰性菌G－(Gramnegativebacteria)涂片結晶紫染色碘液媒染酒精脫色復紅復染通過革蘭氏染色法可將細菌分為G＋菌(藍紫色)和G－菌(紅色)兩大類型。主要區(qū)別在于細胞壁結構不同。當前12頁，總共40頁。致病菌的檢驗程序標本直接涂片檢查分離培養(yǎng)分子生物學技術(核酸雜交、PCR)生化試驗血清學試驗動物試驗藥敏試驗其它(HPLC)當前13頁，總共40頁。細菌藥敏試驗結果同一細菌對不同抗生素的敏感性不同細菌對相同抗生素的敏感性當前14頁，總共40頁。病毒病毒(Virus)：是形體微小、結構簡單、僅含有一種核酸（DNA或RNA），能夠通過細菌濾器,具有超級寄生性（嚴格的細胞內寄生），且必須在電子顯微鏡下才能觀察到的一類非細胞形微生物。1892年，伊萬諾夫斯基和貝杰林克，煙草花葉病毒，開創(chuàng)了病毒學獨立發(fā)展的歷程。當前15頁，總共40頁。沒有細胞結構可以透過細菌濾器只含一種核酸（DNA或RNA）嚴格細胞內寄生增殖方式為核酸復制對干擾素敏感，對抗生素不敏感病毒的基本特征當前16頁，總共40頁。（一）病毒的感染病毒與細胞相互作用稱為病毒的感染。1.溶解性相互作用：病毒增殖,宿主細胞被破壞或溶解,也可不破壞細胞,形成穩(wěn)定狀態(tài)感染。2.轉化性相互作用：病毒基因組與宿主細胞基因組整合,引起宿主細胞發(fā)生轉化。有些非但抑制宿主細胞的生物合成,反而促進細胞分裂增生,導致腫瘤或細胞癌變。病毒的增殖當前17頁，總共40頁。（二）病毒的增殖病毒自身無完整的酶系統(tǒng),不能進行獨立的物質代謝,必須在活的宿主細胞內才能進行生活、復制和增殖由宿主細胞供應原料、能量和生物合成場所,在病毒核酸遺傳密碼的控制下,于宿主細胞內復制出病毒的核酸和合成病毒的蛋白質,進一步裝配成大量的子代病毒,并將他們釋放到細胞外,這種增殖方式稱為復制當前18頁，總共40頁。病毒的復制周期（ReplicativeCircle）定義：自病毒吸附于細胞開始，到子代病毒從感染細胞釋放到細胞外的病毒復制過程稱為病毒的復制周期。病毒的復制增殖過程,大致包括吸附、穿入、脫殼、生物合成、裝配和釋放六個步驟。當前19頁，總共40頁。當前20頁，總共40頁。當前21頁，總共40頁。當前22頁，總共40頁。Replicationofvirulentphage當前23頁，總共40頁。Lysogenicinfection當前24頁，總共40頁。1、吸附需要病毒表面特異性的吸附蛋白(VAP)與細胞表面受體(也稱為病毒受體)相互作用,是決定感染成功與否的關鍵環(huán)節(jié)。細胞膜受體有脂蛋白受體和粘蛋白受體兩種,除具有病毒吸附部位外,尚有促進病毒感染的作用。病毒的細胞受體具有種系和組織特異性,決定了病毒的宿主譜。當前25頁，總共40頁。2、穿入(侵入)病毒吸附于細胞膜后,細胞膜受體和鄰近部位的膜發(fā)生折疊,將病毒吞陷,吞飲于泡內(牛痘病毒);或通過病毒與宿主細胞膜的融合進入細胞漿中(皰疹病毒);無包膜病毒則直接穿過細胞膜而入細胞(呼腸孤病毒);當前26頁，總共40頁。直接進入(裸露病毒)膜融合(包膜病毒)胞飲(包膜病毒)當前27頁，總共40頁。3、脫殼

感染性核酸從衣殼內釋放出來的過程。有包膜病毒脫殼包括脫包膜和脫衣殼兩步,無包膜病毒只需脫衣殼,方式隨不同病毒而異。

病毒衣殼的脫落和核酸的逸出,主要在細胞漿(RNA病毒)或細胞核(DNA病毒)內完成。當前28頁，總共40頁。4、生物合成

病毒進入宿主細胞后生物合成階段,胞漿中無病毒顆粒,稱為隱蔽期(eclipse)。病毒的生物合成過程分早期和晚期兩個階段：1.早期:主要是由核酸(DNA或RNA)通過mRNA制造酶類蛋白質代謝工具和核酸基因組需要的核苷酸原料；2.晚期:主要是通過晚期mRNA合成病毒結構蛋白質。當前29頁，總共40頁。5、裝配多數(shù)DNA病毒在細胞核內合成裝配,RNA病毒在細胞漿內合成裝配。當前30頁，總共40頁。6、釋放有的病毒聚積在細胞空泡內后通過細胞通道向外溢出;有的依靠細胞膨脹破裂放出;有的則因細胞感染病毒后死亡裂解或自溶而釋出。有囊膜的病毒多數(shù)借出芽而穿出細胞游離。當前31頁，總共40頁。一、動物接種動物選擇標準:對病毒的易感性高;動物健康,體重、年齡盡可能一致,最好使用相應的等級實驗動物,并符合所要培養(yǎng)病毒的要求;盡量使用遺傳特性相似,個體差異較小,生物學反應比較一致的動物;外購動物,接種前要經(jīng)過健康觀察,以免誤用帶有病原體動物?？筛鶕?jù)病毒性質、材料性質和目的不同,采取皮下接種法、皮內接種、肌肉接種、靜脈接種、腹腔接種法、腦內接種法。當前32頁，總共40頁。二、禽胚培養(yǎng)理想的禽胚為SPF雞胚。常用非免疫雞胚加以補充,這種蛋應無特定病原的母源抗體,否則會影響病毒在胚內增殖。此外,不同病原對禽胚的適應性也不同,如狂犬病和減蛋綜合征病毒在鴨胚中比雞胚中更易增殖,雞傳染性喉氣管炎病毒只能在雞和火雞胚內增殖,實際應用時而加以嚴格選擇。常用的接種途徑有絨毛尿囊膜法、尿囊腔法、羊膜腔法和卵黃囊法四種,根據(jù)不同的病毒和不同的目的采用適宜的接種途徑。當前33頁，總共40頁。絨毛尿囊膜接種(10-13日齡胚)尿囊腔接種(9-11日齡胚)羊膜腔接種(10-12日齡胚)卵黃囊接種(5-8日齡胚)禽胚接種術式當前34頁，總共40頁。雞胚不同接種途徑與收獲比較接種途徑日齡方法破殼部位接種量(ml)收獲尿囊膜10-13開蛋窗及人工氣室或鉆孔絨毛尿囊膜發(fā)育中心及氣室0.05-0.1擴大蛋窗、收集接種部絨毛尿囊膜尿囊腔9-11鉆孔胚胎面與氣室交界邊緣上、下約1mm處0.1-0.2破氣室,收集尿囊液(5-8ml)羊膜腔10-12開蛋窗氣室端靠近胚胎側0.1-0.2擴大蛋窗,收集尿囊液及羊水卵黃囊5-8鉆孔氣室中心0.2-0.5破氣室,收集去卵黃的卵黃囊或雞胚體當前35頁，總共40頁。影響禽胚病毒增殖的因素1.種蛋質量:SPF種蛋最理想,其次是非免蛋,普通種蛋不能用。病原微生物:家禽有很多疫病可經(jīng)垂直傳遞于雞胚,這些病原體既可污染制品本身,又可影響接種病毒在雞胚內增殖母源抗體:種蛋帶有母源抗體,影響病毒在雞胚內增殖抗生素:家禽混合飼料中常含有一定的抗生素,這種微量的抗生素可以傳遞給蛋胚殘留當前36頁，總共40頁。2.孵化技術:適宜的孵化條件有利于病毒增殖溫度:通常適宜溫度為37-39.5℃。寧低勿高。濕度:雞胚孵化標準為53%-57%,水禽胚孵化比雞胚高5%-10%。通風:發(fā)育過程中吸入氧氣排出二氧化碳,隨胚齡增長需更換孵化機內空氣。轉蛋:大頭向上垂直放置入孵,在孵化過程中定期轉蛋,使胚胎受熱均勻,防止胚胎與蛋殼粘連3.接種技術:不同病毒的增殖有不同的接種途徑,同一種病毒接種不同日齡禽胚獲得的病毒量也不同。同時,接種操作應嚴格按照規(guī)定,不應傷及胚體和血管,以免影響其發(fā)育,使病毒增殖速度降低或停止。當前37頁，總共40頁。細胞培養(yǎng)從廣義上講是體外培養(yǎng)之一。體外培養(yǎng)包括器官培養(yǎng)、組織培養(yǎng)和細胞培養(yǎng)。器官培養(yǎng)常指對未分散組織進行培養(yǎng),可保留部分或全部組織在機體中的組織形態(tài)。組織培養(yǎng)是指從體內取出組織,模擬體內生理環(huán)境,在無菌、適當溫度和一定營養(yǎng)條件下,使之生存和生長,并維持其結構和功能的方法。細胞培養(yǎng)是指利用機械、酶或化學方法使動物組織或傳代細胞分散成單個乃至2－4個細胞團懸液進行培養(yǎng)。根據(jù)培養(yǎng)細胞的染色體和繁殖特性,細胞可分為三類,即原代細胞、細胞株和細胞系。三、組織培養(yǎng)當前38頁，總共40頁。多數(shù)病毒在敏感細胞增殖可引起細胞代謝等方面的變化,發(fā)生形態(tài)改變,如變圓、拉長、聚集和融合等即細胞病變(CPE)。但也