大腸桿菌K88相關(guān)產(chǎn)品的研制

大腸桿菌口服疫苗的研制

匯報(bào)人:范群平生物制品實(shí)驗(yàn)室當(dāng)前1頁，總共50頁。Whatisvaccine？

廣義的疫苗是為了預(yù)防、控制傳染病的發(fā)生和流行而接種于機(jī)體的預(yù)防性生物制品。生物制品，是指用微生物或其毒素，人或動(dòng)物的血清、細(xì)胞等制備的用來預(yù)防、診斷和治療用的制劑。預(yù)防用的抗體制劑也可以歸類為疫苗當(dāng)前2頁，總共50頁。Whatisoralvaccine？口服疫苗，顧名思義，就是經(jīng)“口”途徑接種的疫苗，進(jìn)一步來說是經(jīng)過消化道途徑進(jìn)行接種的疫苗。當(dāng)前3頁，總共50頁。Whychoosetheoralvaccine？首先，口服疫苗避免了注射疫苗造成的驚嚇應(yīng)激，有效保護(hù)了動(dòng)物福利。其次，口服疫苗降低了養(yǎng)殖成本，例如人力成本、抗應(yīng)激產(chǎn)品的成本。最后，對(duì)于許多經(jīng)腸道和黏膜表面感染的致病微生物有較好的防御能力。口服疫苗具有巨大的市場(chǎng)前景！當(dāng)前4頁，總共50頁。WhydowechoosetheE.Coli?之所以選擇大腸桿菌作為研究對(duì)象，就是因?yàn)樽胸i大腸桿菌病是豬的常見傳染病之一，發(fā)病率、死亡率高達(dá)50%~100%，直接給豬場(chǎng)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。治療不及時(shí)，即使恢復(fù)也變成僵豬，影響仔豬的生長(zhǎng)發(fā)育，造成飼料的浪費(fèi)，間接影響豬場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)效益。當(dāng)前5頁，總共50頁。當(dāng)前6頁，總共50頁。WhyistheK88?1、大腸桿菌的致病性取決于它在小腸的粘附、定植、增殖以及產(chǎn)生毒素的能力，粘附因子或纖毛決定細(xì)菌定植的能力，一旦發(fā)生細(xì)菌定植，就會(huì)快速增值并產(chǎn)生毒素從而導(dǎo)致腹瀉的發(fā)生。2、經(jīng)過流行病學(xué)調(diào)查，我們發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致仔豬大腸桿菌病的的最主要的粘附因子就是

3、K88幾乎100%由蛋白質(zhì)組成，具有較強(qiáng)的免疫原性。K88當(dāng)前7頁，總共50頁。HowtopreventandtreattheE.Colidisease?最好的方法就是應(yīng)用為此，根據(jù)仔豬免疫系統(tǒng)的發(fā)育情況，我們?cè)O(shè)計(jì)了兩種抗體應(yīng)用方案：一、早期直接抗體應(yīng)用方案雞抗豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（K88）卵黃抗體的研制二、后期間接抗體應(yīng)用方案攜帶豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的開發(fā)及應(yīng)用抗體當(dāng)前8頁，總共50頁。一、雞抗豬產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（K88）卵黃抗體的研制當(dāng)前9頁，總共50頁。Whydowechooseyolkantibody（IgY）?1、抗體水平高卵黃抗體所含有的抗體滴度大于血清中的抗體滴度，作為飼料添加劑具有更高的免疫保護(hù)效率。2、穩(wěn)定性高卵黃抗體具有很高的熱穩(wěn)定性，便于機(jī)械生產(chǎn)、加工。3、安全性高卵黃抗體可以用來防治相應(yīng)的病原體引起的感染并且無藥物殘留、不產(chǎn)生耐藥性。4、用途廣泛純化的卵黃抗體可以用來診斷疾病并且具有經(jīng)濟(jì)省時(shí)省力的特點(diǎn)。當(dāng)前10頁，總共50頁。Researchmathods1、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（K88）菌株的分離鑒定以及擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)基+誘導(dǎo)劑37℃、220rpm24小時(shí)震蕩培養(yǎng)當(dāng)前11頁，總共50頁。名稱豬大腸桿菌豬沙門氏菌培養(yǎng)基豬大腸桿菌培養(yǎng)基疫苗生產(chǎn)用豬沙門氏菌培養(yǎng)基疫苗生產(chǎn)用細(xì)菌計(jì)數(shù)2.5×109cfu/ml1×109cfu/ml表1：細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果2、經(jīng)過SDS實(shí)驗(yàn)證明K88粘附素蛋白表達(dá)了以后，進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，以保證有較高的細(xì)菌數(shù)來用于疫苗制備。當(dāng)前12頁，總共50頁。3、疫苗的制備

1、菌株的滅活在菌液濃度為1×109cfu/mL的細(xì)菌懸液中加入終濃度為3‰的甲醛溶液，37℃恒溫振蕩作用48h。2、滅活效果鑒定滅活苗12滅活前細(xì)菌計(jì)數(shù)109cfu/mL109cfu/mL滅活后細(xì)菌計(jì)數(shù)00當(dāng)前13頁，總共50頁。3、疫苗的乳化將配制好并高壓滅菌的油相佐劑與滅活的菌液按照1:1的比例混合，并用勻漿儀乳化，乳化期間不定時(shí)抽樣檢測(cè)疫苗的乳化效果乳化好的滅活疫苗呈乳白色牛奶狀，滴入清水中時(shí)不溶解，不擴(kuò)散，不沉淀。當(dāng)前14頁，總共50頁。4、預(yù)接種實(shí)驗(yàn)

為了檢驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的科學(xué)性和可行性，避免設(shè)計(jì)不周造成浪費(fèi)，我們?cè)O(shè)計(jì)了預(yù)實(shí)驗(yàn)。預(yù)實(shí)驗(yàn)證明以6×109cfu的量免疫效果最好，免疫雞群一開始出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，采食量下降、精神抑郁，趴臥不起。接種一周后雞群恢復(fù)正常，沒有出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)雞只死亡。當(dāng)前15頁，總共50頁。免疫170日齡待開產(chǎn)雞，雞群分為2組，每組100只，一組為對(duì)照組，一組為實(shí)驗(yàn)組。1、首免每羽注射1.0mL。2、兩周左右進(jìn)行二免，方法同初免，每羽注射1.5ml。3、四周后進(jìn)行三免，方法同初免，每羽注射2.0ml。4、每周收集卵黃液，采用試管直接凝集法進(jìn)行卵黃液中卵黃抗體效價(jià)的測(cè)定。5、免疫待開產(chǎn)雞群，誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，產(chǎn)生高抗體水平的雞蛋當(dāng)前16頁，總共50頁。樣品編號(hào)12345678910111213抗體效價(jià)（log2）3666.57.58989111010106、免疫雞群的抗體效價(jià)變化表3：免疫雞群大腸桿菌k88抗體效價(jià)當(dāng)前17頁，總共50頁。免疫雞群的抗體效價(jià)變化以上結(jié)果表明：免疫蛋雞在免疫后卵黃中的特異性抗體開始明顯升高，10周達(dá)到高峰，并持續(xù)到13周。當(dāng)前18頁，總共50頁。

收集免疫雞10~13周產(chǎn)的雞蛋，進(jìn)行噴干工藝的摸索，最后確定噴干時(shí)進(jìn)口溫度設(shè)定為160℃，出口溫度設(shè)定為90℃，對(duì)卵黃抗體滴度無影響，并且易于操作。7、卵黃抗體的噴霧干燥當(dāng)前19頁，總共50頁。指標(biāo)色澤粒度粗蛋白消化率卵黃抗體粉初產(chǎn)品淡黃色80目12.6%97.6%8、卵黃抗體粉指標(biāo)測(cè)定保存條件：常溫下放置半年，卵黃抗體活性無影響。卵黃抗體噴干粉在生產(chǎn)上具有良好的加工和儲(chǔ)存性能！表4：卵黃抗體指標(biāo)當(dāng)前20頁，總共50頁。9、小鼠造模飼喂試驗(yàn)5周齡小鼠飼養(yǎng)觀察一周后無異常，直腸試紙檢測(cè)ETEC陰性，感染前,停止喂食12h，腹腔注射0.2ml菌液，2h后正常喂食。對(duì)照組處理的不同之處是把菌液改為生理鹽水。感染后對(duì)動(dòng)物的觀察:每隔3h觀察1次，連續(xù)觀察24小時(shí)并記錄。

表5：各實(shí)驗(yàn)組小鼠死亡情況當(dāng)前21頁，總共50頁。10、k88卵黃抗體的斷奶仔豬飼喂試驗(yàn)從表6可見，3個(gè)組日增重最好的為試驗(yàn)②組達(dá)169.72g，最差的為對(duì)照組131.94g，料重比最好的為試驗(yàn)②組1.48，最差的為對(duì)照組達(dá)1.92，試驗(yàn)①組介于兩者之間。腹瀉頭次以試驗(yàn)①組為最小。當(dāng)前22頁，總共50頁。對(duì)照組的腹瀉率最高為16.49%顯著高于2個(gè)試驗(yàn)組，這表明合用IgY對(duì)有效降低仔豬斷奶后腹瀉的發(fā)生，且在合理范圍內(nèi)隨著劑量的增加其腹瀉效果越好。但是綜合料重比，腹瀉造成的死亡率等數(shù)據(jù)來看，基礎(chǔ)日糧+1%的k88卵黃抗體粉可以收到最佳的效果當(dāng)前23頁，總共50頁?？紤]到實(shí)際生產(chǎn)中，導(dǎo)致仔豬腹瀉的情況較為復(fù)雜，不只是大腸桿菌K88粘附素，因此我們有做了進(jìn)一步的工作調(diào)整，將攜帶K88、K99、987P、F41、F18菌毛抗原的幾種大腸桿菌還有傷寒沙門氏菌聯(lián)合在一起制成了大腸桿菌沙門氏菌二聯(lián)5價(jià)卵黃抗體。當(dāng)前24頁，總共50頁。二、攜帶豬源產(chǎn)腸毒素大腸桿菌(k88)抗原基因的口服乳酸菌疫苗的開發(fā)及應(yīng)用當(dāng)前25頁，總共50頁。實(shí)驗(yàn)一、重組乳酸菌的PCR鑒定及表達(dá)產(chǎn)物的SDS和West-blot分析當(dāng)前26頁，總共50頁。重組菌活化、增菌及質(zhì)粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)Western-blotSDS免疫動(dòng)物多克隆抗體的制備產(chǎn)毒素大腸桿菌疫苗的制備確定為攜帶誘導(dǎo)肽和抗原基因的重組乳酸菌技術(shù)路線當(dāng)前27頁，總共50頁。1、重組乳酸菌的分子鑒定—PCR鑒定圖1:重組乳酸菌核酸PCR分子鑒定M:DL2000；1、4、7:為重組乳酸菌核酸PCR擴(kuò)增結(jié)果當(dāng)前28頁，總共50頁。重組菌活化、增菌及質(zhì)粒的提取鑒定PCR鑒定重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)Western-blotSDS免疫動(dòng)物多克隆抗體的制備產(chǎn)毒素大腸桿菌疫苗的制備確定為攜帶誘導(dǎo)肽和抗原基因的重組乳酸菌當(dāng)前29頁，總共50頁。2大腸桿菌和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物免疫印跡（West-bloting）結(jié)果1M234M:低分子量蛋白marker;1:大腸桿菌(K88)發(fā)酵液；2、4:乳酸菌發(fā)酵上清液3:乳酸菌菌體沉淀樣品18KD28KD45KD60KD100KD圖4:大腸桿菌和乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物免疫印跡結(jié)果當(dāng)前30頁，總共50頁。實(shí)驗(yàn)二、乳酸工程菌誘變選育及工業(yè)化生產(chǎn)條件的摸索當(dāng)前31頁，總共50頁。重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)培養(yǎng)基工業(yè)化配方的優(yōu)化發(fā)酵條件的優(yōu)化中試最佳培養(yǎng)基溫度、轉(zhuǎn)速等確定工業(yè)化生產(chǎn)最佳發(fā)酵條件遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)路線當(dāng)前32頁，總共50頁。1重組乳酸菌的誘變選育1.1紫外誘變結(jié)果稀釋度對(duì)照誘變時(shí)間菌落個(gè)數(shù)致死率10-7300120s6877.4%150s4884%180s2093%10-82790s774%120s966.7%150s966.7%10-90180s0結(jié)論：誘變結(jié)果表明，誘變數(shù)據(jù)符合誘變成功的前提條件，可以對(duì)存活的菌落進(jìn)行選育。當(dāng)前33頁，總共50頁。1.2、重組乳酸菌的選育以活菌下降對(duì)數(shù)值均小于2為標(biāo)準(zhǔn)，從17株乳桿菌中初步篩選出1株優(yōu)良菌株，其耐酸和耐膽鹽測(cè)定結(jié)果如表編號(hào)耐膽鹽測(cè)定（log）耐酸(log)原液(log)耐膽鹽對(duì)數(shù)差耐酸對(duì)數(shù)差1＜47.727.62＞2＜22＜47.827.67＞2＜23＜47.777.71＞2＜24＜47.787.78＞2＜255.017.757.7＞2＜265.117.597.69＞2＜27＜47.617.84＞2＜28＜47.577.61＞2＜294.697.77.72＞2＜210＜47.727.7＞2＜2114.487.697.68＞2＜212＜47.887.89＞2＜213＜47.987.98＞2＜214＜47.97.78＞2＜2156.147.587.53＜2＜2165.267.687.66＞2＜2174.887.797.76＞2＜2當(dāng)前34頁，總共50頁。2重組乳酸菌選育株對(duì)小鼠腸粘液的體外粘附實(shí)驗(yàn)名稱活菌數(shù)（cfu/mL）原液活菌總數(shù)（cfu/mL）體外粘附率粘液11.63×1094.7×10964.2%粘液21.73×1094.7×10963.2%灌腸1.28×1094.7×10972.8%當(dāng)前35頁，總共50頁。3選育株的遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)選育株傳10代后，在紅霉素培養(yǎng)基里的計(jì)數(shù)情況，表明遺傳穩(wěn)定性較好。當(dāng)前36頁，總共50頁。重組菌的紫外誘變選育耐酸耐膽鹽遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)培養(yǎng)基工業(yè)化配方的優(yōu)化發(fā)酵條件的優(yōu)化中試最佳培養(yǎng)基溫度、轉(zhuǎn)速等確定工業(yè)化生產(chǎn)最佳發(fā)酵條件遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)技術(shù)路線當(dāng)前37頁，總共50頁。應(yīng)用生產(chǎn)常用的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基，沒再單獨(dú)進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，做好種子液后加到500L發(fā)酵罐中，發(fā)酵12h后，再轉(zhuǎn)入5噸的發(fā)酵罐，每2h取一次樣，進(jìn)行乳酸菌計(jì)數(shù)和pH值的測(cè)定，并繪制生長(zhǎng)曲線。當(dāng)前38頁，總共50頁。1選育株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定當(dāng)前39頁，總共50頁。2選育株的菌液PH值變化情況測(cè)定在5噸大罐中發(fā)酵時(shí)間以20小時(shí)為宜。當(dāng)前40頁，總共50頁。實(shí)驗(yàn)三、重組乳酸菌作為口服疫苗對(duì)小鼠免疫指標(biāo)的影響及免疫保護(hù)效果的研究當(dāng)前41頁，總共50頁。小鼠實(shí)驗(yàn)進(jìn)程一覽9.10開始動(dòng)物實(shí)驗(yàn)10.19處理第一批小鼠11.6處理第二批11.22處理第三批10.28-30號(hào)，連續(xù)三天灌胃，同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫9.24-26號(hào)，連續(xù)三天灌胃，同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫10.10-12號(hào)，連續(xù)三天灌胃，同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫11.14-16號(hào)，連續(xù)三天灌胃，同時(shí)進(jìn)行疫苗免疫12.4攻毒試驗(yàn)12.17處理最后一批當(dāng)前42頁，總共50頁。1小鼠脾臟指數(shù)（mg/kg）測(cè)定結(jié)果從結(jié)果可以看出，各實(shí)驗(yàn)組小鼠脾臟指數(shù)均高于對(duì)照組，且均差異顯著（P<0.05)；表明基因工程菌對(duì)動(dòng)物脾臟生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的促進(jìn)作用。當(dāng)前43頁，總共50頁。2小鼠腸道內(nèi)容物sIgA

（mg/L）測(cè)定結(jié)果從四批實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，工程菌組sIgA含量均高于對(duì)照組、LP組，和疫苗組相比，sIgA的滴度持續(xù)維持高水平狀態(tài)，表明工程菌產(chǎn)生的高水平sIgA抗體更加持久，而滅活疫苗產(chǎn)生高水平sIgA抗體維持時(shí)間較短，保護(hù)效力不如工程菌。組別第1批第2批第3批第4批生理鹽水50.54±27.80a68.17±6.64b70.79±4.52a65.27±13.44a

LP60.05±20.51a71.52±7.20b78.62±12.55ab83.50±19.25a

疫苗組66.84±14.88a53.43±5.56a94.32±4.18b86.11±14.03a

工程菌組94.02±26.62a98.32±4.94c91.86±9.11b90.45±6.57b

當(dāng)前44頁，總共50頁。3血清中大腸桿菌k88抗體含量的OD值測(cè)定結(jié)果（大腸桿菌包被）從上述結(jié)果可以看出，各實(shí)驗(yàn)組k