微生物在藥學(xué)中的應(yīng)用詳解演示文稿

微生物在藥學(xué)中的應(yīng)用詳解演示文稿當前1頁，總共94頁。（優(yōu)選）微生物在藥學(xué)中的應(yīng)用當前2頁，總共94頁。醫(yī)用抗生素的特點差異毒力大對作用對象與對機體的毒性之間的差異越大越好由作用機制決定生物活性強、有不同的抗菌譜生物活性用MIC來表示，其值越小表示作用越強能抑制或殺滅的微生物范圍稱為抑菌譜，有廣譜和窄譜之分當前3頁，總共94頁。當前4頁，總共94頁。二、抗生素的分類根據(jù)產(chǎn)生來源分細菌產(chǎn)：少，有多粘菌素、短桿菌肽等放線菌產(chǎn)：多，鏈霉素更主要真菌產(chǎn)：青霉素，頭孢霉素等動物植物產(chǎn)：地衣素，蒜素，魚素等根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)分Beta-內(nèi)酰胺環(huán)類大環(huán)內(nèi)酯類氨基糖苷類四環(huán)素類多肽類當前5頁，總共94頁。第二節(jié)抗生素產(chǎn)生菌的

分離與篩選目前，新抗生素的獲得大致有如下途徑：1.從自然界分離并篩選新抗生素產(chǎn)生菌。近年來，為了擴大篩選的來源，已從土壤微生物擴展到海洋微生物，從一般常見微生物擴展到極端微生物，又從微生物擴展到植物、海洋生物等。2.改造現(xiàn)有的已知抗生素的產(chǎn)生菌，再經(jīng)篩選獲得新抗生素產(chǎn)生菌。3.從已知的抗生素進行結(jié)構(gòu)改造，經(jīng)篩選后獲得新的半合成抗生素。當前6頁，總共94頁。4.采用新的篩選方法，如培養(yǎng)超敏細菌以尋找微量的新抗生素，選用新的腫瘤模型，如用鼠肉瘤病毒M（MSV.M）、鳥類粒白細胞血病病毒等來篩選抗腫瘤抗生素。5.采用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)設(shè)計新抗生素。絕大多數(shù)抗生素的原始產(chǎn)生菌是從自然界分離篩選而得，因此，下面以傳統(tǒng)的分離土壤放線菌為例，簡單說明新抗生素產(chǎn)生菌的常規(guī)分離和篩選過程。當前7頁，總共94頁。

一.土壤微生物的分離1.采土2.分離菌株二.篩選所謂篩選是指從大量待篩選放線菌中，盡快地鑒別出極少數(shù)有實用價值的抗生素產(chǎn)生菌的實驗過程。在新抗生素產(chǎn)生菌的篩選中，應(yīng)根據(jù)篩選目的選擇合適的篩選模型和方法。1.篩選模型篩選模型是指篩選工作中所使用的試驗菌。2.篩選方法抗菌抗生素一般采用瓊脂擴散法。

當前8頁，總共94頁。三.早期鑒別1.抗生素產(chǎn)生菌的鑒別2.抗生素的鑒別四.分離精制五.臨床前試驗研究六.臨床試驗當前9頁，總共94頁。第三節(jié)抗生素的制備

一.發(fā)酵階段（一）現(xiàn)代膽色素發(fā)酵的一般特點1.需氧發(fā)酵2.深層發(fā)酵3.純種發(fā)酵

當前10頁，總共94頁。

（二）一般生產(chǎn)流程

1.孢子制備

2.種子制備3.發(fā)酵

（1）無菌操作（2）營養(yǎng)需要（3）PH（4）溫度（5）前體（6）通氣、攪拌及消沫（7）發(fā)酵終點判斷當前11頁，總共94頁。二.發(fā)酵液預(yù)處理及提取階段（一）發(fā)酵液預(yù)處理（二）提取常用的提取法主要有以下幾類。1.容媒萃取法2.離子交換法3.沉淀法4.吸附法當前12頁，總共94頁。當前13頁，總共94頁。援助古巴可拆卸式中試發(fā)酵車間

當前14頁，總共94頁。大連翔大科技股份有限公司中試及大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵車間

當前15頁，總共94頁。山東勝利股份有限公司生物工程技術(shù)中心生物農(nóng)藥中試發(fā)酵車間

當前16頁，總共94頁。華中農(nóng)大中試發(fā)酵車間

當前17頁，總共94頁。內(nèi)蒙古華蒙金河生物技術(shù)有限公司(飼料用抗生素——金霉素，西部開發(fā)項目)

當前18頁，總共94頁。上海聯(lián)合賽爾生物工程公司國家一類新藥霍亂疫苗發(fā)酵生產(chǎn)車間

當前19頁，總共94頁。第四節(jié)抗生素的生物合成機制一.次級代謝產(chǎn)物的概念所謂次級代謝產(chǎn)物（secondarymetabalites）是指那些由微生物合成的，但對微生物的生長、繁殖無明顯功能的各種代謝產(chǎn)物，如抗生素等。次級產(chǎn)物有以下幾個特點。1.對微生物的生長、繁殖無明顯功能。2.與初級代謝產(chǎn)物緊密相聯(lián)。3.在一定條件下能大量合成。

當前20頁，總共94頁。二、抗生素生物合成的代謝途徑大致步驟：營養(yǎng)物質(zhì)—?初級代謝中間物—?前體—?修飾重排—合成途徑—?抗生素有關(guān)代謝途徑脂肪酸代謝氨基酸代謝嘌呤嘧啶代謝糖代謝芳香族合成一碳甲基庫當前21頁，總共94頁。三、青霉素的生物合成及調(diào)控6-APA當前22頁，總共94頁。生物合成的調(diào)控賴氨酸的反饋抑制糖分解產(chǎn)物的阻抑作用葡萄糖分解產(chǎn)物?抑制?；D(zhuǎn)移酶?抑制青霉素合成乳糖不抑制，但成本高生產(chǎn)中用滴加或間隙補加以維持低濃度糖當前23頁，總共94頁。第五節(jié)抗生素的主要作用機制當前24頁，總共94頁。當前25頁，總共94頁。1、抑制細胞壁的合成青霉素類抑制細胞壁肽聚糖的交叉連結(jié)→細胞壁缺損→水分內(nèi)滲→細菌膨脹變形→細菌破裂、溶解。環(huán)絲氨酸：抑制五肽的形成萬古霉素和桿菌肽：前者阻斷二糖五肽與胞壁受體結(jié)合；后者影響內(nèi)脂循環(huán)Bata內(nèi)酰胺類抗生素：抑制合成交聯(lián)中所需的轉(zhuǎn)肽酶反應(yīng)，使不能形成三維結(jié)構(gòu)當前26頁，總共94頁。2、影響胞漿膜通透性多粘菌素與細胞膜內(nèi)磷酯結(jié)合→細胞膜通透性↑→細胞內(nèi)重要物質(zhì)外漏→細菌死亡。制霉素、二性霉素B：與真菌細胞膜麥角固醇結(jié)合→形成孔道→細胞內(nèi)重要物質(zhì)外漏→真菌死亡。當前27頁，總共94頁。3、抑制蛋白質(zhì)合成氨基甙類：〔1〕抑核蛋白體70S始動復(fù)合物的生成〔2〕與核蛋白體30S的P10蛋白結(jié)合→翻譯錯誤?！?〕阻止釋放因子與核糖體結(jié)合抑制蛋白質(zhì)的釋放抗菌藥不影響人蛋白質(zhì)的合成因人與細菌的核蛋白體不同。細菌：70S（原核細胞）30S50S人：80S（真核細胞）40S60S當前28頁，總共94頁。4、影響核酸代謝利福平：抑制依賴于DNA的RNA多聚酶，從而抑制的mRNA合成氟喹諾酮類：抑制DNA螺旋酶→抑制DNA復(fù)制與mRNA的轉(zhuǎn)錄。當前29頁，總共94頁。5、抗葉酸代謝磺胺類抑制二氫葉酸合成酶，TMP（甲氧芐啶）抑制二氫葉酸還原酶，從而抑制DNA、RNA的合成。當前30頁，總共94頁。第六節(jié)抗藥性一、基本概念最小抑菌濃度固有性抗藥獲得性抗藥多重抗藥性交叉抗藥性賴藥性當前31頁，總共94頁。二、產(chǎn)生的遺傳學(xué)機制自發(fā)突變，藥物選擇壓力抗藥基因轉(zhuǎn)移當前32頁，總共94頁。三、產(chǎn)生的生物化學(xué)機制1．產(chǎn)生滅活酶（1）水解酶：b—內(nèi)酰胺酶水解青霉素或頭孢菌素的b－內(nèi)酰胺環(huán)。（2）鈍化酶：催化某些基團結(jié)合到抗生素的OH、NH2上

，使之失去抗菌活性，如G－桿菌對氨基甙類耐藥。當前33頁，總共94頁。2、改變靶位結(jié)構(gòu)〔1〕藥物與靶位親和力↓：如β－內(nèi)酰胺類與PBPS結(jié)合↓?！?〕靶位結(jié)構(gòu)改變：

①耐甲氧西林的金葡菌產(chǎn)生PBP2，（MRSA）

②鏈霉素：P10蛋白改變

③利福平：RNA多聚酶β亞基的改變當前34頁，總共94頁。3、降低外膜通透性細菌細胞膜存在特異通道與非特異通道，當通道的通透性↓→耐藥。（1）細菌孔道蛋白質(zhì)組成、數(shù)目、功能改變：如G－桿菌對氨基甙類耐藥。（2）產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)堵塞孔道：如細菌對四環(huán)素耐藥。當前35頁，總共94頁。4．通過主動泵出系統(tǒng)清除藥物細菌：大腸桿菌、金葡菌、表葡菌、銅綠假單孢菌、空腸彎曲菌等?？咕帲核沫h(huán)素、氟喹諾酮類、氯霉素、β-內(nèi)酰胺類等通過主動泵出而耐藥。當前36頁，總共94頁。當前37頁，總共94頁。5.其它代謝拮抗物↑：如對磺胺類耐藥的細菌產(chǎn)生大量的PABA。當前38頁，總共94頁。耐藥性產(chǎn)生的人為原因（1）濫用（2）局部用（3）劑量不足（4）單獨用（5）長期用當前39頁，總共94頁。四、對細菌耐藥性的對策合理使用抗菌藥1、應(yīng)用抗菌藥要有嚴格指征2、足量用藥、療程要適當3、治療慢性病要聯(lián)合用藥4、不要局部用藥研制新藥加強耐藥機制研究當前40頁，總共94頁。第七節(jié)抗生素的效價、單位和效價測定一、抗生素的效價和單位效價：相同條件下檢品與標準品的抗菌活性之比值效價=檢品抗菌活性

標準品抗菌活性×100%當前41頁，總共94頁。單位

衡量有效成分的具體尺度，可以各不相同重量單位：抗菌活性部分的重量，非全部鹽類成分。如鏈霉素硫酸鹽、土霉素鹽酸鹽、新生霉素鈉（鉀）鹽類似重量單位：全部鹽類成分。如純金霉素鹽酸鹽、四環(huán)素鹽酸鹽等，1微克＝1單位重量折算單位：青霉素，以抑制50毫升的金葡菌者為1單位，相當于純品0.5988微克，則1毫克＝1670單位特定單位：特定批次樣品的某一重量為一單位。如某批桿菌肽1mg=55單位，制霉菌素1mg=3000單位當前42頁，總共94頁。標準品：與商品同質(zhì)，純度較高的抗生素，每毫克含一定單位，可作效價測定之標準國際單位：經(jīng)國際協(xié)議，每毫克含一定單位的標準品稱國際標準品，其單位稱國際單位。國際標準品由WHO的生物檢定專家委員會主持，由英國國立生物標準檢定所組織標定、保管、分發(fā)。國家標準品標示量：標簽上的標示量原則上以重量表示，成分不清（如制霉菌素），或照顧用藥習(xí)慣（青霉素），仍沿用單位表示當前43頁，總共94頁。二、抗生素效價的微生物學(xué)測定法抗生素效價的生物測定有稀釋法、比濁法、擴散法三大類。管碟法是擴散法中的一種，本法是利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基的擴散滲透作用，將已知濃度的標準溶液與未知濃度的樣品溶液在含有敏感性試驗菌的瓊脂表面進行擴散滲透，比較兩者對被試菌的抑菌作用，求出抑菌圈的大小，以測定抗生素的濃度。在一定范圍內(nèi)，濃度與抑菌圈直徑在雙周半對數(shù)表上（濃度為對數(shù)值，抑菌圈直徑為數(shù)字值）成直線函數(shù)的關(guān)系，由此繪制成標準曲線，從樣品的抑菌圈大小可在標準曲線上求得其效價。由于本法是利用抗生素抑制敏感細菌的特點，所以符合臨床使用的實際情況，而且靈敏度也很高，不需特殊設(shè)備，故一般實驗室及生產(chǎn)上多采用此法。但此法也有缺點，即操作步驟多，手續(xù)繁雜，培養(yǎng)時間長、得出結(jié)果慢。盡管如此，由于它有上述的獨特優(yōu)點而被世界各國所公認，成為國際通用的方法被列入各國藥典法規(guī)的范圍內(nèi)。當前44頁，總共94頁。測定方法：一劑量法二劑量法三劑量法影響因素當前45頁，總共94頁。第十八章微生物在其他藥物生產(chǎn)中的應(yīng)用當前46頁，總共94頁。第一節(jié)維生素一、維生素C化學(xué)合成法——萊氏法，國外用生物合成——二步發(fā)酵法，中國用1、D-葡萄糖——D-山梨醇——L-山梨糖：弱氧化醋桿菌2、L-山梨糖——2-KLG：大小菌當前47頁，總共94頁。當前48頁，總共94頁。二、維生素B2棉病囊霉：4000～8000毫克/升阿舒假囊酵母：4000毫克/升三、維生素B12肝臟提取化學(xué)合成丙酸桿菌成本太高，不適宜工業(yè)化生產(chǎn)當前49頁，總共94頁。第二節(jié)氨基酸谷氨酸發(fā)酵我國的菌株：北京棒狀桿菌；鈍齒棒狀桿菌生物素：過少，菌不長；過多則為乳酸發(fā)酵氧：充足時谷氨酸發(fā)酵；不足時乳酸發(fā)酵NH4+：適量時谷氨酸發(fā)酵；不足時生成a-酮戊二酸；過量時生成谷氨酰氨pH中性和偏堿性時生成谷氨酸；酸性時生成乙酰谷氨酰氨當前50頁，總共94頁。2、賴氨酸高絲氨酸營養(yǎng)缺陷兼抗性突變株賴氨酸天冬氨酸激酶當前51頁，總共94頁。第三節(jié)酶及酶抑制劑酶：有催化作用的蛋白質(zhì)，新陳代謝必不可少的催化劑酶的用途治療疾病診斷試劑生物工具酶當前52頁，總共94頁。一、酶制劑臨床上較常用的微生物酶鏈激酶、鏈道酶：心血管病治療。鏈球菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸酶：治心肌梗死。從動物血漿及動物毒液中提取天冬氨酰胺酶：治療白血病、腫瘤。許多菌均可青霉素酶：含青霉素制劑的無菌檢測工業(yè)上較常用的微生物酶：青霉素酰化酶分解青霉素，得到6-氨基青霉烷酸(6–APA)，是半合成青霉素的母核當前53頁，總共94頁。二、酶抑制劑為具有生物活性的小分子化合物中和抑制或競爭抑制某些酶的活性調(diào)節(jié)代謝活動：防病、治病如鏈霉產(chǎn)生的泛誕菌素，抑制淀粉酶，防止肥胖癥、糖尿病等當前54頁，總共94頁。第四節(jié)甾體化合物的生物轉(zhuǎn)化甾體化合物具有機體調(diào)節(jié)作用，可用于治?。耗I上腺皮質(zhì)激素治療或緩解膠原性疾病、過敏性休克性激素：治療性器官功能衰退與某些婦科疾病乳腺癌、前列腺癌的輔助治療藥物口服避孕藥的主要成分當前55頁，總共94頁。微生物轉(zhuǎn)化載體化合物的反應(yīng)類型羥化反應(yīng)當前56頁，總共94頁。2、環(huán)氧化反應(yīng)當前57頁，總共94頁。3、脫氫反應(yīng)當前58頁，總共94頁。4、側(cè)鏈的降解？當前59頁，總共94頁。微生物生產(chǎn)甾體化合物的方法：單相發(fā)酵法雙相發(fā)酵法固定化酶法轉(zhuǎn)化者培養(yǎng)好的微生物分離后的菌懸液固定化酶或細胞提取底物菌體與培養(yǎng)液菌體與液體過柱液優(yōu)缺點發(fā)酵易、提取難發(fā)酵繁、提取易發(fā)酵繁、提取易當前60頁，總共94頁。第五節(jié)其他微生物制劑核酸類藥物生物堿微生態(tài)制劑螺旋藻基因工程產(chǎn)品當前61頁，總共94頁。當前62頁，總共94頁。微生物與藥物變質(zhì)當前63頁，總共94頁。藥物中微生物的來源1.空氣細菌、霉菌、酵母菌無菌操作區(qū)－每1000升空氣中<10個細菌。2.水3.其它原料、容器、設(shè)備、操作人員、包裝材料。當前64頁，總共94頁。微生物引起的藥物變質(zhì)1.藥物變質(zhì)的判斷（1）有病原微生物存在（2）存在微生物的毒性代謝產(chǎn)物（3）產(chǎn)品發(fā)生可被覺察的物理或化學(xué)變化（4）口服及外用藥物的微生物總數(shù)超標（5）無菌制劑中發(fā)現(xiàn)有微生物存在當前65頁，總共94頁。2.藥物變質(zhì)的結(jié)果（1）變質(zhì)的藥品引起感染（2）藥物理化性質(zhì)的改變引起藥物失效（3）藥物中的微生物產(chǎn)生有毒的代謝產(chǎn)物當前66頁，總共94頁。3.影響藥物變質(zhì)的因素污染量營養(yǎng)因素含水量pH值儲藏溫度當前67頁，總共94頁。防止微生物污染藥物的措施1.加強藥品生產(chǎn)管理（GoodManufacturingPractice)交叉污染容器貼錯標簽2.進行微生物學(xué)檢驗3.使用合格的防腐劑當前68頁，總共94頁。藥物的體外抗菌試驗用于抗菌藥物的篩選提取過程中的追蹤抗菌譜的測定藥物含量的測定藥物血濃度測定藥物敏感試驗等包括抑菌試驗和殺菌試驗兩者并非絕對當前69頁，總共94頁。體外抑菌試驗一、連續(xù)稀釋法

可用于測定藥物的最低抑菌濃度（minimalinhibitoryconcentration)和最低殺菌濃度（minimalbactericidalconcentration).當前70頁，總共94頁。一、連續(xù)稀釋法21.液體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法2.固體培養(yǎng)基連續(xù)稀釋法——平板法可同時測定大批量試驗菌株的MIC，且不受藥物顏色及混濁度的影響。當前71頁，總共94頁。當前72頁，總共94頁。MIC檢測方法1.藥液稀釋：對倍稀釋法共14管，12管為空白對照（不加菌液），13管為陽性對照（不加藥物）。14管為稀釋劑或助溶劑對照（濃度與1管相同）。2.加入菌液0.1毫升（1000～100000個細菌），搖勻。3.培養(yǎng)：37度，16～24小時。4.MIC的確定：試驗管呈現(xiàn)澄明的最低藥物濃度即為MIC。當前73頁，總共94頁。二、瓊脂擴散法1.濾紙片法新藥的初篩及臨床的藥敏試驗2.打孔法藥物血濃度的檢測3.挖溝法一種藥物對幾種試驗菌的抗菌作用當前74頁，總共94頁。體外殺菌試驗最低殺菌濃度（MBC）也可稱之為最低致死濃度（MLC)。取MIC終點以上未長菌的各管培養(yǎng)液，分別移種于另一無菌平板上，培養(yǎng)后平板上無菌生長（或少于5個菌落）的藥物最低濃度為該藥的MBC（或MLC）。當前75頁，總共94頁。聯(lián)合抗菌試驗兩種抗菌藥物、藥物與不同pH、藥物與不同離子溶液的相互影響。1.協(xié)同－加強作用2.拮抗－減弱作用3.無關(guān)－相互無影響4.累加－作用為二者之和當前76頁，總共94頁。一、紙條試驗在已接種試驗菌的平板表面垂直放置兩條各浸有一種藥液的濾紙條，培養(yǎng)后根據(jù)抑菌區(qū)的加強、減弱或無影響來判斷它們在聯(lián)合應(yīng)用時的效應(yīng)。當前77頁，總共94頁。二、棋盤格法A藥各稀釋度按縱行定量加入各管。B藥各稀釋度按橫排定量加入各管。加入定量菌液，經(jīng)培養(yǎng)后觀察結(jié)果。兩藥同時檢測單獨MIC。FIC（A）＝A藥與B藥聯(lián)合試驗時A藥的MICA藥單獨試驗時的MICFIC為部分抑菌濃度當前78頁，總共94頁。FIC（B）＝B藥與A藥聯(lián)合試驗時B藥的MICB藥單獨試驗時的MICFIC指數(shù)＝FIC(A)+FIC(B)

<0.75－協(xié)同1－累加1～2－無關(guān)

>2－拮抗當前79頁，總共94頁。體外抗菌試驗的影響因素1.試驗菌標準菌株臨床新分離菌株2.培養(yǎng)基3.抗菌藥物濃度稀釋4.對照試驗（1）試驗菌對照（2）已知藥物對照（3）溶劑及稀釋液對照當前80頁，總共94頁。藥物制劑的微生物學(xué)檢查一、無菌制劑的無菌檢查各種注射劑（針劑、輸液）手術(shù)及眼科制劑都必須無活的微生物。1.無菌檢查的基本原則采用嚴格的無菌操作方法，將被檢藥品置不同培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，觀察有無微生物生長，以判斷被檢藥品是否合格。當前81頁，總共94頁。2.無菌檢查抽樣（1）百分數(shù)抽樣法：每批的2％～5％（2）固定抽樣法：2～203.培養(yǎng)基及培養(yǎng)基靈敏度試驗無菌試驗靈敏度試驗：用已知不同菌株做生長試驗來監(jiān)控。菌種有：藤黃八疊球菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉。當前82頁，總共94頁。4.陽性對照菌及抑細菌抑真菌試驗（1）陽性對照菌液是為供試品做陽性對照試驗使用的。其目的是檢查陽性菌在加入供試品的培養(yǎng)基中能否生長，以驗證供試品有無抑菌活性物質(zhì)和試驗條件是否符合要求。（2）抑細菌抑真菌試驗：加供試品的培養(yǎng)管與未加供試品的培養(yǎng)管比較，以判斷供試品有無抑菌作用。（如有抑菌作用可加入滅活劑或用薄膜過濾法檢測）當前83頁，總共94頁。5.檢查法（1）直接接種法：適用于非抗菌作用的供試品。（2）薄膜過濾法：適用于有抗菌作用的或大容量的供試品。當前84頁，總共94頁。特殊藥品的無菌檢查法油類藥物的無菌檢查供試品中加入1％～3％聚山梨酸80（吐溫80），其作用是使油類藥物均勻分散，便于檢出微生物。

當前85頁，總共94頁。細菌總數(shù)的測定當前86頁，總共94頁。口服藥及外用藥的微生物學(xué)檢查需要限制性控制微生物的數(shù)量和種類。1.細菌總數(shù)、霉菌總數(shù)低于規(guī)定限量（細菌總數(shù)1克或1毫升不超過10～104CFU,真菌數(shù)1克或1毫升不超過10～103CFU)。2.口服藥物不得檢出大腸埃希菌、沙門菌。3.外用藥不得檢出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、破傷風梭菌。4.不得檢出活螨（含糖的劑型應(yīng)重點檢查）。當前87頁，總共94頁。平板菌落計數(shù)法限制條件1.菌落形成單位（colonyformingunits,CFU）為計數(shù)單位。一個菌落就是一個菌落形成單位，它可以由一個也可以由多個菌細胞形成。2.受特定培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件限制普通培養(yǎng)基，需氧或兼性厭氧，30～35度，48小時。3.有繁殖能力的菌細胞才能被認定“活菌”。當前88頁，總共94頁。平板菌落計數(shù)法方法1.試驗前的準備2.供試品取樣、供試液的制備（10毫升或