微生物工程(發(fā)酵)第三章培養(yǎng)基制備與滅菌

思考題：培養(yǎng)基有哪些化學(xué)成分組成？這些成分的來源有哪些（尤其是C、N源）？各成分的作用是什么？前體物質(zhì)、抑制劑、促進劑的概念發(fā)酵工業(yè)原料的選擇原則有哪些發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計的基本原則有哪些發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計和優(yōu)化步驟常用的滅菌方法有哪些？發(fā)酵工程培養(yǎng)基滅菌的主要滅菌方法及其各自的優(yōu)缺點；當前1頁，總共55頁。按純度合成培養(yǎng)基

:原料其化學(xué)成分明確、穩(wěn)定

適合于研究菌種基本代謝和過程的物質(zhì)變化規(guī)律

培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，價格較高，不適合用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)

天然培養(yǎng)基:采用天然原料

原料來源豐富(大多為農(nóng)副產(chǎn)品)、價格低廉、適于工業(yè)化生產(chǎn)

原料質(zhì)量等方面不加控制會影響生產(chǎn)穩(wěn)定性

培養(yǎng)基概述當前2頁，總共55頁。固體培養(yǎng)基

:適合于菌種和孢子的培養(yǎng)和保存，也廣泛應(yīng)用于有子實體的真菌類，如香菇、白木耳等的生產(chǎn)

半固體培養(yǎng)基:即在配好的液體培養(yǎng)基中加入少量的瓊脂，一般用量為0.5%～0.8%,主要用于微生物的鑒定。液體培養(yǎng)基:80%～90%是水，其中配有可溶性的或不溶性的營養(yǎng)成分，是發(fā)酵工業(yè)大規(guī)模使用的培養(yǎng)基。當前3頁，總共55頁。根據(jù)生產(chǎn)流程和作用來區(qū)分斜面培養(yǎng)基或孢子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基當前4頁，總共55頁。3.1發(fā)酵培養(yǎng)基組成及來源五大元素：水、碳源、氮源、無機鹽、生長因子當前5頁，總共55頁。3.1.1五大營養(yǎng)要素及其主要來源3.1.1.1水分：占細胞重量的80-90%；

對于發(fā)酵工廠來說，恒定的水源是至關(guān)重要的，因為在不同水源中存在的各種因素對微生物發(fā)酵代謝影響甚大

水源質(zhì)量的主要考慮參數(shù)包括pH值、溶解氧、可溶性固體、污染程度以及礦物質(zhì)組成和含量。當前6頁，總共55頁。3.1.1.2碳源可以作為微生物細胞和代謝產(chǎn)物中碳素來源的營養(yǎng)物質(zhì)；當前7頁，總共55頁。a.純糖原料葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖等當前8頁，總共55頁。b.淀粉質(zhì)原料直鏈淀粉（聚合度100-6000）支鏈淀粉（1000-3000000）當前9頁，總共55頁。薯類原料：紅薯、木薯；谷物原料：玉米野生植物原料：橡果、葛根、蕨根輔助原料：麩皮、米糠當前10頁，總共55頁。②淀粉、糊精使用條件：微生物必須能分泌水解淀粉、糊精的酶類缺點：難利用、發(fā)酵液比較稠、一般>2.0%時加入一定的α-淀粉酶，成分比較復(fù)雜等等。優(yōu)點：來源廣泛、價格底可以解除葡萄糖效應(yīng)當前11頁，總共55頁。c.糖蜜原料：制糖工業(yè)中的副產(chǎn)物；甘蔗、甜菜當前12頁，總共55頁。糖蜜使用的注意點：除糖份外，含有較多的雜質(zhì)，許多都會對發(fā)酵產(chǎn)生不利的影響，需要進行預(yù)處理。例：谷氨酸發(fā)酵有害物資：膠體成分（起泡、結(jié)晶）、鈣鹽（結(jié)晶）生物素（發(fā)酵控制）例：檸檬酸發(fā)酵有害物質(zhì)：鐵離子含量高（導(dǎo)致異檸檬酸的生成）當前13頁，總共55頁。d.纖維質(zhì)原料：農(nóng)作物秸稈；纖維素、半纖維素、木質(zhì)素當前14頁，總共55頁。3.1.1.3氮源被微生物利用以構(gòu)成細胞物質(zhì)或代謝產(chǎn)物中的氮素的營養(yǎng)物質(zhì)；當前15頁，總共55頁。a.無機氮源氨水、硝酸鹽、銨鹽特點：吸收快，速效氮源。但無機氮源的迅速利用常會引起pH的變化如：

(NH4)2SO4

→2NH3+2H2SO4

NaNO3+4H2

→NH3+2H2O+NaOH滿足菌體生長穩(wěn)定和調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH當前16頁，總共55頁。b.有機氮源玉米漿、豆餅粉、花生餅粉、棉籽餅粉、魚粉、酵母浸出液成分復(fù)雜：除提供氮源外，有些有機氮源還提供大量的無機鹽及生長因子。例玉米漿：①可溶性蛋白、生長因子（生物素）、苯乙酸②較多的乳酸③硫、磷、微量元素等當前17頁，總共55頁。

有機氮源成分復(fù)雜可以從多個方面對發(fā)酵過程進行影響，而另一方面有機氮源的來源具有不穩(wěn)定性。所以在有機氮源選取時和使用過程中，必須考慮原料的波動對發(fā)酵的影響當前18頁，總共55頁。3.1.1.4無機鹽酶活中心的組成部分維持生物大分子和細胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)并維持細胞的滲透壓平衡控制細胞的氧化還原電位作為某些微生物生長的能源物質(zhì)當前19頁，總共55頁。3.1.1.5生長因子凡是微生物生長不可缺少的微量的有機物質(zhì)，如氨基酸、嘌呤、嘧啶、維生素等均稱生長因子。有機氮源是生長因子的重要來源；當前20頁，總共55頁。3.1.1.6前體物質(zhì)、抑制劑和促進劑

前體物質(zhì)指某些化合物加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，能直接彼微生物在生物合成過程中合成到產(chǎn)物物分子中去，而其自身的結(jié)構(gòu)并沒有多大變化，但是產(chǎn)物的產(chǎn)量卻因加入前體而有較大的提高。青霉素：分子量356苯乙酸:分子量136當前21頁，總共55頁。前體一般都有毒性，濃度過大對菌體的生長不利苯乙酸，一般基礎(chǔ)料中僅僅添加0.07%

前體相對價格較高，添加過多，容易引起揮發(fā)和氧化當前22頁，總共55頁。3、產(chǎn)物促進劑產(chǎn)物促進劑是指那些非細胞生長所必須的營養(yǎng)物，又非前體，但加入后卻能提高產(chǎn)量的添加劑當前23頁，總共55頁。

促進劑提高產(chǎn)量的機制還不完全清楚，其原因是多方面的。有些促進劑本身是酶的誘導(dǎo)物；有些促進劑是表面活性劑，可改善細胞的透性，改善細胞與氧的接觸從而促進酶的分泌與生產(chǎn)，也有人認為表面活性劑對酶的表面失活有保護作用；有些促進劑的作用是沉淀或螯合有害的重金屬離子。當前24頁，總共55頁。抑制劑：能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白質(zhì)變性的物質(zhì)；

可用透析或超濾的方式去除；

在培養(yǎng)基中添加抑制劑會抑制某些代謝途徑的進行，同時會使另一代謝途徑活躍，從而獲得人們所需要的某一終產(chǎn)物或使正常代謝的某一代謝中間產(chǎn)物積累起來;

當前25頁，總共55頁。3.1.2發(fā)酵工業(yè)原料的選擇原則因地制宜，就地取材；營養(yǎng)豐富，濃度恰當；資源豐富，容易收集；易于儲藏；理化性質(zhì)穩(wěn)定，成分間無反應(yīng)；不影響通氣、攪拌、產(chǎn)物分離，廢物處理方便不含毒副作用的物質(zhì)價格低廉當前26頁，總共55頁。3.1.4原料的預(yù)處理和加工淀粉質(zhì)原料的預(yù)處理和加工預(yù)處理：原料除雜、粉碎；加工：液化淀粉→糊精、低聚糖

糖化產(chǎn)生葡萄糖當前27頁，總共55頁。加工：糊化、液化淀粉→糊精、低聚糖

糖化產(chǎn)生葡萄糖淀粉顆粒受熱并吸水膨脹，體積迅速增大，固態(tài)結(jié)構(gòu)被破壞，形成粘稠的液體，稱為糊化；糊化的淀粉在酶的作用下，分子鏈被切斷，相對分子量變小，粘度迅速降低的過程稱為液化；經(jīng)液化后的料液中加入一定量的糖化酶（葡萄糖淀粉酶），使糊精或低聚糖水解為葡萄糖，稱之為糖化。當前28頁，總共55頁。當前29頁，總共55頁。糖蜜原料的預(yù)處理去除雜質(zhì)、膠體、灰分（鈣質(zhì)）及產(chǎn)酸細菌；方法：加酸酸化；

加熱滅菌；

靜止沉淀；

脫鈣；當前30頁，總共55頁。纖維素原料的預(yù)處理及加工：預(yù)處理：用化學(xué)、物理、生物學(xué)的方法，去除半纖維素和木質(zhì)素，破壞纖維素的結(jié)構(gòu)；加工：酸水解酶水解當前31頁，總共55頁。3.2發(fā)酵培養(yǎng)基的設(shè)計和優(yōu)化目前還不能完全從生化反應(yīng)的基本原理來推斷和計算出適合某一菌種的培養(yǎng)基配方，只能用生物化學(xué)、細胞生物學(xué)、微生物學(xué)等的基本理論，參照前人所使用的較適合某一類菌種的經(jīng)驗配方，再結(jié)合所用菌種和產(chǎn)品的特性，采用搖瓶、玻璃罐等小型發(fā)酵設(shè)備，按照一定的實驗設(shè)計和實驗方法選擇出較為適合的培養(yǎng)基當前32頁，總共55頁。發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計的基本原則根據(jù)生產(chǎn)菌株的營養(yǎng)特征配置培養(yǎng)基；營養(yǎng)成分的配比適當；滲透壓適宜pH值適當各成分的加入次序及步驟適當；當前33頁，總共55頁。3.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基設(shè)計和優(yōu)化步驟③各成分最適的濃度（正交實驗設(shè)計）①根據(jù)前人的經(jīng)驗和培養(yǎng)基成分初步確定可能的培養(yǎng)基成分；②通過單因子實驗最終確定出最為適宜的培養(yǎng)基成分；當前34頁，總共55頁。類胡蘿卜素高產(chǎn)菌Y11的培養(yǎng)基的優(yōu)化郭秒,食品與工業(yè)發(fā)酵，2004類胡蘿卜素的作用：色素、營養(yǎng)保健當前35頁，總共55頁。原培養(yǎng)基:當前36頁，總共55頁。

初步確定可能的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)當前37頁，總共55頁。

通過單因子實驗確定適宜的培養(yǎng)基成分(以碳源為例)考慮到成本：乙酸鈉是較為合適的碳源進一步：乙酸鈉的濃度2%比較好當前38頁，總共55頁。結(jié)果：碳源：乙酸鈉0.2%氮源：氯化銨0.2%

酵母膏0.03%無機鹽:復(fù)合無機鹽0.05%當前39頁，總共55頁。

正交設(shè)計確定優(yōu)化的配方當前40頁，總共55頁。當前41頁，總共55頁。改進后培養(yǎng)基的發(fā)酵結(jié)果當前42頁，總共55頁。例：青霉素發(fā)酵發(fā)酵搖瓶：玉米漿4%，乳糖10%，(NH4)SO40.8%

輕質(zhì)碳酸鈣1%發(fā)酵罐:葡萄糖流加控制總量10-15%，玉米漿總量4-8%

補加硫酸、前體等搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基和罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)差別很大當前43頁，總共55頁。搖瓶優(yōu)化配方：菌種篩選，反應(yīng)器研究的基礎(chǔ)當前44頁，總共55頁。3.3培養(yǎng)基及設(shè)備的滅菌常見滅菌方法：加熱滅菌過濾滅菌輻射滅菌化學(xué)滅菌熏蒸滅菌當前45頁，總共55頁。1）干熱滅菌烘箱內(nèi)熱空氣滅菌火焰灼燒干熱滅菌160℃，2小時1、高溫滅菌當前46頁，總共55頁。2）濕熱滅菌1）巴斯德消毒2）煮沸消毒3）丁達爾滅菌4）常規(guī)高壓滅菌121℃，15分鐘；115℃，30分鐘；135-150℃，5-15秒，工業(yè)上發(fā)酵培養(yǎng)基135-150℃，2-6秒，牛奶或其它液態(tài)食品當前47頁，總共55頁。過濾除菌對不耐熱液體培養(yǎng)基和空氣滅菌進行過濾除菌；硝酸纖維素膜和醋酸纖維素膜（0.220.45μm）核孔濾器（聚碳酸膠片）當前48頁，總共55頁。

紫外滅菌紫外線：誘導(dǎo)核酸形成胸腺嘧啶二聚體，從而干擾了核酸的復(fù)制；X射線和γ射線能使其它物質(zhì)氧化或產(chǎn)生自由基破壞和改變生物大分子的結(jié)構(gòu)，以抑制或殺死微生物。當前49頁，總共55頁?；瘜W(xué)藥品滅菌：殺菌劑、消毒劑、防腐劑；高錳酸