共聚焦細(xì)胞課

共聚焦細(xì)胞課第一頁，共七十頁，2022年，8月28日高級(jí)顯微鏡原理正置、倒置顯微鏡細(xì)胞遺傳工作站活細(xì)胞工作站激光顯微分離系統(tǒng)激光共聚焦顯微鏡第二頁，共七十頁，2022年，8月28日概述激光掃描共聚焦顯微鏡

（Laserscanningconfocalmicroscope，LSCM）生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的主要應(yīng)用

通過一種或者多種熒光探針標(biāo)記后，可對固定的組織或活體樣本進(jìn)行亞細(xì)胞水平結(jié)構(gòu)功能研究高空間分辨率、非介入無損傷連續(xù)光學(xué)切片、三維圖像、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的分析檢測……第三頁，共七十頁，2022年，8月28日ConventionalfluorescencemicroscopeConfocalmicroscope第四頁，共七十頁，2022年，8月28日光鏡2um0.02~0.2um電鏡0.1nm第五頁，共七十頁，2022年，8月28日歷史1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦顯微鏡技術(shù)的某些基本原理，獲得了美國的專利。1967年，Egger和Petran成功地應(yīng)用共聚焦顯微鏡產(chǎn)生了一個(gè)光學(xué)橫斷面。1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光與被照明物體的原子之間的非線性關(guān)系和激光掃描器的拉曼光譜學(xué)。1984年，Biorad為公司推出了世界第一臺(tái)商品化的共聚焦顯微鏡，型號(hào)為SOM-100，掃描方式為臺(tái)階式掃描。1986年MRC-500型改進(jìn)為光束掃描，用作生物熒光顯微鏡的共聚焦系統(tǒng)。第六頁，共七十頁，2022年，8月28日ConfocalmicroscopycomesofageJGWhite&WBAmos.Nature328,183-184(09July1987)Zeiss、Leica、Olympus、Nikon第七頁，共七十頁，2022年，8月28日ZeissLSM510激光掃描共聚焦顯微鏡第八頁，共七十頁，2022年，8月28日ZeissLSM510META激光掃描共聚焦顯微鏡第九頁，共七十頁，2022年，8月28日ZeissLSM510META激光掃描共聚焦顯微鏡第十頁，共七十頁，2022年，8月28日NikonA1R激光掃描共聚焦顯微鏡第十一頁，共七十頁，2022年，8月28日PrairieUltimaIV活體雙光子顯微鏡第十二頁，共七十頁，2022年，8月28日國家光電實(shí)驗(yàn)室（武漢）自制隨機(jī)定位雙光子顯微鏡第十三頁，共七十頁，2022年，8月28日LeicaTCSSP5激光共聚焦掃描顯微鏡第十四頁，共七十頁，2022年，8月28日基本原理相差、DIC常用熒光標(biāo)記共聚焦原理第十五頁，共七十頁，2022年，8月28日Twowaystoobtaincontrastinlightmicroscopy.Thestainedportionsofthecellin(A)reducetheamplitudeoflightwavesofparticularwavelengthspassingthroughthem.Acoloredimageofthecellistherebyobtainedthatisvisibleintheordinaryway.Lightpassingthroughtheunstained,livingcell(B)undergoesverylittlechangeinamplitude,andthestructuraldetailscannotbeseeneveniftheimageishighlymagnified.Thephaseofthelight,however,isalteredbyitspassagethroughthecell,andsmallphasedifferencescanbemadevisiblebyexploitinginterferenceeffectsusingaphase-contrastoradifferential-interference-contrastmicroscope.D.Phase-contrastoradifferential-interference-contrastmicroscope第十六頁，共七十頁，2022年，8月28日Fourtypesoflightmicroscopy.(A)Theimageofafibroblastincultureobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy.Theotherimageswereobtainedbytechniquesdiscussedinthetext:(B)phase-contrastmicroscopy,(C)Nomarskidifferential-interference-contrastmicroscopy,and(D)dark-fieldmicroscopy.第十七頁，共七十頁，2022年，8月28日VisiblelightdetectorSpecimenObjective1stWollastonPrism起偏器DIC檢偏器2ndWollastonPrismAnalyzerLightpathDifferentialInterferenceContrast(DIC)(Nomarski)微分干涉是利用特制的棱鏡來分解光束。分裂出來的光束的振動(dòng)方向相互垂直且強(qiáng)度相等，光束分別在距離很近的兩點(diǎn)上通過被檢物體，在相位上略有差別。由于兩光束的裂距極小，而不出現(xiàn)重影現(xiàn)象，使圖象呈現(xiàn)出立體的三維感覺第十八頁，共七十頁，2022年，8月28日常用熒光探針第十九頁，共七十頁，2022年，8月28日ProteinsNucleicAcidsDNAIonspHSensitiveIndicatorsOxidationStatesSpecificOrganelles第二十頁，共七十頁，2022年，8月28日第二十一頁，共七十頁，2022年，8月28日第二十二頁，共七十頁，2022年，8月28日第二十三頁，共七十頁，2022年，8月28日第二十四頁，共七十頁，2022年，8月28日熒光顯微鏡原理明場：透射熒光：落射落射的優(yōu)點(diǎn)：物鏡的聚光鏡作用使視場均勻，發(fā)射光強(qiáng)度高。激發(fā)光損失小，熒光效應(yīng)高。第二十五頁，共七十頁，2022年，8月28日共聚焦原理由于pinhole的存在，使得部分雜散光（虛線部分）沒有被PMT探測器探測到，從而提高了成像效果。通過對樣品在x-y方向上的逐點(diǎn)掃描，可以形成二維圖像。如果調(diào)解焦平面在z方向的位置，連續(xù)掃描多個(gè)不同z位置的二維圖像，則可以形成一個(gè)3D圖像，3D的重建需要軟件的支持。第二十六頁，共七十頁，2022年，8月28日第二十七頁，共七十頁，2022年，8月28日TheuniquescanningmoduleisthecoreoftheLSM510META.Itcontainsmotorizedcollimators,scanningmirrors,individuallyadjustableandpositionablepinholes,andhighlysensitivedetectorsincludingtheMETAdetector.Allthesecomponentsarearrangedtoensureoptimumspecimenilluminationandefficientcollectionofreflectedoremittedlight.AhighlyefficientopticalgratingprovidesaninnovativewayofseparatingthefluorescenceemissionsintheMETAdetector.Thegratingprojectstheentirefluorescencespectrumontothe32channelsoftheMETAdetector.Thus,thespectralsignatureisacquiredforeachpixelofthescannedimageandsubsequentlycanbeusedforthedigitalseparationintocomponentdyes.第二十八頁，共七十頁，2022年，8月28日第二十九頁，共七十頁，2022年，8月28日第三十頁，共七十頁，2022年，8月28日分光鏡組件結(jié)構(gòu)第三十一頁，共七十頁，2022年，8月28日第三十二頁，共七十頁，2022年，8月28日第三十三頁，共七十頁，2022年，8月28日共聚焦構(gòu)成光學(xué)顯微鏡激光光源掃描模塊（包括共聚焦光路通道和針孔、掃描鏡）光檢測器計(jì)算機(jī)系統(tǒng)（數(shù)據(jù)采集、處理、轉(zhuǎn)換應(yīng)用）圖形輸出設(shè)備第三十四頁，共七十頁，2022年，8月28日XYSequentiallyilluminatedsampleSequentiallygeneratedimage第三十五頁，共七十頁，2022年，8月28日第三十六頁，共七十頁，2022年，8月28日LCSM照片，藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為微管第三十七頁，共七十頁，2022年，8月28日圖像相關(guān)概念RGB三基色第三十八頁，共七十頁，2022年，8月28日圖像數(shù)據(jù)位第三十九頁，共七十頁，2022年，8月28日亮度第四十頁，共七十頁，2022年，8月28日對比度

第四十一頁，共七十頁，2022年，8月28日飽和第四十二頁，共七十頁，2022年，8月28日分辯率第四十三頁，共七十頁，2022年，8月28日怎樣得到樣品圖像樣品的標(biāo)記物有合適的激發(fā)波長和發(fā)射波長熒光下觀察選擇合適的圖象設(shè)置激光掃描的通道參數(shù)設(shè)置圖象的屬性調(diào)節(jié)每一個(gè)通道的亮度、對比度、清晰度、背景亮度啟動(dòng)第四十四頁，共七十頁，2022年，8月28日共聚焦和CCD照片的比較更大的動(dòng)態(tài)范圍高靈敏度圖像背景的消除靈活的拍照區(qū)域選擇ZOOM功能偽彩色環(huán)境要求高第四十五頁，共七十頁，2022年，8月28日多通道圖象合成第四十六頁，共七十頁，2022年，8月28日時(shí)間序列Ca離子成像第四十七頁，共七十頁，2022年，8月28日FRAP：FluorescenceRedistributionAfterPhotobleachingFRAP是用來測定活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，借助于高強(qiáng)度脈沖激光來照射細(xì)胞某一區(qū)域，造成該區(qū)域熒光分子的光粹滅，該區(qū)域周圍的非粹滅熒光分子會(huì)以一定的速率向受照射區(qū)域擴(kuò)散，這個(gè)擴(kuò)散速率可通過低強(qiáng)度激光掃描探測,因而可得到活細(xì)胞的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。LSCM可以控制光粹滅作用，實(shí)時(shí)監(jiān)測分子擴(kuò)散率和恢復(fù)速率，反映細(xì)胞結(jié)構(gòu)和活動(dòng)機(jī)制。廣泛用于研究細(xì)胞骨架構(gòu)成，核膜結(jié)構(gòu)跨膜大分子遷移率，細(xì)胞間通訊等領(lǐng)域。熒光漂白恢復(fù)（FRAP）第四十八頁，共七十頁，2022年，8月28日人卵細(xì)胞的局部光漂白第四十九頁，共七十頁，2022年，8月28日FRAP研究ER-GFP的核轉(zhuǎn)位第五十頁，共七十頁，2022年，8月28日熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）FRET：FluorescenceResonanceEnergyTransfer能量轉(zhuǎn)移：能量從分子的一個(gè)部位向另一個(gè)部位的傳遞，或能量從一個(gè)分子向另一個(gè)分子傳遞。能量的提供者叫能量供體，能量的接受者叫能量受體。能量共振轉(zhuǎn)移：分子可以看作為正負(fù)電荷分離的一個(gè)偶極子，受激發(fā)以一定的頻率振動(dòng)，如果其附近有一個(gè)振動(dòng)頻率相同的另一分子存在，則通過這兩個(gè)分子之間的偶極-偶極相互作用，能量可以非輻射方式從前者轉(zhuǎn)移到后者，這種能量轉(zhuǎn)移稱為共振轉(zhuǎn)移第五十一頁，共七十頁，2022年，8月28日DonorAcceptor10?＜

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＜100?

第五十二頁，共七十頁，2022年，8月28日FRET產(chǎn)生條件：兩個(gè)熒光分子：供體-FL1，受體-FL2供體與受體的距離在2-7nm供體的發(fā)射波長與受體的激發(fā)波長一致第五十三頁，共七十頁，2022年，8月28日第五十四頁，共七十頁，2022年，8月28日應(yīng)用實(shí)例一、組織光學(xué)切片對活的或固定的細(xì)胞及組織進(jìn)行無損傷的系列光學(xué)切片。這一功能又被簡稱為“細(xì)胞CT”。第五十五頁，共七十頁，2022年，8月28日二、三維圖像重建由共聚焦顯微鏡的組織光學(xué)切片功能采集獲得的二維圖像數(shù)據(jù)，經(jīng)計(jì)算機(jī)圖像處理三維重建軟件重組，可得到標(biāo)本的三維立體結(jié)構(gòu)，揭示亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的空間關(guān)系，從而能十分靈活直觀地進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。第五十六頁，共七十頁，2022年，8月28日第五十七頁，共七十頁，2022年，8月28日第五十八頁，共七十頁，2022年，8月28日三、細(xì)胞物理和生物化學(xué)測定激光掃描共聚焦顯微鏡可進(jìn)行低光探測、活細(xì)胞定量分析和重復(fù)性極佳的熒光定量分析，從而能對單細(xì)胞或細(xì)胞群的溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞骨架、結(jié)構(gòu)性蛋白質(zhì)、DNA、RNA、酶和受體分子等細(xì)胞結(jié)構(gòu)的含量、組分及分布進(jìn)行定性、定量及定位測定。另外，激光掃描共聚焦顯微鏡可以對細(xì)胞的面積、細(xì)胞周長等參數(shù)進(jìn)行自動(dòng)測定。第五十九頁，共七十頁，2022年，8月28日四、熒光的定性、定量分析激光掃描共聚焦顯微鏡可對單標(biāo)記或多標(biāo)記細(xì)胞及組織標(biāo)本進(jìn)行定量分析，并顯示熒光沿Z軸的強(qiáng)度變化；另外，借助于光學(xué)切片功能可在毫不損失分辨力的條件下測量標(biāo)本深度的熒光分布。可以準(zhǔn)確監(jiān)測抗原表達(dá)、熒光原位雜交及細(xì)胞結(jié)合和殺傷的形態(tài)學(xué)特性并進(jìn)行定量分析。第六十頁，共七十頁，2022年，8月28日五、CA2+、pH及其它細(xì)胞內(nèi)離子的動(dòng)態(tài)測量利用Fluo-3、Indo-1、Fura-Rad等多種熒光探針，激光掃描共聚焦顯微鏡可對單個(gè)細(xì)胞內(nèi)離子（Ca2+、K+、Na+、Mg2+、pH等）的動(dòng)態(tài)變化做實(shí)時(shí)定量分析；可以定量探測胞內(nèi)Ca2+對腫瘤啟動(dòng)因子、化學(xué)因子、生長因子及各種激素等刺激的反應(yīng)；使用雙熒光探針Fluo-3和SNAF可同時(shí)測定Ca2+和pH值。也就是說利用激光掃描共聚焦顯微鏡能進(jìn)行細(xì)胞生理信號(hào)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。第六十一頁，共七十頁，2022年，8月28日第六十二頁，共七十頁，2022年，8月28日共聚焦顯微鏡的局限標(biāo)記染料的光漂白：為了獲得足夠的信噪比必須提高激光的強(qiáng)度；而高強(qiáng)度的激光會(huì)使染料在連續(xù)掃描過程中迅速褪色。光毒作用：在激光照射下，許多熒光染料分子