動物細(xì)胞工程概述全

動物細(xì)胞工程概述全第1頁/共54頁動物細(xì)胞工程第2頁/共54頁第一節(jié)動物細(xì)胞工程概述一、動物細(xì)胞工程發(fā)展簡史二、動物細(xì)胞工程的主要領(lǐng)域及意義三、動物細(xì)胞特性四、動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境與營養(yǎng)要求第3頁/共54頁一、動物細(xì)胞工程發(fā)展簡史

（一）融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)（二）動物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立（三）細(xì)胞融合技術(shù)的建立和雜交瘤技術(shù)的誕生（四）動物克隆技術(shù)的建立

第4頁/共54頁（一）融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)19世紀(jì)30年代，Muller,Schwann,Virchow等相繼在肺結(jié)核、天花、水痘、麻疹等病理組織中觀察到多核細(xì)胞現(xiàn)象，但當(dāng)時并沒有引起人們的關(guān)注，認(rèn)為這只是一種特殊現(xiàn)象。

第5頁/共54頁1849年Lobing在骨髓中也發(fā)現(xiàn)了多核現(xiàn)象的存在，1855年～1858年，科學(xué)家們在肺組織和各種正常組織及發(fā)尖和壞死部位都發(fā)現(xiàn)了多核細(xì)胞。至此，自然界中廣泛存在著多核細(xì)胞的事實，才被生命科學(xué)工作者接受。第6頁/共54頁1859年，A.Barli在研究黏蟲的生活史時發(fā)現(xiàn)，某些黏蟲存在著由單個細(xì)胞核融合形成多核的原生質(zhì)團(tuán)的情況。據(jù)此，他認(rèn)為多核細(xì)胞是由單個細(xì)胞彼此融合而形成的。第7頁/共54頁

（二）動物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立

1839年Schwann和Schleiden提出細(xì)胞學(xué)說時指出：“每一個細(xì)胞應(yīng)該可以獨立生活和發(fā)展，假如具有的條件正如它存在于有機(jī)體內(nèi)一樣?！?859年，法國解剖學(xué)家Vnlpian最早嘗試將蛙胚尾部組織切下，放到普通水中“培養(yǎng)”，結(jié)果觀察到了組織的生長和分化現(xiàn)象第8頁/共54頁1880年，德國學(xué)者Arnold首次發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞在淋巴液或血清中能夠分裂1885年，Roux發(fā)現(xiàn)雞神經(jīng)板細(xì)胞在生理鹽水中培養(yǎng)能存活數(shù)月，并創(chuàng)用了“外植培養(yǎng)”和“組織培養(yǎng)”一詞1889年，Ljunggren將人體皮膚保存在腹水中幾天至幾周后再做移植手術(shù)獲得成功第9頁/共54頁

1907年，美國胚胎學(xué)家R.Harrison將蛙的胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片組織在體外不但存活了若干星期，而且還從細(xì)胞中長出了軸突(神經(jīng)纖維)細(xì)胞，解決了當(dāng)時關(guān)于軸突起源的爭論，并表明了利用體外存活的組織進(jìn)行實驗研究的可能性。他的工作被認(rèn)為是動物細(xì)胞培養(yǎng)開始的標(biāo)志第10頁/共54頁Carrel(1911)發(fā)現(xiàn)了雞胚浸出液對于某些細(xì)胞的生長具有很強(qiáng)的促進(jìn)效應(yīng)，還把無菌技術(shù)引入了組織培養(yǎng)技術(shù)中。作為他的技術(shù)標(biāo)志是，他在不含抗菌素的培養(yǎng)條件下使雞胚心臟細(xì)胞維持生存了34年，先后繼代3400次，證明動物細(xì)胞有可能在體外無限地生長。第11頁/共54頁1914年，Thomson創(chuàng)立了另一條完全不同的體外組織培養(yǎng)途徑－器官培養(yǎng)法，即器官培養(yǎng)技術(shù)。1940年，Earle建立了可以無限傳代的一個C3H小鼠的結(jié)締組織細(xì)胞系－L系。二是1951年，Gay建立了第一個人體細(xì)胞系－人體宮頸癌Hela細(xì)胞系第12頁/共54頁（三）細(xì)胞融合技術(shù)的建立

和雜交瘤技術(shù)的誕生

1958年,Okada發(fā)現(xiàn)紫外滅活的仙臺病毒可引起艾氏腹水瘤細(xì)胞彼此融合。由于仙臺病毒能穩(wěn)定地誘發(fā)細(xì)胞融合而引起了許多科學(xué)家的興趣，60年代，Harris(1965)誘導(dǎo)不同的動物體細(xì)胞融合獲得成功并能存活下來。Lifflefield(1964)根據(jù)親本細(xì)胞的酶缺陷型，利用HAT選擇性培養(yǎng)基能使親本細(xì)胞死亡而只留下異型融合細(xì)胞，并能不斷地增殖，從此形成了細(xì)胞融合到雜種細(xì)胞選擇、培養(yǎng)的一整套技術(shù)。使這一技術(shù)在此后廣泛地應(yīng)用于遺傳學(xué)、病毒學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞學(xué)等多種學(xué)科的研究工作中。

第13頁/共54頁1975年，免疫學(xué)家Kohler和Milstein利用仙臺病毒誘導(dǎo)綿羊紅細(xì)胞免疫的小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞融合，選擇到能分泌單一抗體的雜種細(xì)胞。該雜種細(xì)胞具有在小鼠體內(nèi)和體外培養(yǎng)條件下大量繁殖的能力，并能長期地分泌單克隆抗體，從而建立了小鼠淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)。這一技術(shù)的誕生把細(xì)胞融合技術(shù)從實驗階段推向了應(yīng)用研究階段，促進(jìn)了動物細(xì)胞工程的蓬勃發(fā)展。第14頁/共54頁（四）動物克隆技術(shù)的建立

1891，Heape等人首次報道了家兔胚胎移植成功的結(jié)果，他們把安哥拉家兔胚胎移植給比利時兔，得到了4只安哥拉家兔。第15頁/共54頁本世紀(jì)30年代以后，先后在羊、豬、牛等動物的胚胎移植上獲得成功。經(jīng)過幾十年的不斷完善和充實，已成為一項比較成熟的繁殖生物學(xué)技術(shù)。第16頁/共54頁首例克隆動物成功的報道是在1962年，英國學(xué)者Grudon把非洲爪蟾小腸上皮細(xì)胞的核注入同種或異種非洲爪蟾未受精卵(經(jīng)紫外線照射殺死卵細(xì)胞核)中，約有1％的重組卵發(fā)育成為成熟蛙。第17頁/共54頁這一成功開創(chuàng)了由體細(xì)胞培育動物個體的新型實驗途徑，其貢獻(xiàn)在于：實驗證明了完全分化的腸細(xì)胞仍然具有未分化細(xì)胞的全部遺傳信息，并能在一定的條件下發(fā)育成動物個體，從而證明了動物細(xì)胞仍然具有全能性；初步建立了體細(xì)胞核移植的實驗體系，證明在體細(xì)胞核轉(zhuǎn)至胚胎發(fā)育方向的早期，卵細(xì)胞質(zhì)對體細(xì)胞核的發(fā)育功能起著關(guān)鍵性的調(diào)節(jié)作用，其作用因子可能是細(xì)胞質(zhì)中的mRNA與有關(guān)的蛋白質(zhì)。

第18頁/共54頁1997年2月，英國科學(xué)家Wilmut等在世界權(quán)威雜志《Nature》上首例報道了世界第一只克隆羊的誕生。它的貢獻(xiàn)在于：實驗證明了哺乳動物高度分化的細(xì)胞同樣含有全套遺傳信息，亦能在一定條件下發(fā)育成動物個體，進(jìn)一步證明了動物細(xì)胞的全能性。

第19頁/共54頁多利誕生的技術(shù)路線：

取6歲供體羊乳腺細(xì)胞—

血清饑餓培養(yǎng)使細(xì)胞處于G0期經(jīng)GnRH處理取卵細(xì)胞—

移去卵細(xì)胞的細(xì)胞核將培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞的核移植到去核的卵細(xì)胞中重組細(xì)胞植入第一受體羊輸卵管中培養(yǎng)至胚泡期(桑椹胚)桑椹胚再移植入第二受體羊子宮內(nèi)發(fā)育至分娩。第20頁/共54頁二、動物細(xì)胞工程的主要領(lǐng)域及意義（一）單克隆抗體與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)（二）動物胚胎工程與畜牧業(yè)（三）動物細(xì)胞規(guī)?；囵B(yǎng)與現(xiàn)代醫(yī)藥業(yè)（四）動物克隆的有益應(yīng)用第21頁/共54頁（一）單克隆抗體技術(shù)單克隆抗體技術(shù)的核心是用骨髓瘤細(xì)胞(myelomacell)與經(jīng)特定抗源免疫刺激的B淋巴細(xì)胞(antigenstimulatedBlymphoblast)融合得到雜交瘤細(xì)胞(hybridomacell)，雜交瘤細(xì)胞既能象骨髓瘤細(xì)胞那樣在體外無限增殖，又具有B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體的能力。因此，單克隆抗體技術(shù)又稱為雜交瘤技術(shù)(hybridomatechnology)。

第22頁/共54頁單克隆抗體的應(yīng)用單克隆抗體具有高度的特異性與靈敏性，可以廣泛地由于臨床醫(yī)學(xué)的疾病診斷，以提高疾病診斷的準(zhǔn)確性利用單克隆抗體技術(shù)可以生產(chǎn)各種免疫疫苗，這不僅能大大降低生產(chǎn)成本，同時也增加了疫苗的安全性。單克隆抗體還有可能用于某些腫瘤的治療，是人類戰(zhàn)勝癌癥十分有望的潛在技術(shù)。單克隆抗體技術(shù)還可廣泛用于各種基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究，從而推動現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展。

第23頁/共54頁（二）胚胎工程與畜牧業(yè)利用胚胎技術(shù)可以以工廠形式大批量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)胚胎，從而可以降低胚胎成本，擴(kuò)大移植胚的來源，使農(nóng)畜動物胚胎移植的推廣應(yīng)用成為可能。體外受精可以準(zhǔn)確地確定受精的時間和胚胎發(fā)育階段，因此，利用體外受精技術(shù)進(jìn)行核移植、性別控制和基因?qū)?，可望工廠化生產(chǎn)遺傳性穩(wěn)定、生產(chǎn)性能優(yōu)良的家畜，以加快農(nóng)畜良種化。

第24頁/共54頁（三）物細(xì)胞規(guī)模化培養(yǎng)與現(xiàn)代醫(yī)藥類型產(chǎn)物人疫苗小兒麻痹癥、狂犬、風(fēng)疹、腦炎、乙肝表面抗源、皰癥、某些癌癥動物疫苗口蹄疫、雞痘病、豬霍亂、馬腦炎、牛痢疾、犬瘟、草魚出血病酶尿激酶、細(xì)胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶原激活劑激素促紅細(xì)胞生成素、促間質(zhì)細(xì)胞激素、絨膜促性腺激素、促黃體激素免疫調(diào)節(jié)因子干擾素、白細(xì)胞活化因子、轉(zhuǎn)移抑制因子、胸腺素、白細(xì)胞介素第25頁/共54頁（四）動物克隆的有益應(yīng)用

動物克隆技術(shù)至少在以下幾個方面具有廣闊的應(yīng)用前景：保存優(yōu)良的動物品種；拯救瀕臨滅絕的珍惜動物；利用克隆動物工廠生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物，發(fā)展新型的醫(yī)藥工業(yè)；利用克隆技術(shù)生產(chǎn)人體器官，擴(kuò)大器官移植所需的器官來源。第26頁/共54頁三、動物細(xì)胞特性1.動物細(xì)胞與植物細(xì)胞比較2.動物細(xì)胞在活體內(nèi)的特性3.培養(yǎng)條件下動物細(xì)胞的生長特性4.培養(yǎng)條件下動物細(xì)胞生理特性第27頁/共54頁1動物細(xì)胞與植物細(xì)胞比較第28頁/共54頁2動物細(xì)胞在活體內(nèi)的特性

·動物細(xì)胞在胚胎期即已高度分化，而且這種分化是不可逆轉(zhuǎn)的，

·

活體內(nèi)的動物細(xì)胞按照分裂能力可以分為三大類：

第一類是能保持繼續(xù)分裂能力的細(xì)胞；

第二類細(xì)胞群是永久失去分裂能力的細(xì)胞；

第三類是靜止細(xì)胞群，即所謂的G0細(xì)胞。

第29頁/共54頁3培養(yǎng)條件下動物細(xì)胞的生長特性

離體培養(yǎng)的動物細(xì)胞可分為（1）貼壁依賴型(anchorage-dependent)（2）貼壁非依賴型(anchorage-independent)（3）間性貼壁細(xì)胞第30頁/共54頁（1）貼壁依賴型簡稱貼壁細(xì)胞，包括成纖維細(xì)胞型和上皮細(xì)胞型成纖維細(xì)胞型，這種細(xì)胞與體內(nèi)成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，胞內(nèi)呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有圓形核胞質(zhì)向外2～3個長短不同的突起。除真正的成纖維細(xì)胞外，心肌、平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)時均屬這一類型。第31頁/共54頁上皮細(xì)胞型細(xì)胞培養(yǎng)時呈不規(guī)則的三角形，中央有圓形核，生長時常彼此緊密相連成單層細(xì)胞片，如皮膚的表皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、胰臟細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞第32頁/共54頁第33頁/共54頁（2）非貼壁依賴型也稱懸浮型，這類細(xì)胞培養(yǎng)時不貼附于支持物上，可在培養(yǎng)液中懸浮生長，來源于血液、淋巴組織的細(xì)胞、許多腫瘤細(xì)胞等均屬于此類，細(xì)胞一般呈圓形。第34頁/共54頁（3）兼性貼壁細(xì)胞動物細(xì)胞培養(yǎng)中，有些細(xì)胞呈現(xiàn)雙重性，既可以貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)，如中國地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠L929細(xì)胞等。第35頁/共54頁四、培養(yǎng)條件下動物細(xì)胞生理特性1.動物細(xì)胞的分裂周期較長一般為12～48小時，他不僅隨細(xì)胞種屬的不同而有差異，即使同一種屬不同部位的細(xì)胞所需的時間也不同第36頁/共54頁各類細(xì)胞分裂周期時間表第37頁/共54頁2.接觸抑制現(xiàn)象除少數(shù)懸浮細(xì)胞外，大多數(shù)正常二倍體細(xì)胞都需要在一定的基質(zhì)（如玻璃、塑料等）上貼附，伸長后才能增殖。當(dāng)細(xì)胞在基質(zhì)上分裂增殖，逐漸匯合成片，即每個細(xì)胞與其周圍的細(xì)胞相互接觸時，細(xì)胞就停止增殖，即細(xì)胞密度不再增加，這一現(xiàn)象稱為接觸抑制。第38頁/共54頁3.有限細(xì)胞系和永久細(xì)胞系大多數(shù)細(xì)胞繼代培養(yǎng)后會轉(zhuǎn)化為兩類一類是有限細(xì)胞系：有限細(xì)胞系即使培養(yǎng)條件均能滿足細(xì)胞繁殖生長，它們也只能在有限的時間內(nèi)生存，經(jīng)過有限世代后細(xì)胞將逐漸死亡。另一類是無限（永久細(xì)胞系）第39頁/共54頁永久細(xì)胞系初代培養(yǎng)物開始傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系，已獲無限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱連續(xù)細(xì)胞系或無限細(xì)胞系（infinitecellline）。第40頁/共54頁4.動物細(xì)胞的環(huán)境敏感性動物細(xì)胞與植物細(xì)胞相比，其培養(yǎng)難度要大一些，其主要原因是動物細(xì)胞只有細(xì)胞膜，而沒有細(xì)胞壁的保護(hù)動物細(xì)胞與植物細(xì)胞相比對培養(yǎng)環(huán)境十分敏感，一切影響細(xì)胞膜變形的因素都會影響動物細(xì)胞的存活。動物細(xì)胞培養(yǎng)對營養(yǎng)條件的要求也十分復(fù)雜第41頁/共54頁5.動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境與營養(yǎng)要求

動物細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)要求動物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境要求第42頁/共54頁5（1）第43頁/共54頁（2）PH動物細(xì)胞培養(yǎng)適宜的一般在7.2~7.4，低于6.8或高于7.6都不利于細(xì)胞生長，嚴(yán)重時會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對PH值的要求因培養(yǎng)時間長短有關(guān)，一般原代細(xì)胞要求較嚴(yán)格，而永久細(xì)胞則對PH有較強(qiáng)的忍耐性。第4