埃博霉素生物合成

埃博霉素生物合成第1頁(yè)/共16頁(yè)

埃博霉素（Epothilones）是一種天然產(chǎn)物，1993年由德國(guó)生物技術(shù)研究公司的科學(xué)家Hofle從降解纖維素的粘液菌，纖維堆囊菌的培養(yǎng)液中分離得到，最開始作為抗真菌藥和殺蟲劑研究，但對(duì)植物的毒性太大。1995年，美國(guó)Merck公司的科學(xué)家也獨(dú)立地分離得到了埃博霉素，并且驚奇地發(fā)現(xiàn)這些化合物能夠殺死腫瘤細(xì)胞，其作用機(jī)理與紫杉醇的機(jī)理相似，能夠促進(jìn)微管蛋白的聚合，形成穩(wěn)定的細(xì)胞微管，抑制癌細(xì)胞的分裂，從而導(dǎo)致癌細(xì)胞死亡，后來這一重大發(fā)現(xiàn)也被Hofle等證實(shí)。Epothilones第2頁(yè)/共16頁(yè)Epothilones紫杉醇在治療卵巢癌、肺癌、頭頸部癌癥和其他癌癥均表現(xiàn)出不凡的療效，市場(chǎng)總銷售額已超過200億。但是，紫杉醇生物利用度差、副作用嚴(yán)重，尋找具有微管穩(wěn)定功能又不具這些缺點(diǎn)的“后紫杉醇藥物”成為研究熱點(diǎn)。在多種藥物的篩選中埃博霉素抗癌活性最理想。第3頁(yè)/共16頁(yè)埃博霉素對(duì)許多藥物治療效果不穩(wěn)定的癌細(xì)胞以及多藥配伍易產(chǎn)生抗藥性的癌細(xì)胞也具有高活性，表現(xiàn)出對(duì)紫杉醇及其它抗癌藥物有耐藥性的癌細(xì)胞具有優(yōu)異的療效；一些全合成的埃博霉素同系物不僅能夠抑制惡性腫瘤的增長(zhǎng)，而且能使其萎縮，甚至消失，并維持很長(zhǎng)的時(shí)間不再?gòu)?fù)發(fā)，這種優(yōu)異的抗癌活性在抗癌藥物中是極其少見的。水溶性比紫杉醇更好，便于配制和使用；此外，埃博霉素不僅可以通過發(fā)酵的方法大量制備，由于結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單，也容易通過全合成得到，以及進(jìn)行化學(xué)修飾，得到其它衍生物，這對(duì)于進(jìn)一步的藥物篩選非常用。紫杉醇現(xiàn)有資源破壞嚴(yán)重，后續(xù)資源不足，埃博霉素可能是更為理想的替代。Enteryourtitlehere第4頁(yè)/共16頁(yè)結(jié)構(gòu)埃博霉素是一類16元環(huán)的大環(huán)內(nèi)酯化合物，在Ｃ15位置連接了一個(gè)含噻唑環(huán)的側(cè)鏈。由發(fā)酵制備時(shí)，埃博霉素Ａ和Ｂ是主要產(chǎn)物，埃博霉素Ｃ—Ｆ是次要產(chǎn)物，但Ｃ—Ｆ可以經(jīng)一步反應(yīng)從Ａ或者Ｂ得到。埃博霉素Ａ、Ｂ和Ｄ對(duì)癌細(xì)胞的生物活性與紫杉醇相當(dāng)，甚至更強(qiáng)，尤其是埃博霉素Ｂ，其活性比紫杉醇強(qiáng)10-100倍．在Ｃ12位上的有甲基取代，以及Ｃ12-Ｃ13雙鍵換成環(huán)氧基團(tuán)后，埃博霉素的活性將極大提高。A:R=HB:R=MeC:R=HD:R=MeE:R=HF:R=Me第5頁(yè)/共16頁(yè)埃博霉素作為極其有潛力的抗癌新藥，引起了全世界的化學(xué)家、生物學(xué)家及藥學(xué)家的極大興趣和研究熱情。從1993年發(fā)現(xiàn)至今十多年時(shí)間，有關(guān)埃博霉素的研究報(bào)告達(dá)500多篇，天然的埃博霉素Ａ和Ｂ已經(jīng)進(jìn)入了臨床Ⅱ期試驗(yàn)，化學(xué)合成的埃博霉索Ｂ內(nèi)酰胺已經(jīng)進(jìn)入了臨床Ⅲ期試驗(yàn)。

Enteryourtitlehere如果說紫杉醇從發(fā)現(xiàn)到成為藥品上市經(jīng)過了二十多年的時(shí)間，埃博霉索成為臨床用藥可能只需要十多年的時(shí)間。第6頁(yè)/共16頁(yè)發(fā)酵是大規(guī)模生產(chǎn)的理想途徑，不似有機(jī)合成的繁瑣，并有望提高產(chǎn)量，也能改變埃博霉素累化合物的種類，產(chǎn)生多種埃博霉素類似物。篩選更廣泛的埃博霉素產(chǎn)生菌是一條有效的途徑，埃博霉素發(fā)酵的提升潛能還很大。但高產(chǎn)菌株難獲得，生產(chǎn)周期長(zhǎng)。現(xiàn)有的生物合成體系用于大規(guī)模生產(chǎn)仍有一定局限性。

全合成生物合成埃博霉素結(jié)構(gòu)較紫杉醇簡(jiǎn)單化學(xué)合成備受關(guān)注。埃博霉素一問世，就相繼報(bào)道了數(shù)十條全合成路線。目前全合成的方法不下30種，但具有商業(yè)價(jià)值的全合成方法必須具備合成步驟短、雜質(zhì)片段少、總產(chǎn)率高這３個(gè)優(yōu)勢(shì)。目前全合成埃博霉素步驟冗長(zhǎng)，產(chǎn)率低，全合成生產(chǎn)仍在逐步完善。合成第7頁(yè)/共16頁(yè)埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物的半合成

埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物＞埃博霉素D＞埃博霉素B＞埃博霉素A＞紫杉醉第8頁(yè)/共16頁(yè)ＮＴＧ（亞硝基胍）誘變選育埃博霉素高產(chǎn)菌株

發(fā)酵生產(chǎn)埃博霉素B化學(xué)結(jié)構(gòu)修飾埃博霉素B內(nèi)酰胺美國(guó)施貴寶公司的埃博霉素B內(nèi)酰胺衍生物（“依沙匹隆”）規(guī)格45mg/支批發(fā)價(jià)為2765.89美元

第9頁(yè)/共16頁(yè)Enteryourtitlehere菌種誘變?nèi)±w維堆囊菌于5mLG52培養(yǎng)基培養(yǎng)48ｈ，離心收集菌體，用pH6.0的磷酸緩沖液洗滌兩次，然后重懸于５mLpH6.0的磷酸緩沖液中，制成菌懸液。取NTG母液，加入菌懸液中，配制成各濃度的含NTG的菌懸液，在不同溫度下進(jìn)行誘變處理30min。將菌懸液4℃離心，用冷無菌水洗滌３次以終止誘變。加入相同體積的Ｇ52液體培養(yǎng)基，30℃，180rpm培養(yǎng)1.5h，渡過生理延時(shí)期。將誘變后的菌液用無菌生理鹽水十倍稀釋，涂于VY/2平板，30℃，培養(yǎng)２-３ｄ。

G52培養(yǎng)基：酵母粉2g／L，MgSO4?7H２O

1g／L，CaCl2?２H２O1g／L，脫脂奶粉2g／L，馬鈴薯淀粉8g/L，無水葡萄糖2g／L，EDTA鐵鈉8mg/L，KOH調(diào)pH至7.4VY/2固體培養(yǎng)基：酵母提取物5g/L,CaCl2?2H2O1g／L，VB12

0.5mg／L，Agar15ｇ／L，KOH調(diào)pH至7.2第10頁(yè)/共16頁(yè)Enteryourtitlehere正突變菌初篩

取直徑1-2mm的單菌落接種于G52液體培養(yǎng)基，30℃、180rpm振蕩培養(yǎng)３d，接入1B12發(fā)酵培養(yǎng)基。6ｄ后，于培養(yǎng)平板上放置牛津杯，在杯中加發(fā)酵液。每個(gè)平板上都有一個(gè)原種的發(fā)酵液作為對(duì)比，平板上涂有古巴１號(hào)AS2.1189.5釀酒酵母。正突變菌復(fù)篩

2-3ｄ后挑選有藍(lán)色抑菌圈且抑菌圈大于原種的菌落，于G52液體培養(yǎng)３ｄ后，再接于1B12培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)６ｄ，最后取發(fā)酵液16000rpm，７min離心后取上清液通過高效液相色譜檢測(cè)產(chǎn)物峰。

色譜條件：色譜柱：Agilent

XDB-Ｃ18，200×4.6ｍｍ；柱溫：30℃；檢測(cè)：250nm，UV-DAD；流動(dòng)相：磷酸-乙腈溶液。

第11頁(yè)/共16頁(yè)Enteryourtitlehere分析選取高產(chǎn)菌株

將標(biāo)準(zhǔn)品EpothilonesB溶于色譜純的甲醇溶液，配制成一系列濃度，分別為：5ug/mL、20ug/mL、40ug/mL、50ug/mL。使用HPLC檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)樣，進(jìn)樣量為20uL，每個(gè)濃度進(jìn)樣三次以保證數(shù)據(jù)的正確性。同時(shí)使用色譜純甲醇進(jìn)行空白對(duì)照。埃博霉素的出鋒時(shí)間在16min左右，將各個(gè)濃度所得的數(shù)據(jù)匯總，以濃度為橫座標(biāo)，鋒面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。比較復(fù)篩菌液上清的出峰時(shí)間是否與標(biāo)準(zhǔn)品一致，已確定結(jié)果是否可信。利用樣品峰面積和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求算產(chǎn)物濃度，并與原種比較，選取最優(yōu)菌株。第12頁(yè)/共16頁(yè)Enteryourtitlehere發(fā)酵

取選出的高產(chǎn)菌株接種于500mL1B12培養(yǎng)基，加入吸附樹脂（XAD-16），發(fā)酵培養(yǎng)6d。將發(fā)酵液過濾得樹脂，純水洗滌2次，加10ml甲醇洗脫。減壓蒸除溶劑，用乙酸乙酯抽提，減壓蒸干。第13頁(yè)/共16頁(yè)Enteryourtitlehere化學(xué)修飾

埃博霉素B（98g，199.4mmol）疊氮鈉（15.54g，24mmol）懸浮于THF-H2O（5：1）2L，氮脫氣20min，加三苯基膦鈀在氬氣環(huán)境下45℃催化反應(yīng)1h，冷至25℃。加1M三甲基膦-THF450ml，攪拌2h。用H