DNA的合成與修復

DNA的合成與修復第1頁/共71頁第十二章DNA復制與修復

1.掌握遺傳信息傳遞的中心法則。2.

掌握DNA復制的一般規(guī)律：DNA的半保留復制、DNA的半不連續(xù)復制的概念。3.

了解三種大腸桿菌DNA聚合酶的催化特性及其功用；了解原核生物DNA的復制過程。4.

了解使DNA損傷的因素；DNA損傷的修復機制：錯配修復、堿基切除修復、核苷酸切除修復、直接修復、重組修復及傾向差錯的修復的過程及過程所需要的酶類；了解DNA損傷修復的意義。目的要求第2頁/共71頁1964-1970發(fā)現勞氏肉瘤病毒的遺傳信息傳遞方式：逆轉錄

1953年，Watson和Crick提出中心法則：遺傳信息的單向流動。

中心法則：病毒（復制）復制轉錄DNARNA蛋白質翻譯逆轉錄RNA的復制存在于RNA病毒DNA是生物遺傳的主要物質基礎，生物機體的遺傳信息以密碼的形式編碼在DNA分子上，表現為特定的核苷酸排列順序，并通過DNA的復制由親代傳遞給子代。在后代的生長發(fā)育過程中，遺傳信息自DNA轉錄給RNA,然后翻譯成特異的蛋白質，以執(zhí)行各種生命功能，使后代表現出與親代相似的遺傳性狀。第十二章DNA復制與修復第3頁/共71頁

復制：以親代DNA或RNA為模板，根據堿基配對的原則，在一系列酶的作用下，生成與親代相同的子代DNA或RNA的過程。幾個基本概念：

逆轉錄：以RNA為模板，在逆轉錄酶的作用下，生成DNA的過程。

翻譯：亦叫轉譯，以mRNA為模板，將mRNA的密碼解讀成蛋白質的氨基酸順序的過程。

轉錄：以DNA為模板，按照堿基配對原則合成RNA，即將DNA所含的遺傳信息傳給RNA，形成一條與DNA鏈互補的RNA的過程。第十二章DNA復制與修復第4頁/共71頁Reversetranscription中心法則圖示第5頁/共71頁一、DNA的半保留復制2.半保留復制的實驗證據:1.定義：1958年Meselson和Stahl用同位素15N標記大腸桿菌DNA,首先證明了DNA的半保留復制。以親代DNA雙鏈為模板以堿基互補方式合成子代DNA，這樣新形成的子代DNA中，一條鏈來自親代DNA，而另一條鏈則是新合成的，這種復制方式叫半保留復制。第十二章DNA復制與修復第6頁/共71頁DNA復制的可能方式全保留與全新復制分散復制半保留復制第7頁/共71頁DNA半保留復制圖示：第8頁/共71頁半保留復制的證明：Meselson和Stahl將同位素15N標記的15NH4Cl加入大腸桿菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12代，使大腸桿菌的DNA都帶上15N的標記，然后將該大腸桿菌轉入14N的普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，分離子一代、子二代、子三代、子四代DNA，進行氯化銫密度梯度離心，實驗證明了DNA的半保留復制。第十二章DNA復制與修復第9頁/共71頁15N-DNA的密度大于14N-DNA的密度第10頁/共71頁第11頁/共71頁親代DNA（15N～15N）子一代DNA（15N～14N）子二代DNA(15N～14N，14N～14N1:1)子三代DNA(15N～14N，14N～14N1:3)子四代DNA(15N～14N，14N～14N1:7)親代DNA與子二代DNA的混合物親代DNA與子四代DNA的混合物第12頁/共71頁復制中的大腸桿菌染色體放射自顯影圖第13頁/共71頁DNA的半保留復制的生物學意義：DNA在代謝上的穩(wěn)定性并非指DNA是一種惰性物質。

DNA的半保留復制表明DNA在代謝上的穩(wěn)定性，是保證親代的遺傳信息穩(wěn)定地傳遞給后代必要措施。第十二章DNA復制與修復第14頁/共71頁雙向復制單向復制第15頁/共71頁二、DNA復制的起點與方向第16頁/共71頁復制中的DNA

復制原點復制叉第十二章DNA復制與修復第17頁/共71頁DNA復制的主要方式大腸桿菌雙鏈環(huán)狀DNA的復制（一個復制起點，雙向復制）3不同位置D-環(huán)式復制方式（線粒體雙鏈環(huán)狀DNA：兩條鏈的復制起點不同位置，且復制不同步）真核細胞線狀染色體DNA的復制方式（多個復制起點，雙向復制）單向滾環(huán)式復制（噬菌體X174DNA—單鏈環(huán)狀）第18頁/共71頁三、DNA復制的半不連續(xù)性前導鏈滯后鏈岡崎片段前導鏈：以3’→5’方向的親代鏈為模板連續(xù)合成的子代鏈。滯后鏈：以5’→3’方向的親代鏈為模板的子代鏈先逆復制叉移動方向合成岡崎片段，再連接成滯后鏈。第19頁/共71頁半不連續(xù)復制的發(fā)現

同位素實驗，用含3H的dT標記用T4噬菌體感染的大腸桿菌短時間內分離的DNA均為DNA小片段一段時間后檢測到DNA大片段。當用DNA連接酶的缺失的變異株時，檢測到大量DNA片段的積累?！C明DNA復制中有小片段合成。測定DNA小片段，遠遠大于合成DNA的一半。似乎兩條鏈都是不連續(xù)合成的，后發(fā)現是由于U替代dT滲入DNA中，而被尿嘧啶-N-糖基酶切除所致。在缺少尿嘧啶-N-糖基酶的突變植株中，DNA的U不再被切除，則檢測到一半3H標記出現在小片段（岡崎片段）中。1968日本學者岡崎：第20頁/共71頁四、與DNA復制有關的酶和蛋白質原料：四種脫氧核苷三磷酸（dATP、dGTPdCTPdTTP)需要模板：以DNA為模板鏈，合成子代DNA，模板可以是雙鏈，也可以是單鏈DNA。合成產物與模板互補。需要引物：一小段RNA(或DNA）為引物，在大腸桿菌中，DNA的合成需要一段RNA鏈作為引物，引物含3’-OH.合成方向：53(一)DNA聚合酶：1956年Kornberg等在大腸桿菌中首先發(fā)現DNA聚合酶，其后發(fā)現該酶在許多生物中廣泛存在。該酶的催化性質如下：第十二章DNA復制與修復第21頁/共71頁（二）大腸桿菌DNA聚合酶（1）53聚合酶功能（但持續(xù)合成DNA的能力差）；（2）3

5’外切酶活性（對雙鏈無作用，在正常聚合條件下，此活性不能作用于生長鏈，只作用于生長中不配對的單鏈，校對功能。）；（3）還具有53’外切酶活性（雙鏈有效）；第十二章DNA復制與修復1、DNA聚合酶Ⅰ:1956年Kornberg首先從大腸桿菌中分離。該酶為單體酶,含一個鋅原子。為多功能酶，具有:該酶缺失時大腸桿菌仍具有DNA合成酶活性，只是對DNA損傷的修復能力下降，容易導致變異和死亡。推測該酶主要是對DNA損傷的修復，以及在DNA復制時RNA引物切除及其缺口的填補。第22頁/共71頁DNA聚合酶催化的反應：第23頁/共71頁ⅠDNA聚合酶Ⅰ的功能第24頁/共71頁ArthurKornberg1918

StanfordUniversity

Stanford,CA,USA

TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1959"fortheirdiscoveryofthemechanismsinthebiologicalsynthesisofribonucleicacidanddeoxyribonucleicacid"第25頁/共71頁2、DNA聚合酶Ⅱ：多亞基酶，聚合作用，聚合活力比DNA聚合酶Ⅰ高；持續(xù)合成DNA的能力差。該酶缺失時大腸桿菌仍具有DNA合成能力，推測該酶仍然不是真正的DNA聚合酶。該酶具有3’5’外切酶活性。其功能可能在修復紫外光引起的DNA損傷中起作用。第十二章DNA復制與修復第26頁/共71頁3、DNA聚合酶Ⅲ

多亞基酶，含十種亞基:（αβγθτδδ’χΨε），其中（αεθ）稱為核心酶，β2稱為夾子，（γ2δδ’χΨ）組成γ復合物，其主要功能是幫助β亞基夾住DNA，故稱為夾子裝配器，該酶DNA合成的持續(xù)能力強，主要與該結構有關。另外，該酶合成速度大，活性高，缺失時大腸桿菌因DNA復制抑制而致死。因此認為該酶DNA的真正復制酶。第十二章DNA復制與修復第27頁/共71頁DNA聚合酶Ⅲ全酶的亞基組成亞基相對分子量亞基數目基因亞基功能αεθτγδδ’χΨβ1320002700010000710005200035000330001500012000370002222211114dnaEdnaQholEdnaXdadX＊holAholBholCholDdnaN聚合作用3’→5’外切酶的校對功能組建核心酶使核心酶二聚化依賴DNA的ATP酶，形成γ復合物與β亞基結合，形成γ復合物形成γ復合物形成γ復合物形成γ復合物兩個β亞基形成滑動夾子，以提高酶的持續(xù)合成能力。第28頁/共71頁DNA聚合酶Ⅲ的異二聚體前導鏈的合成滯后鏈的合成第29頁/共71頁DNA聚合酶Ⅲ的β-鉗子俯視圖DNA雙螺旋第30頁/共71頁大腸桿菌三種聚合酶比較DNA聚合酶ⅠDNA聚合酶ⅡDNA聚合酶Ⅲ結構基因＊不同種類的亞基數目相對分子質量3’→5’外切酶5’→3’外切酶聚合速度（核苷酸/分）持續(xù)合成能力功能PolA1103,000＋＋1,000-1,2003-200切除引物，修復PolB≥788,000＋－2,4001,500修復PolC≥10830,000＋－15,000-60,000≥500,000復制大腸桿菌三種DNA聚合酶比較第31頁/共71頁(三）DNA連接酶：連接DNA雙鏈中的單鏈切口作用特點：大腸桿菌和其它細菌的DNA連接酶要求NAD+提供能量；在高等生物和噬菌體中，則要求ATP提供能量。T4噬菌體的DNA連接酶不僅能連接雙鏈DNA上的粘性切口，而且能連接無粘性末端的平頭雙鏈DNA。DNA連接酶在DNA復制、損傷修復、重組等過程中起重要作用。第十二章DNA復制與修復第32頁/共71頁DNA連接酶作用機理第33頁/共71頁(四)與DNA合成有關的其它蛋白因子(大腸桿菌中)蛋白質功能相對分子量（×103）分子/細胞DNA旋轉酶（或拓撲異構酶）DNA解鏈酶單鏈結合蛋白引物合成酶DNA聚合酶Ⅰ引入或松開超螺旋使雙鏈DNA解鏈穩(wěn)定單鏈區(qū)合成RNA引物除去引物并填滿缺口40065746010950300100300第34頁/共71頁1、拓撲異構酶拓撲異構酶：催化DNA的拓撲連環(huán)數發(fā)生變化的酶，在DNA重組修復和其它轉變方面起重要作用。除連環(huán)數不同外其它性質均相同的DNA分子稱為拓撲異構體，引起拓撲異構體反應的酶稱為拓撲異構酶。第十二章DNA復制與修復第35頁/共71頁拓撲異構酶?：使DNA一條鏈發(fā)生斷裂和再連接。作用是松解負超螺旋，反應不需要能量。主要集中在活性轉錄區(qū)，同轉錄有關。拓撲異構酶Π：使DNA兩條鏈發(fā)生斷裂和再連接。當引入負超螺旋時需要由ATP提供能量，同復制有關。兩類拓撲異構酶作用特點:第十二章DNA復制與修復

二者共同控制DNA的拓撲結構。第36頁/共71頁第37頁/共71頁2、解螺旋酶（解鏈酶）

通過水解ATP將DNA兩條鏈打開。E.coli中的rep蛋白就是解螺旋酶，還有解螺旋酶I、II、III。每解開一對堿基需要水解2個ATP分子。穩(wěn)定DNA解開的單鏈，防止復性和保護單鏈部分不被核酸酶水解。3、單鏈結合蛋白：第十二章DNA復制與修復第38頁/共71頁引發(fā)體可以沿模板鏈5’

3’方向移動,具有識別合成起始位點的功能，移動到一定位置上即可引發(fā)RNA引物的合成。移動和引發(fā)均需要ATP提供能量，n’蛋白具有ATP酶的活力。引發(fā)體的移動與復制叉移動的方向相同，與岡崎片段的合成方向相反。3、引物合成酶與引發(fā)前體引物合成酶：催化引物RNA的生成第十二章DNA復制與修復

引發(fā)前體:它由多種蛋白質dnaA、dnaB、dnaC、n、n’、n’’和i組成。引發(fā)前體再與引發(fā)酶結合組裝成引發(fā)體。第39頁/共71頁（五）、參與DNA復制的酶與蛋白因子總覽圖第40頁/共71頁五、DNA的復制過程：（以大腸桿菌為例）復制的終止：復制的起始1、起始復合物的形成：稱為引發(fā)2、RNA引物的合成鏈的延伸：第十二章DNA復制與修復第41頁/共71頁復制原點oriC和原點的識別：從復制原點到終點，組成一個復制單位，叫復制子（基因組獨立進行復制的單位）。

DNA的復制有特定的起始位點，叫做復制原點。常用oriC(或o）表示。大腸桿菌的復制原點oriC由245個bp構成，含兩組保守的重復序列：三個13bp的序列（富含A、T的序列）和四個9bp的序列；許多生物的復制原點也都是富含A、T的區(qū)段。復制原點由DnaA蛋白識別，在原點由DnaB蛋白（解螺旋酶）將雙螺旋解開成單鏈狀態(tài)，分別作為模板，合成其互補鏈(DNA雙鏈的解開還需DNA拓撲異構酶Π、SSB),在原點處形成一個眼狀結構，叫復制眼。第42頁/共71頁（一）復制起始1、拓撲異構酶解開超螺旋。2、DnaA蛋白識別并在ATP存在下結合于四個9bp的重復序列。3、在類組蛋白（HU、ATP參與下,DanA蛋白變性13個bp的重復序列,形成開鏈復合物。4、DnaB借助于水解ATP產生的能量在DnaC的幫助下沿5’

→3’方向移動，解開DNA雙鏈，形成前引發(fā)復合物。5、單鏈結合蛋白結合于單鏈。6、引物合成酶（DnaG蛋白）開始合成RNA引物。第43頁/共71頁第44頁/共71頁(二)鏈的延長（岡崎片段的合成）

真核生物的岡崎片段為：100-200bp原核生物的岡崎片段為：1000-2000bp第45頁/共71頁DNA鏈的延伸在DNA聚合酶Ш的催化下，以四種5’-脫氧核苷三磷酸為底物，在RNA引物的3’端以磷酸二酯鍵連接上脫氧核糖核苷酸并釋放出焦磷酸。DNA鏈的延伸同時進行前導鏈和滯后鏈的合成。兩條鏈方向相反。

前導鏈滯后鏈岡崎片段半不連續(xù)復制岡崎模型第46頁/共71頁岡崎片段引物的切除、缺口的填補和切口的連接:第47頁/共71頁前導鏈和滯后鏈的合成（DNA聚合酶的異二聚體催化）第48頁/共71頁第49頁/共71頁(三)復制的終止順時針終止陷阱逆時針終止陷阱Ter:終止陷阱，引起復制終止的特定區(qū)域，20bp的序列，終止利用物質Tus可識別并結合，從而導致DNA復制的終止。第50頁/共71頁大腸桿菌DNA

復制的終止第51頁/共71頁(四)DNA復制的精確性（高保真復制）1、堿基的配對規(guī)律：摸板鏈與新生鏈之間的堿基配對保證堿基配錯幾率約為1/104～1/105。2、DNA聚合酶的3’→5’外切酶活性的校對功能，使堿基的錯配幾率又降低100～1000倍。3、DNA的損傷修復系統(tǒng)。第十二章DNA復制與修復DNA復制必須具有高度精確性，在大腸桿菌的細胞DNA復制中其錯誤率約為1/109～1/1010，即每109～1010個核苷酸才出現一個錯誤，也就是大腸桿菌染色體DNA復制1000～10000次才出現一個核苷酸的錯誤。這么高的精確性的保證主要與下列因素有關：第52頁/共71頁六、復制起始

的時序控制第53頁/共71頁七、真核生物DNA復制的特點4、真核生物染色體在全部復制完之前起點不再重新開始復制；而在快速生長的原核生物染色體DNA復制中，起點可以連續(xù)發(fā)動復制。真核生物快速生長時，往往采用更多的復制起點。第十二章DNA復制與修復1、真核生物染色體有多個復制起點，稱為自主復制序列（ARS）或復制基因(replicator);多復制眼，呈雙向復制，多復制子。2、岡崎片段長約200bp。3、真核生物DNA復制速度比原核慢，速度為1000～3000bp/min(僅為原核生物的1/20～1/50）。第54頁/共71頁真核DNA復制特點7、RPA：真核生物的單鏈結合蛋白；RNaseH1和MF-1切除RNA引物，DNA聚合酶ε填補缺口。第十二章DNA復制與修復5、真核生物有多種DNA聚合酶,DNA聚合酶Ⅲ（δ）是真正的復制酶，在PCNA存在下有持續(xù)的合成能力。PCNA稱為增殖細胞核抗原，相當于大腸桿菌DNA聚合酶Ⅲ的β-夾子，RFC蛋白相當于夾子裝配器。6、真核生物線性染色體兩端有端粒結構，它是由許多成串的重短復序列組成，端粒功能是穩(wěn)定染色體末段結構，防止染色體間的末端連接，并可補償滯后鏈5’-末段在消除RNA引物后造成的空缺，使染色體保持一定長度。端粒酶是含一段RNA的逆轉錄酶.第55頁/共71頁真核細胞內有五種DNA聚合酶DNA聚合酶αDNA聚合酶β

DNA聚合酶γ

DNA聚合酶δDNA聚合酶ε定位亞基數目外切酶活性引物合成酶活性持續(xù)合成能力抑制劑功能細胞核4－＋中等蚜腸霉素引物合成細胞核1－－低雙脫氧TTP修復線粒體23’→5’外切酶－高雙脫氧TTP線粒體DNA合成細胞核23’→5’外切酶－有PCNA時高蚜腸霉素核DNA合成細胞核＞15’→3’外切酶－高蚜腸霉素修復第56頁/共71頁真核細胞DNA復制示意圖第57頁/共71頁八、DNA損傷的修復DNA突變：

DNA的核苷酸順序永久性的改變稱為DNA的突變。其主要形式有：

1.點突變：DNA分子中一個堿基對替代另一個堿基對稱為點的突變。

2.插入作用：DNA分子中插入一個或幾個堿基稱為插入作用。

3.缺失作用：

DNA分子中缺失一個或多個堿基對稱為缺失作用。DNA在復制時產生錯配，病毒基因整合，某些物化因子如紫外光、電離輻射和化學誘變等，都可能使DNA的結構及功能發(fā)生改變。從而引起生物突變，甚至導致死亡。DNA的損傷與DNA突變：第58頁/共71頁DNA突變可能導致腫瘤的發(fā)生:著色性干皮?。簩︵奏ざ垠w和大的DNA損傷修復酶的缺失而產生的一種皮膚癌。

沉默突變：突變影響非必需的DNA或突變對一個基因的功能的影響可忽略，稱為沉默突變。回復突變：一些突變可以克服第一次突變造成的影響，這類突變稱為回復突變。動物細胞的突變與癌的發(fā)生有強烈的相關性。通常生物體DNA的損傷有一系列的修復機制，如：錯配修復、堿基的切除修復、核苷酸的切割修復、直接修復、重組修復等。第59頁/共71頁DNA損傷的修復機制:1、參與錯配修復的酶與蛋白質Dam甲基化酶;MutH、MutL、MutS蛋白;解螺旋酶Ⅱ;DNA聚合酶Ⅲ;外切酶Ⅰ、Ⅹ、Ⅶ；RecJ核酸酶DNA連接酶；SSB（一）錯配修復第十二章DNA復制與修復第60頁/共71頁MutS識別并結合與堿基錯配