LCMS原理簡(jiǎn)介的教案

LCMS原理簡(jiǎn)介的教案第1頁(yè)/共62頁(yè)主要組成部分:1.進(jìn)樣部分2.離子源3.質(zhì)量過(guò)濾器(分析器)4.離子檢測(cè)器第2頁(yè)/共62頁(yè)離子源質(zhì)量過(guò)濾/分析器檢測(cè)器進(jìn)樣部分樣品板LC或GCEI源FAB源MALDI源ESI源QuadruopoleIontrapTime-of-flight電子倍增器閃爍計(jì)數(shù)器

+++++++++++++++++++++++++++++++++++++第3頁(yè)/共62頁(yè)

進(jìn)樣部分要求：大氣壓下的樣品要進(jìn)入高真空的質(zhì)譜儀，而不影響儀器的真空度。方式：進(jìn)樣板進(jìn)樣進(jìn)樣頭進(jìn)樣毛細(xì)管進(jìn)樣（從氣相色譜及液相色譜柱）

第4頁(yè)/共62頁(yè)C:MALDI激光解吸附離子源

Matrix-AssistedlaserDesorption/IonizationMALDI源的出現(xiàn)解決了生物大分子的離子化難題，離子化過(guò)程與FBI有相似之處。1、使用基質(zhì)，但基質(zhì)為固體。2、MALDI用脈沖激光束轟擊樣品和基質(zhì)的共結(jié)晶。對(duì)基質(zhì)的要求是能吸收337nm紫外光并氣化，能量由基質(zhì)傳給樣品使樣品一起氣化并離子化。第5頁(yè)/共62頁(yè)第6頁(yè)/共62頁(yè)第7頁(yè)/共62頁(yè)常用基質(zhì)1、α氰基－4羥基－肉桂酸CCA多肽2、3,5－二甲氧基－4－羥基肉桂酸SA蛋白3、龍膽酸（2,5－二羥基苯甲酸DHB聚合物4、吡啶甲酸PA5、3－羥基吡啶甲酸3HPAMALDI源由氮激光器產(chǎn)生短周期脈沖激光，產(chǎn)生的多為單電荷離子，效率很高，即使只有極少的樣品也可分析第8頁(yè)/共62頁(yè)常用基質(zhì)結(jié)構(gòu)DHBSACCA第9頁(yè)/共62頁(yè)MALDI的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)1、質(zhì)量數(shù)可達(dá)300,000Da。2、attomole至femtomole級(jí)靈敏度。3、軟電離方式，無(wú)或極少碎片離子。4、耐鹽（樣品含鹽可達(dá)毫摩爾濃度）。5、適于分析復(fù)雜混合物。缺點(diǎn)1、分辨率低。2、1000Da以下基質(zhì)峰干擾。3、激光解吸附離子化有可能使樣品光降解。4、串聯(lián)質(zhì)譜功能較弱，除非接反射裝置進(jìn)行源后衰變測(cè)量。5、不能分析非共價(jià)鍵相互作用。6、定量時(shí)需要內(nèi)校準(zhǔn)。7、如沒(méi)有反射飛行裝置，不能分析多肽修飾。8、對(duì)各種賦形劑的容忍度低（如含磷酸緩沖液，大于150mM的鹽等。第10頁(yè)/共62頁(yè)Samplesubmission

Insolution,asconcentratedaspossible,volume10-20ul

MinimumConcentration10pmol/microliter

Use200ulPCR-styleeppendorftubes

ThesampleshouldNOTcontainany

AzideSDS

Brij35Trisbase

CHAPSTritonX-100,TreducedTritonX-100

DMSOTween

DMFZwittergent

Glycerolanyotherdetergent

Phosphatebuffers

Saltsandbuffers>100mMThefollowingcomponentsareACCEPTABLE

Aceticorformicacid

Acetonitrile,ethanol

Guanidine/HCl4M

Hexafluoroisopropanolupto40%

Methanol

Sodiumchloride10mM

Urea1M第11頁(yè)/共62頁(yè)D:ESI離子源

ElectrosprayIonization4000v強(qiáng)電場(chǎng)中，樣品溶液通過(guò)毛細(xì)管噴嘴噴出，帶電液滴被靜電場(chǎng)吸向質(zhì)譜人口，同時(shí)伴隨干燥或加熱干燥氣體吹送，使液滴表面溶劑揮發(fā),液滴體積變小，表面電荷密度變大，當(dāng)同種電荷之間的庫(kù)侖斥力達(dá)到雷利極限時(shí)，突破表面張力，液滴爆裂為更小的帶電液滴，這一過(guò)程不斷重復(fù)，使最終的液滴非常細(xì)小，呈噴霧狀，此時(shí)液滴表面電場(chǎng)非常強(qiáng)大，使分析物離子化，帶單電荷或多電荷。一般分析物分子量<2000Da帶單電荷或雙電荷

>2000Da帶多電荷第12頁(yè)/共62頁(yè)第13頁(yè)/共62頁(yè)NANO-ESI噴霧照片第14頁(yè)/共62頁(yè)ESI特點(diǎn)1、ESI產(chǎn)生的生物大分子離子如多肽蛋白等常常帶10個(gè)以上電荷，使得m/z大大減小，彌補(bǔ)了四極桿質(zhì)量分析器等質(zhì)量范圍窄的缺點(diǎn)。2、質(zhì)譜圖顯示的是離子帶不同電荷數(shù)的一系列質(zhì)荷比峰，根據(jù)峰位置換算成質(zhì)量數(shù)和電荷數(shù)。第15頁(yè)/共62頁(yè)電荷數(shù)和質(zhì)量數(shù)的計(jì)算已知

mj=(m+nj)/nj

mk=(m+nk)/nk

nj=nk+1

推算出

nj=(mk-1)/(mk-mj)nk=(mj-1)

/(mk-mj)m=mj·nj-nj=mk·nk-nkm/z相對(duì)豐度mjmk第16頁(yè)/共62頁(yè)ESI優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)1、質(zhì)量數(shù)可達(dá)70，000Da2、靈敏度高達(dá)femtomole級(jí)。3、軟電離，可觀察生物分子非共價(jià)反應(yīng)。4、易于和LC串聯(lián)，直接分析流速為1ml/min的LC洗脫液。5、沒(méi)有基質(zhì)干擾。6、適于聯(lián)四極桿質(zhì)量分析器、離子阱質(zhì)量分析器做結(jié)構(gòu)分析。7、帶多電荷，允許質(zhì)量范圍窄的設(shè)備檢測(cè)高質(zhì)量數(shù)的離子。8、帶多電荷，通過(guò)計(jì)算平均值給出更精確的質(zhì)量數(shù)。9、特別適于測(cè)多肽的修飾。10、樣品前處理簡(jiǎn)單可直接分析RP-HPLC脫鹽處理的溶液。缺點(diǎn)1、耐鹽能力低。2、對(duì)某些化合物特別敏感，污染難清洗。3、樣品需先氣化，混合物不適用。4、帶多電荷，在分析混合物時(shí)，產(chǎn)生混亂。5、定量時(shí)需內(nèi)校準(zhǔn)。第17頁(yè)/共62頁(yè)

質(zhì)量分析器（過(guò)濾器）第一節(jié)：質(zhì)量分析器的主要指標(biāo)A、質(zhì)量范圍（ｍ/ｚ）所能測(cè)量的質(zhì)荷比范圍[M+nH]??B、靈敏度一定濃度樣品產(chǎn)生響應(yīng)時(shí)，最低的濃度值。n第18頁(yè)/共62頁(yè)D、分辨率質(zhì)譜分辨不同質(zhì)荷比離子的能力

分辨率R=M/ΔΜa=M?/(M?－M?)b

a公式定義為單峰的質(zhì)荷比與其半峰寬之比

b公式定義為相鄰的相交10％的兩個(gè)峰M?M?

按a式計(jì)算的分辨率約為b式計(jì)算的兩倍。第19頁(yè)/共62頁(yè)不同分辨率譜圖效果第20頁(yè)/共62頁(yè)

離子阱質(zhì)量分析器

三維的四極桿，RF加在環(huán)形電極上。第21頁(yè)/共62頁(yè)質(zhì)量分析器的串聯(lián)目的：碰撞誘導(dǎo)產(chǎn)生碎片離子，進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析

Collision-induceddissociation(CID)Ionsourceiondaughteriongranddaughterion選擇離子MSCIDMS/MSCIDMS/MS/MS第22頁(yè)/共62頁(yè)空間串聯(lián)質(zhì)譜儀A、串聯(lián)四極桿（三級(jí)四極桿）

triple-QuadrupoleAnalyzerQ?為過(guò)濾單元Q?為碰撞單元Q?為分析單元第23頁(yè)/共62頁(yè)第24頁(yè)/共62頁(yè)時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀A、離子阱質(zhì)譜儀：第25頁(yè)/共62頁(yè)幾種串聯(lián)質(zhì)譜優(yōu)缺點(diǎn)對(duì)比優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)三級(jí)四極桿質(zhì)量精度高，分辨率好碰撞能量低，碎片不完全。RTOF價(jià)廉前體離子選擇困難子離子分辨率低。FTMS質(zhì)量精度最高，子離子分辨率好，非常適合多級(jí)質(zhì)譜低能量碰撞，需超導(dǎo)磁體，價(jià)高。離子阱相對(duì)價(jià)廉，質(zhì)量精度高，分辨率好，適合多級(jí)質(zhì)譜低能量碰撞Q－TOF質(zhì)量精度高，分辨率好，前體離子選擇性好，ESI、MALDI均可接。需高真空，價(jià)高。第26頁(yè)/共62頁(yè)第27頁(yè)/共62頁(yè)第五章、質(zhì)譜在生物學(xué)中的應(yīng)用一、肽質(zhì)量指紋譜鑒定蛋白。二、串聯(lián)質(zhì)譜鑒定蛋白技術(shù)第28頁(yè)/共62頁(yè)三、肽序列標(biāo)簽技術(shù)

通過(guò)測(cè)部分氨基酸序列，結(jié)合此序列前后的離子質(zhì)量和肽段母離子質(zhì)量進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，稱為肽序列標(biāo)簽技術(shù)。第29頁(yè)/共62頁(yè)四、O標(biāo)記從頭測(cè)序技術(shù)

蛋白酶解時(shí)，酶解液中H2

O和H2

O各占50％，酶解后肽段的羧基端上的羥基氧O/O豐度比1：1，使Y型離子系列的M+2/M同位素峰的豐度高于正常未標(biāo)記O的離子的同位素豐度比。181816181618第30頁(yè)/共62頁(yè)五、磷酸化蛋白質(zhì)的鑒定A：MAＬＤＩ－ＴＯＦ結(jié)合磷酸酶水解磷酸化蛋白MS蛋白酶水解MS磷酸酶脫HPO3MS通過(guò)比較幾級(jí)質(zhì)譜圖，比較質(zhì)量數(shù)少80Da或80倍數(shù)的肽段。第31頁(yè)/共62頁(yè)B、串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行母離子、中性丟失掃描，分析含HPO3的肽段產(chǎn)生的特征離子，直接從混合肽段中找出磷酸化肽段。

第32頁(yè)/共62頁(yè)C、PRD-MALDI-MS

用源后衰變技術(shù)尋找質(zhì)量數(shù)少80Da或98Da的肽段來(lái)判斷磷酸肽。

第33頁(yè)/共62頁(yè)D、用IMAC技術(shù)分離/富集磷酸肽對(duì)比前后質(zhì)譜變化尋找磷酸肽。

IMACimmobilizedmetalaffinity固相金屬親和色譜。

IMAC

對(duì)磷酸肽有高選擇結(jié)合能力，富集后用高PH或磷酸鹽洗脫后測(cè)質(zhì)譜

。

第34頁(yè)/共62頁(yè)E、磷酸化位點(diǎn)的確定找到磷酸肽后，串聯(lián)質(zhì)譜子離子掃描模式對(duì)磷酸肽進(jìn)行序列分析。第35頁(yè)/共62頁(yè)F、磷酸化定量分析1、N穩(wěn)定同位素標(biāo)記法：N培養(yǎng)基1415N培養(yǎng)基14第36頁(yè)/共62頁(yè)2、同位素親和標(biāo)記法細(xì)胞池1細(xì)胞池2混合β消除＋氘Β消除＋氫親和純化酶解MS磷酸肽或磷酸化蛋白在緘性環(huán)境下發(fā)生β消除，同時(shí)用親核試劑攻擊形成的雙鍵并發(fā)生加成反應(yīng)，親核試劑一種為氘原子、一種為氫原子，再接上一個(gè)親和標(biāo)簽（如生物素biotin），混合酶解，提取含biotin的肽段進(jìn)行MS檢測(cè)。第37頁(yè)/共62頁(yè)六、糖基化蛋白的鑒定A、用糖甙內(nèi)切酶切斷糖鏈與蛋白鏈間的糖甘鍵，將反應(yīng)前后的質(zhì)譜圖比較，可知糖鏈的平均質(zhì)量。第38頁(yè)/共62頁(yè)B、糖基化位點(diǎn)的確定先用蛋白酶酶解成含糖鏈和不含糖鏈的肽段，獲得其肽質(zhì)量指紋譜，再用糖苷內(nèi)切酶切除糖鏈，其肽質(zhì)量指紋譜將發(fā)生變化，含糖肽段發(fā)生丟失位移，通過(guò)網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)檢索其序列，找到位點(diǎn)。第39頁(yè)/共62頁(yè)C、用凝集素直接提取含糖肽段，再結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)分析凝集素對(duì)含糖肽段有專一親和性第40頁(yè)/共62頁(yè)七、質(zhì)譜在蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用A、穩(wěn)定同位素代謝標(biāo)記技術(shù)。前面已介紹B、同位素親和標(biāo)簽技術(shù)ICAT專一與Cys共價(jià)結(jié)合第41頁(yè)/共62頁(yè)優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)1、兼容分析任何條件下的體液、細(xì)胞、組織中的絕大部分蛋白。2、烷化反應(yīng)在鹽、去垢劑/穩(wěn)定劑（如SDS、尿素鹽酸胍等）存在下都可進(jìn)行。3、只分析含Cys殘基的肽段，降低分析復(fù)雜性。

缺點(diǎn)ICAT本身分子量較大（500Da左右）增加數(shù)據(jù)檢索復(fù)雜性。無(wú)法分析不含Cys的蛋白。第42頁(yè)/共62頁(yè)2DLC-MS的基本原理第43頁(yè)/共62頁(yè)Why2DLC/MS?可鑒定極端具有pI、疏水性、分子量的蛋白質(zhì)適合膜蛋白重復(fù)性好容易自動(dòng)化上樣量大高靈敏度（溶液酶切）可根據(jù)樣品靈活配置（但最后一維一般為RP）第44頁(yè)/共62頁(yè)ThenwhySCX/RP/MS?SCX和RP的分離原理是互補(bǔ)的SCX按荷電情況，PR按疏水性流動(dòng)相是兼容的pH3，ACN/water/saltSCX流動(dòng)相中的鹽可以在RP時(shí)有效去除Trypticpeptides在SCX柱上可以有效保留Trypticpeptides在SCX條件下是穩(wěn)定的第45頁(yè)/共62頁(yè)Separationpower

Peakcapacities2DE ~500-10,000 proteinspots

AffinityChromatography >2IonexchangeChromatography >10 proteinlevelGelfiltration <10ReversedPhaseChromatography ~50

IonExchangeChromatography ~25ReversedPhaseChromatography ~100 peptidelevel2DLC(IEX/RPC) ~2,500

LinearITMSn ~18,000mph*

*measurementsperhour第46頁(yè)/共62頁(yè)MS/MSMSGelGelspotProteolyticpeptidesMixtureofProteinsDigestionProteolyticpeptidesDigestionLCProteinIdentificationWorkflowsPeakFindingPeaklistSearchofaSequenceCollectionIdentifiedandProteinsProteinCandidatesSignificanceTestingProteinFunction?SequenceSimilaritySearch第47頁(yè)/共62頁(yè)RPCIEXRPCtrapRPCtrapon-lineelutionbysalt

plugstotrapcolumnIEXoff-linegradient

elutionwith“classical”

fractioncollectionRPC2DLC的三種配置形式IEXRPCin-lineMudPIT第48頁(yè)/共62頁(yè)on-line2D-LC優(yōu)點(diǎn)全自動(dòng)樣品體積可根據(jù)后續(xù)RPC調(diào)整在線脫鹽、濃縮自由選擇緩沖鹽缺點(diǎn)SCX峰容量有限ACN濃度在IEX和RPC得一致兩相分離都沒(méi)能在最佳狀態(tài)下進(jìn)行

RPCIEXRPCtrapRPCtrap第49頁(yè)/共62頁(yè)off-lineSCXwithfractioncollection優(yōu)點(diǎn)兩維分離都有可能在最佳狀態(tài)下進(jìn)行，得到最好分辨率和峰容量可自由選擇緩沖體系樣品體積可根據(jù)后續(xù)RPC調(diào)整速度快（只需一個(gè)SCX操作）SCX餾份可留待以后分析缺點(diǎn)自動(dòng)化程度低

IEXGradientelutionwith“classical”

fractioncollectionRPC第50頁(yè)/共62頁(yè)Thesecretbehindsensitivity

Reducingcolumndimensions

75μmI.D.columnsand200nl/minarethestandardtoday

scalecolumnI.D.columnvolumetypicalflowrategainin

[μm](100mmlength)[μl][μl/min]sensitivity

analytical4.6001.7001.0001

narrow2.1003502005

micro1.000804021

capillary30074237

nano750.50.23.322

75μmI.D.columnsand200nl/minarethestandardtoday第51頁(yè)/共62頁(yè)TandemMS第52頁(yè)/共62頁(yè)DatadependentMS/MS基本原則先做一次全掃描（fullMS)，記錄Ｘ個(gè)豐度最高的離子然后依次對(duì)這X個(gè)離子進(jìn)行CID,做MS/MS(fullMS2)然后再做全掃描,下一個(gè)datadependentMS/MS開(kāi)始Dynamicexclusion某個(gè)離子在做了一定次數(shù)（比如2次）的MS/MS后，將在一定時(shí)間內(nèi)（比如3min）不再作為侯選離子。第53頁(yè)/共62頁(yè)+多肽的裂解第54頁(yè)/共62頁(yè)碎片離子的命名第55頁(yè)/共62頁(yè)

Residuename(A-Z) monoisotopicmass averagemass A 71.03711 71.0788 B 114.53493 114.59625 C 103.00919 103.1388 D 115.02694 115.0886 E 129.04259 129.1155 F 147.06841 147.1766 G 57.02146 57.0520 H 137.05891 137.1412 I 113.08406 113.1595 J 0.0 0.0 K 128.09496 128.1742 L 113.08406 113.1595 M 131.04049 131.1925