中藥中黃曲霉毒素的檢測(cè)

關(guān)于中藥中黃曲霉毒素的檢測(cè)第一頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日目錄真菌毒素簡(jiǎn)介黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹黃曲霉毒素檢測(cè)藥典收載情況藥典檢測(cè)方法詳解注意事項(xiàng)及實(shí)驗(yàn)室建議第二頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日真菌毒素簡(jiǎn)介真菌毒素：由產(chǎn)毒真菌在適宜的環(huán)境條件下產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，由真菌菌核產(chǎn)生。Mycotoxin：源于希臘語(yǔ)（Mykes）和拉丁語(yǔ)（Toxicum）第三頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日常見(jiàn)真菌毒素分類真菌種類所產(chǎn)毒素曲霉屬黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A鐮刀菌屬玉米赤霉烯酮、T-2毒素、嘔吐毒素、伏馬毒素青霉屬展青霉素、桔青霉素第四頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日真菌毒素監(jiān)控意義真菌毒素對(duì)食品安全的危害真菌毒素對(duì)種、養(yǎng)殖業(yè)的危害真菌毒素對(duì)制藥行業(yè)的危害（中藥）國(guó)際貿(mào)易中作為技術(shù)壁壘在國(guó)際反恐和戰(zhàn)爭(zhēng)中，真菌毒素可作為大規(guī)模殺傷性生化武器第五頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日黃曲霉毒素概述黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉等菌種產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物第六頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日黃曲霉毒素的發(fā)現(xiàn)1960年，在英國(guó)東南部一些農(nóng)場(chǎng)中，有大約10萬(wàn)只火雞不明原由地突然死亡。1961年發(fā)現(xiàn)火雞飼料中混有的花生粉能夠使大鼠誘發(fā)肝癌。1962年，研究發(fā)現(xiàn)花生粉中含有一種熒光物質(zhì)是導(dǎo)致?；痣u死亡的病因，這種熒光物質(zhì)被證實(shí)為黃曲霉的代謝產(chǎn)物，故命名為“黃曲霉毒素(Aflatoxins)”。第七頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日存在極其廣泛主要存在于土壤，動(dòng)植物及各種堅(jiān)果中。家庭自制發(fā)酵食品等也經(jīng)常發(fā)現(xiàn)黃曲霉毒素。一般在熱帶和亞熱帶地區(qū)，食品中黃曲霉毒素的檢出率比較高。未能及時(shí)曬干或儲(chǔ)藏不當(dāng)?shù)募Z食容易產(chǎn)生，在農(nóng)作物正常的生長(zhǎng)期中也可以形成。第八頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日毒性極強(qiáng)1993年黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）劃定為Ⅰ類致癌物，是一種毒性極強(qiáng)的劇毒物質(zhì)，僅次肉毒毒素，是目前已知霉菌中毒性最強(qiáng)的。急性毒性：比氰化鉀大10倍，比砒霜大68倍慢性毒性：肝臟損害，呈急性肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性和膽管增生。脾臟和胰臟也有輕度的病變。第九頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日中藥中容易產(chǎn)生黃曲霉毒素的品種種子、果實(shí)、糧谷類中藥材發(fā)酵類中藥材動(dòng)物類中藥材油性成分多的中藥材含上述種類藥材的中成藥第十頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日黃曲霉毒素的種類及性質(zhì)根據(jù)在紫外線照射下產(chǎn)生熒光顏色的不同，分為B族和G族兩大類及其衍生物B族G族藍(lán)色熒光黃綠色熒光第十一頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日化學(xué)結(jié)構(gòu)基本結(jié)構(gòu)：是一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的二呋喃香豆素的衍生化合物目前發(fā)現(xiàn)約20余種，已分離鑒定出12種：B1、B2、G1、G2、M1、M2、P1、Q、H1、GM、B2a和毒醇。B1：最常見(jiàn)、毒性及致癌性最強(qiáng)第十二頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日化學(xué)結(jié)構(gòu)式第十三頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日理化性質(zhì)黃曲霉毒素相對(duì)分子量312～346難溶于水，易溶于油、甲醇、丙酮和氯仿等有機(jī)溶劑，但不溶于石油醚、己烷和乙醚在中性及酸性溶液中較穩(wěn)定，但在pH為1～3的強(qiáng)酸性溶液中稍有分解，在pH為9～10的堿性溶液中分解迅速第十四頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日純品為無(wú)色結(jié)晶耐高溫，黃曲霉毒素B1的分解溫度為268℃紫外線對(duì)低濃度黃曲霉毒素有一定的破壞性第十五頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日黃曲霉毒素現(xiàn)有檢測(cè)方法介紹薄層層析法：靈敏度低，定量困難HPLC-紫外檢測(cè)法：不衍生，靈敏度低，采用UPLC可以增強(qiáng)靈敏度HPLC-熒光檢測(cè)法：需衍生，靈敏度高高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：不需衍生，靈敏度高，假陽(yáng)性少，成本高第十六頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日免疫化學(xué)分析方法

?酶聯(lián)免疫吸附法：快速、簡(jiǎn)便、單一毒素、假陽(yáng)多

?免疫親和柱-熒光分光光度法：高效、無(wú)毒、假陽(yáng)多

?微柱篩選法：半定量，測(cè)總量

?一步式黃曲霉毒素檢測(cè)金標(biāo)試紙法：快速、現(xiàn)場(chǎng)大批量初篩第十七頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日黃曲霉毒素檢測(cè)藥典收載情況2005年增補(bǔ)本附錄

第一次增加了黃曲霉毒素測(cè)定法2010年版一部

?正文：僵蠶、陳皮、酸棗仁、桃仁、胖大海品種項(xiàng)下增加了黃曲霉毒素殘留量檢查

?附錄：繼續(xù)收載了黃曲霉毒素測(cè)定法第十八頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日2010年版一部第二增補(bǔ)本修訂了附錄方法?刪除了流速規(guī)定?增訂了另一種衍生方法：即光化學(xué)衍生法?取消了免疫親和柱的品牌規(guī)定2015年版四部通則2351黃曲霉毒素測(cè)定法?增加了第二法：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法?增加附注：“當(dāng)測(cè)定結(jié)果超出限度時(shí)，采用第二法進(jìn)行確認(rèn)”第十九頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日2015年版四部通則增加中藥中真菌毒素測(cè)定指導(dǎo)原則?基本原則（中藥中真菌毒素的分類、監(jiān)控品種、測(cè)定方法、限值擬定）?基本內(nèi)容（高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法）第二十頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日2015年版四部通則9302中藥有害殘留物限量制定指導(dǎo)原則中關(guān)于黃曲霉毒素的規(guī)定“由于黃曲霉毒素毒性強(qiáng)，目前國(guó)際上不建議設(shè)定黃曲霉毒素的安全耐受量和無(wú)毒作用劑量，也無(wú)最大限量理論值計(jì)算公式，限量越低越好”。第二十一頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日《中國(guó)藥典》2015年版正文收載品種根及根莖類：遠(yuǎn)志果實(shí)種子類：大棗、肉豆蔻、決明子、麥芽、陳皮、使君子、柏子仁、胖大海、蓮子、桃仁、檳郎、酸棗仁、薏苡仁動(dòng)物類：僵蠶、水蛭、地龍、全蝎、蜈蚣共19種，較2010年版藥典增加14種第二十二頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日黃曲霉毒素藥典檢測(cè)方法詳解液相條件：C18，甲醇-乙腈-水（40:18:42）衍生方式：柱后碘衍生、柱后光化學(xué)衍生混合對(duì)照品溶液的制備：液體標(biāo)液（B1\B2\G1\G2=1\0.3\1\0.3ug/ml）梯度稀釋500倍第二十三頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日供試品溶液的制備：15g粉末，3gNaCl，70%甲醇提取，免疫親和柱純化測(cè)定：吸取混合對(duì)照品溶液5μl、10μl、15μl、20μl、25μl，注入色譜儀，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取供試品溶液20-25μl，測(cè)定第二十四頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日方法來(lái)源：《中國(guó)藥典》2015年版四部通則2351黃曲霉毒素測(cè)定法基本步驟?提取

?凈化（活化、上樣、洗雜、洗脫）

?測(cè)定

?隨行質(zhì)量控制（質(zhì)控樣、隨行加樣回收）第二十五頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日泵流操作架免疫親和柱HPLC-熒光檢測(cè)器光化學(xué)衍生器自動(dòng)固相萃取儀第二十六頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日凈化步驟取15ml（離心后的提取液），加水至50ml濾過(guò)，取20ml，通過(guò)免疫親和柱，流速3ml/min加水洗滌兩次，每次10ml過(guò)空氣10秒，將水?dāng)D出柱子分次加甲醇1.5ml，自然洗脫，過(guò)空氣，定容至2ml第二十七頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日免疫親和柱的原理利用抗原－抗體免疫反應(yīng)的原理，使用大劑量的單克隆抗體，選擇性的將樣品提取液中的黃曲霉毒素吸附，用水將雜質(zhì)洗脫除去，再用甲醇定量將黃曲霉毒素洗脫，達(dá)到分離凈化目的黃曲霉毒素單克隆抗體雜質(zhì)第二十八頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日黃曲霉毒素的衍生化衍生原因

黃曲霉毒素B1、G1熒光遇水要淬滅，檢測(cè)前需要衍生化第二十九頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日藥典附錄收載的兩種衍生方法

?碘衍生法：碘作為衍生劑，對(duì)衍生溫度有要求，試劑對(duì)儀器有腐蝕性，需要沖洗

?光化學(xué)衍生法：紫外光燈（254nm）照射，操作簡(jiǎn)單，對(duì)衍生溫度無(wú)要求，不需要其他衍生劑，無(wú)需沖洗對(duì)黃曲霉毒素B1和G1進(jìn)行衍生，黃曲霉毒素B2和G2不受該衍生步驟的影響第三十頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日AFB1AFG1黃曲霉毒素的衍生化第三十一頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日黃曲霉毒素的衍生化第三十二頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日結(jié)果報(bào)告低于檢測(cè)限（標(biāo)出檢測(cè)限）

報(bào)告具體值

未檢出限度內(nèi)限度外報(bào)告具體值第三十三頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日方法難點(diǎn)痕量分析——ppb級(jí)，要求高靈敏度毒性強(qiáng)，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)性——安全防護(hù)措施基質(zhì)復(fù)雜第三十四頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日注意事項(xiàng)取樣的代表性

黃曲霉毒素在樣品中分布不均勻免疫親和柱的使用

儲(chǔ)存、使用溫度（使用說(shuō)明書(shū)）安全防護(hù)

操作人員專門培訓(xùn)，全程穿工作服佩戴手套注意事項(xiàng)及實(shí)驗(yàn)室建議第三十五頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日對(duì)照品的使用使用黃曲霉毒素混合對(duì)照品，不使用黃曲霉毒素固體純品自行配置

對(duì)照品貯備液避光、低溫、密閉保存，工作液現(xiàn)配現(xiàn)用第三十六頁(yè)，共三十九頁(yè)，編輯于2023年，星期日