SDSPAGE測量蛋白質分子量解析

SDSPAGE測量蛋白質分子量解析第1頁/共31頁實驗目的學習聚丙烯酰胺凝膠聚合原理；學習不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠分離原理；掌握垂直板電泳的操作方法；學習SDS測蛋白分子量原理并測定。聚丙烯酰胺凝膠電泳—PAGE(Polyacryamidegelelectrophoresis)第2頁/共31頁支持介質－聚丙烯酰胺凝膠聚合原理：單體丙烯酰胺Acr交聯劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis化學聚合光聚合引發(fā)劑（NH4)2S2O8

（NH4)2S2O8

核黃素

加速劑TEMEDDMAPNTEMED注：（NH4)2S2O8

過硫酸胺在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反應

TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺DMAPNβ－二甲基胺基丙晴第3頁/共31頁第4頁/共31頁影響聚合因素大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應終止，所以在聚合過程中要使反應液與空氣隔絕。某些材料如有機玻璃，能抑制聚合反應。某些化學藥物可以減慢反應速度，如赤血鹽。溫度高聚合快，溫度低聚合慢。堿性條件下凝膠易聚合，其聚合速度與AP濃度的平方根成正比。聚丙烯酰胺凝膠優(yōu)點

化學性質穩(wěn)定；凝膠孔徑可調；重復性好；分辨率高；靈敏度高，可以測定10-6濃度的樣品。第5頁/共31頁凝膠濃度的計算聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個重要參數T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個單體的總百分濃度。C是與T有關的交聯百分濃度。T與C的計算公式是：上式中a為丙烯酰胺的克數，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數，m為水或緩沖液體積（ml）。式中a與b的比例很重要。富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應在30左右。）第6頁/共31頁分子量范圍與凝膠濃度的關系物質分子量范圍適用的凝膠濃度（%）蛋白質<104

1-4×104

4×104-1×105

1-5×105

>5×10520-3015-2010-155-102-5核酸<104

104-105

105-2×10610-205-10

2-2.5第7頁/共31頁5%10%15%294566972002945669720029456697200第8頁/共31頁

579111315T%AB凝膠濃度T對樣品遷移率的影響例：混合蛋白質A,B，A分子量較小，B分子帶電荷較多，T＝5％時，電泳行為主要以電荷起作用，B遷移速度快。當T增加，分子篩效應增加，B的遷移速度減慢；T＝9％時，A，B的遷移率相同，不能分開，T再增加，凝膠孔徑更小，A分子比B分子小，表現較高的遷移率。并且說明電泳只獲得單一的帶時，并不能證明是單一的均一成分。遷移率第9頁/共31頁

不連續(xù)凝膠電泳（disc）的分離原理(一).原理不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)具有與一般電泳的①電荷效應分離外，還具有②濃縮效應與③分子篩效應，因而，能提高電泳的分辨率；使電荷性質與密度相近的但分子量有差別的分子得以分離；或分子量相近、性質一樣、電荷性質與密度有差別的分子可以分離；或電荷性質、分子量大小相近，但構型不同時亦可分離。不連續(xù)凝膠電泳洗脫堿性不連續(xù)－分離酸性樣品酸性不連續(xù)－分離堿性樣品大多數蛋白質分子呈酸性或中性，適合用堿性系統(tǒng)進行電泳分離。第10頁/共31頁①濃縮效應

1.凝膠的組成：濃縮膠為大孔徑（?。㏕＜5％，分離膠一般為小孔徑（濃）T﹥7.5％。樣品在較稀的凝膠上自由遷移，直至濃凝膠時，便形成一道柵欄，所有的樣品分子在濃縮膠的界面堆積成一窄帶，得到濃縮，然后，再依據分子量的大小進行電泳分離。

2.緩沖液的組成:圖示。PH系統(tǒng)的不連續(xù)，各種分子的電荷之間的差異進行分離。

3.緩沖體系的不連續(xù)，其中各組成的離子、快慢離子遷移快慢的差別是影響樣品濃縮效應的重要因素。

4.離子的遷移速率及濃度的不連續(xù)又造成電場強度與電導率的變化。第11頁/共31頁②分子篩效應移動界面到達濃縮膠和分離膠界面時，凝膠的PH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的解離迅速增加，直至完全解離出gly-,其分子量小，遷移超過蛋白質分子。而喪失夾擊的作用；同時，凝膠的孔徑變小，降低了蛋白質的遷移率。故蛋白質分子在均一的電壓梯度和PH值中泳動，依其分子量的大小而分開。③電荷效應第12頁/共31頁操作垂直柱狀，板狀的不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)的組成和配制；均一凝膠與梯度凝膠配制；電極緩沖液系統(tǒng)；樣品的準備；加樣要求電泳檢測PH8.3PH6.7PH8.9PH8.3

垂直柱狀，板狀的不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)的組成和配制第13頁/共31頁緩沖液系統(tǒng)濃縮凝膠緩沖液0.5mol/LTris-HCl,PH6.8分離凝膠緩沖液1.5mol/LTris-HCl,PH8.8電極緩沖液系統(tǒng)

0.025mol/LTris（三羥甲基氨基甲烷）0.2mol/Gly(甘氨酸)PH8.3樣品緩沖液

0.1mol/LTris-HCl,PH6.8,40%甘油、0.05mg/ml溴酚藍樣品緩沖液的要求：選擇合適的PH與離子強度，以保證樣品的溶解性、穩(wěn)定性、生物活性。并加入便于觀察電泳前沿的指示劑。第14頁/共31頁標準蛋白質樣品標準蛋白質樣品：是一組（5～7種）已知的合適的分子量范圍的、構形相近的一套蛋白質，溶解在樣品緩沖液中備用。樣品的濃度分析目的、檢測方法和樣品的組成是關鍵；未知樣品濃度：0.1～20mg/ml考瑪斯亮籃染色：1～2mg/ml銀染色:0.02～0.2mg/ml

高純度樣品：0.5～2mg/ml加樣電泳

光吸收檢測考瑪斯亮籃染色染色銀染色第15頁/共31頁SDS測蛋白質分子量SDS是在PAG系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS能斷裂分子內和分子間氫鍵，破壞蛋白質的二級和三級結構，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結合，形成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物，這種復合物由于結合大量的SDS，使蛋白質喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負離子團塊，從而降低或消除了各種蛋白質分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質的結合是按重量成比例的，因此在進行電泳時，蛋白質分子的遷移速度取決于分子大小。當分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數，若將已知分子量的標準蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條標準曲線，未知蛋白質在相同條件下進行電泳，根據它的電泳遷移率即可在標準曲線上求得分子量。第16頁/共31頁

SDS電泳的成功關鍵之一是電泳過程中，待別是樣品制備過程中蛋白質與SDS的結合程度。影響結合的因素主要有三個：溶液中SDS單體的濃度。當單體濃度大于1mmol/L時大多數蛋白質與SDS結合的重量比為1:1.4，如果單體濃度降到0.5mmol/L以下時，兩者的結合比僅為1:0.4。這樣就不能消除蛋白質原有的電荷差別；為保證蛋白質與SDS的充分結合，它們的重量比應該為1:4或1:3；樣品緩沖液的離子強度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強度較低，通常是10～100mmol/L；二硫鍵是否完全被還原。第17頁/共31頁采用SDS測蛋白質MW時，只有完全打開二硫鍵，蛋白質分子才能被解聚，SDS才能定量地結合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數的線性關系。因此在用SDS處理樣品同時常用巰基乙醇處理，巰基乙醇是強還原劑，可使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質溶解而與SDS定量結合。有許多蛋白質是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。已發(fā)現有些蛋白質不能用SDS測定分子量。如電荷異常或構象異常的蛋白質，帶有較大輔基的蛋白質（某些糖蛋白）以及一些結構蛋白，如膠原蛋白等。一般至少采用兩種方法測定未知樣品的分子量，互相驗證。第18頁/共31頁

實驗試劑和器材

1.材料：

低分子量標準蛋白試劑盒:

低分子量標準蛋白：兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌動蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000

胰蛋白酶抑制劑MW=20,100

雞蛋清溶菌酶MW=14,400

根據說明書處理標準蛋白

樣品：稱3mg樣品，加2ml蒸餾水溶解。第19頁/共31頁2.實驗試劑

(1)30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺

（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中，

4℃貯存可用1-2月。

（2）10%SDS（十二烷基硫酸鈉）

（3）1.5mol/LpH8.8Tris-HCl分離膠緩沖液：稱取

Tris18.2g加入50ml水，用1mol/L鹽酸調pH8.9，最

后用蒸餾水定容至100ml。

（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl濃縮膠緩沖液：稱取

Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調pH6.8，

最后用蒸餾水定容至100ml。

（5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl樣品溶解緩沖液：稱取

Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調pH6.8，最

后用蒸餾水容至100ml。

第20頁/共31頁（7）10%過硫酸銨(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+

溴酚藍（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.3Tris-

HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。

（11）染色液：稱取考馬斯亮藍R2500.125g，加上述固定液

250ml，過濾后備用。

（12）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml。

（13）電極緩沖液（內含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。

2.實驗試劑第21頁/共31頁實驗步驟1.裝板：

將垂直板型電泳裝置內的板狀凝膠模子取出，將玻璃片洗凈、涼干、嵌入凹槽中，形成一個“夾心”凝膠腔，把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽。將電泳槽、凝膠模子串成一體的垂直板型電泳裝置，垂直放置在水平臺面上，灌注膠液?！z配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產生氣泡。※水封的目的是為了使分離膠上延平直，并隔絕空氣?！z聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。第22頁/共31頁分離膠(10%15ml)濃縮膠(5%5ml)ddH2O5.4ml3.2ml30%Acr5.0ml0.85mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl3.8ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl0.65ml10%SDS150μl50μl10%Ap150μl50μlTEMED500μl200μl

配膠

第23頁/共31頁3.樣品及MW標準參照物溶液的制備樣品溶液和上樣緩沖液混勻，使用前在100℃水浴1min，以除去可能出現的亞穩(wěn)態(tài)聚合物。4.上樣。15μl/孔5.電泳上槽接負極，下槽接正極，打開電泳儀開關，開始時將電流調至10mA，待樣品進入分離膠時，將電流調至20-30mA。待指示劑染料靠遷移至下沿1～1.5cm處停止電泳，需2～3h。6.凝膠板剝離與染色：電泳結束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內，將凝膠放入0.05%考馬斯亮藍R250（內含20％磺基水楊酸）染色液中，使染色液沒過膠板，染色30min左右。第24頁/共31頁7.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數次，用7％乙酸浸泡漂洗數次，直至背景藍色褪去蛋白質區(qū)帶清晰為止。如用50℃水浴或脫色搖床，則可縮短脫色時間。

*剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分8.MW的計算以標準蛋白質MW的對數對相對遷移率作圖，得到標準曲線，根據待測樣品相對遷移率，從標準曲線上查出其MW。=

蛋白樣品距加樣端遷移距離cm溴酚藍區(qū)帶中心距加樣端距離cm

相對遷移率第25頁/共31頁注意事項丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的最大暴露量不超過0.5μg/kg，皮膚接觸可致中毒，癥狀為紅斑、脫皮、眩暈、動作機能失調、四肢無力等。丙烯酰胺是神經毒劑，可以透過皮膚，不要接觸皮膚，戴手套、口罩操作。一定要催化充分，使之完全聚合。沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近。集中處理，實驗中全部的膠由專門受過訓練的人收集到一起，在一個特殊標明的容器中保存，并進一步催化使之反應完全，最后送交學校危險品倉庫，統(tǒng)一處理。第26頁/共31頁Forexample:MarkersProetinsA