SDSPAGE測量蛋白質(zhì)分子量解析

SDSPAGE測量蛋白質(zhì)分子量解析第1頁/共31頁實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶W(xué)習(xí)聚丙烯酰胺凝膠聚合原理；學(xué)習(xí)不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠分離原理；掌握垂直板電泳的操作方法；學(xué)習(xí)SDS測蛋白分子量原理并測定。聚丙烯酰胺凝膠電泳—PAGE(Polyacryamidegelelectrophoresis)第2頁/共31頁支持介質(zhì)－聚丙烯酰胺凝膠聚合原理：單體丙烯酰胺Acr交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺Bis化學(xué)聚合光聚合引發(fā)劑（NH4)2S2O8

（NH4)2S2O8

核黃素

加速劑TEMEDDMAPNTEMED注：（NH4)2S2O8

過硫酸胺在凝膠形成中提供始自由基，通過自由基的傳遞，使丙烯酰胺成為自由基，發(fā)動聚合反應(yīng)

TEMEDN，N，N，N-四甲基乙二胺DMAPNβ－二甲基胺基丙晴第3頁/共31頁第4頁/共31頁影響聚合因素大氣中氧能淬滅自由基，使聚合反應(yīng)終止，所以在聚合過程中要使反應(yīng)液與空氣隔絕。某些材料如有機(jī)玻璃，能抑制聚合反應(yīng)。某些化學(xué)藥物可以減慢反應(yīng)速度，如赤血鹽。溫度高聚合快，溫度低聚合慢。堿性條件下凝膠易聚合，其聚合速度與AP濃度的平方根成正比。聚丙烯酰胺凝膠優(yōu)點(diǎn)

化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定；凝膠孔徑可調(diào)；重復(fù)性好；分辨率高；靈敏度高，可以測定10-6濃度的樣品。第5頁/共31頁凝膠濃度的計(jì)算聚合后的聚丙烯酰胺凝膠的強(qiáng)度、彈性、透明度、粘度和孔徑大小均取決于兩個重要參數(shù)T和C，T是丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺兩個單體的總百分濃度。C是與T有關(guān)的交聯(lián)百分濃度。T與C的計(jì)算公式是：上式中a為丙烯酰胺的克數(shù)，b為甲叉雙丙烯酰胺的克數(shù)，m為水或緩沖液體積（ml）。式中a與b的比例很重要。富有彈性，且完全透明的凝膠，a與b的重量比應(yīng)在30左右。）第6頁/共31頁分子量范圍與凝膠濃度的關(guān)系物質(zhì)分子量范圍適用的凝膠濃度（%）蛋白質(zhì)<104

1-4×104

4×104-1×105

1-5×105

>5×10520-3015-2010-155-102-5核酸<104

104-105

105-2×10610-205-10

2-2.5第7頁/共31頁5%10%15%294566972002945669720029456697200第8頁/共31頁

579111315T%AB凝膠濃度T對樣品遷移率的影響例：混合蛋白質(zhì)A,B，A分子量較小，B分子帶電荷較多，T＝5％時，電泳行為主要以電荷起作用，B遷移速度快。當(dāng)T增加，分子篩效應(yīng)增加，B的遷移速度減慢；T＝9％時，A，B的遷移率相同，不能分開，T再增加，凝膠孔徑更小，A分子比B分子小，表現(xiàn)較高的遷移率。并且說明電泳只獲得單一的帶時，并不能證明是單一的均一成分。遷移率第9頁/共31頁

不連續(xù)凝膠電泳（disc）的分離原理(一).原理不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)具有與一般電泳的①電荷效應(yīng)分離外，還具有②濃縮效應(yīng)與③分子篩效應(yīng)，因而，能提高電泳的分辨率；使電荷性質(zhì)與密度相近的但分子量有差別的分子得以分離；或分子量相近、性質(zhì)一樣、電荷性質(zhì)與密度有差別的分子可以分離；或電荷性質(zhì)、分子量大小相近，但構(gòu)型不同時亦可分離。不連續(xù)凝膠電泳洗脫堿性不連續(xù)－分離酸性樣品酸性不連續(xù)－分離堿性樣品大多數(shù)蛋白質(zhì)分子呈酸性或中性，適合用堿性系統(tǒng)進(jìn)行電泳分離。第10頁/共31頁①濃縮效應(yīng)

1.凝膠的組成：濃縮膠為大孔徑（稀）T＜5％，分離膠一般為小孔徑（濃）T﹥7.5％。樣品在較稀的凝膠上自由遷移，直至濃凝膠時，便形成一道柵欄，所有的樣品分子在濃縮膠的界面堆積成一窄帶，得到濃縮，然后，再依據(jù)分子量的大小進(jìn)行電泳分離。

2.緩沖液的組成:圖示。PH系統(tǒng)的不連續(xù)，各種分子的電荷之間的差異進(jìn)行分離。

3.緩沖體系的不連續(xù)，其中各組成的離子、快慢離子遷移快慢的差別是影響樣品濃縮效應(yīng)的重要因素。

4.離子的遷移速率及濃度的不連續(xù)又造成電場強(qiáng)度與電導(dǎo)率的變化。第11頁/共31頁②分子篩效應(yīng)移動界面到達(dá)濃縮膠和分離膠界面時，凝膠的PH變化明顯，緩沖液中甘氨酸的解離迅速增加，直至完全解離出gly-,其分子量小，遷移超過蛋白質(zhì)分子。而喪失夾擊的作用；同時，凝膠的孔徑變小，降低了蛋白質(zhì)的遷移率。故蛋白質(zhì)分子在均一的電壓梯度和PH值中泳動，依其分子量的大小而分開。③電荷效應(yīng)第12頁/共31頁操作垂直柱狀，板狀的不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)的組成和配制；均一凝膠與梯度凝膠配制；電極緩沖液系統(tǒng)；樣品的準(zhǔn)備；加樣要求電泳檢測PH8.3PH6.7PH8.9PH8.3

垂直柱狀，板狀的不連續(xù)凝膠電泳系統(tǒng)的組成和配制第13頁/共31頁緩沖液系統(tǒng)濃縮凝膠緩沖液0.5mol/LTris-HCl,PH6.8分離凝膠緩沖液1.5mol/LTris-HCl,PH8.8電極緩沖液系統(tǒng)

0.025mol/LTris（三羥甲基氨基甲烷）0.2mol/Gly(甘氨酸)PH8.3樣品緩沖液

0.1mol/LTris-HCl,PH6.8,40%甘油、0.05mg/ml溴酚藍(lán)樣品緩沖液的要求：選擇合適的PH與離子強(qiáng)度，以保證樣品的溶解性、穩(wěn)定性、生物活性。并加入便于觀察電泳前沿的指示劑。第14頁/共31頁標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品：是一組（5～7種）已知的合適的分子量范圍的、構(gòu)形相近的一套蛋白質(zhì)，溶解在樣品緩沖液中備用。樣品的濃度分析目的、檢測方法和樣品的組成是關(guān)鍵；未知樣品濃度：0.1～20mg/ml考瑪斯亮籃染色：1～2mg/ml銀染色:0.02～0.2mg/ml

高純度樣品：0.5～2mg/ml加樣電泳

光吸收檢測考瑪斯亮籃染色染色銀染色第15頁/共31頁SDS測蛋白質(zhì)分子量SDS是在PAG系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂，蛋白質(zhì)在一定濃度的含有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。第16頁/共31頁

SDS電泳的成功關(guān)鍵之一是電泳過程中，待別是樣品制備過程中蛋白質(zhì)與SDS的結(jié)合程度。影響結(jié)合的因素主要有三個：溶液中SDS單體的濃度。當(dāng)單體濃度大于1mmol/L時大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS結(jié)合的重量比為1:1.4，如果單體濃度降到0.5mmol/L以下時，兩者的結(jié)合比僅為1:0.4。這樣就不能消除蛋白質(zhì)原有的電荷差別；為保證蛋白質(zhì)與SDS的充分結(jié)合，它們的重量比應(yīng)該為1:4或1:3；樣品緩沖液的離子強(qiáng)度。SDS電泳的樣品緩沖液離子強(qiáng)度較低，通常是10～100mmol/L；二硫鍵是否完全被還原。第17頁/共31頁采用SDS測蛋白質(zhì)MW時，只有完全打開二硫鍵，蛋白質(zhì)分子才能被解聚，SDS才能定量地結(jié)合到亞基上而給出相對遷移率和分子量對數(shù)的線性關(guān)系。因此在用SDS處理樣品同時常用巰基乙醇處理，巰基乙醇是強(qiáng)還原劑，可使被還原的二硫鍵不易再氧化，從而使很多不溶性蛋白質(zhì)溶解而與SDS定量結(jié)合。有許多蛋白質(zhì)是由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（如胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在SDS和巰基乙醇作用下，解離成亞基或單條肽鏈，因此這一類蛋白質(zhì)，測定時只是它們的亞基或單條肽鏈的MW。已發(fā)現(xiàn)有些蛋白質(zhì)不能用SDS測定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常的蛋白質(zhì)，帶有較大輔基的蛋白質(zhì)（某些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。一般至少采用兩種方法測定未知樣品的分子量，互相驗(yàn)證。第18頁/共31頁

實(shí)驗(yàn)試劑和器材

1.材料：

低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白試劑盒:

低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白：兔磷酸化酶BMW=97,400

牛血清白蛋白MW=66,200

兔肌動蛋白MW=43,000

牛碳酸酐酶MW=31,000

胰蛋白酶抑制劑MW=20,100

雞蛋清溶菌酶MW=14,400

根據(jù)說明書處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白

樣品：稱3mg樣品，加2ml蒸餾水溶解。第19頁/共31頁2.實(shí)驗(yàn)試劑

(1)30%丙烯酰胺（Acr）：稱Acr30g，甲叉雙丙烯酰胺

（Bis）0.8g，加蒸餾水至100ml，過濾后置棕色瓶中，

4℃貯存可用1-2月。

（2）10%SDS（十二烷基硫酸鈉）

（3）1.5mol/LpH8.8Tris-HCl分離膠緩沖液：稱取

Tris18.2g加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH8.9，最

后用蒸餾水定容至100ml。

（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl濃縮膠緩沖液：稱取

Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8，

最后用蒸餾水定容至100ml。

（5）0.05mol/LpH6.8Tris-HCl樣品溶解緩沖液：稱取

Tris0.6g，加入50ml水，用1mol/L鹽酸調(diào)pH6.8，最

后用蒸餾水容至100ml。

第20頁/共31頁（7）10%過硫酸銨(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）樣品溶解液：SDS（100mg）+巰基乙醇（0.1ml）+

溴酚藍(lán)（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.3Tris-

HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）固定液：取50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混勻。

（11）染色液：稱取考馬斯亮藍(lán)R2500.125g，加上述固定液

250ml，過濾后備用。

（12）脫色液：冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸餾水定容至1000ml。

（13）電極緩沖液（內(nèi)含0.1%SDS，0.05mol/LTris-0.384mol/L甘氨酸緩沖液pH8.3）：稱Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸餾水使其溶解后定容至1000ml。

2.實(shí)驗(yàn)試劑第21頁/共31頁實(shí)驗(yàn)步驟1.裝板：

將垂直板型電泳裝置內(nèi)的板狀凝膠模子取出，將玻璃片洗凈、涼干、嵌入凹槽中，形成一個“夾心”凝膠腔，把裝好的凝膠腔置于仰放的電極上槽。將電泳槽、凝膠模子串成一體的垂直板型電泳裝置，垂直放置在水平臺面上，灌注膠液?！z配制過程要迅速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結(jié)無法注膠.注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡。※水封的目的是為了使分離膠上延平直，并隔絕空氣。※凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。第22頁/共31頁分離膠(10%15ml)濃縮膠(5%5ml)ddH2O5.4ml3.2ml30%Acr5.0ml0.85mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl3.8ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl0.65ml10%SDS150μl50μl10%Ap150μl50μlTEMED500μl200μl

配膠

第23頁/共31頁3.樣品及MW標(biāo)準(zhǔn)參照物溶液的制備樣品溶液和上樣緩沖液混勻，使用前在100℃水浴1min，以除去可能出現(xiàn)的亞穩(wěn)態(tài)聚合物。4.上樣。15μl/孔5.電泳上槽接負(fù)極，下槽接正極，打開電泳儀開關(guān)，開始時將電流調(diào)至10mA，待樣品進(jìn)入分離膠時，將電流調(diào)至20-30mA。待指示劑染料靠遷移至下沿1～1.5cm處停止電泳，需2～3h。6.凝膠板剝離與染色：電泳結(jié)束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標(biāo)記后放在大培養(yǎng)皿內(nèi)，將凝膠放入0.05%考馬斯亮藍(lán)R250（內(nèi)含20％磺基水楊酸）染色液中，使染色液沒過膠板，染色30min左右。第24頁/共31頁7.脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，用7％乙酸浸泡漂洗數(shù)次，直至背景藍(lán)色褪去蛋白質(zhì)區(qū)帶清晰為止。如用50℃水浴或脫色搖床，則可縮短脫色時間。

*剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分8.MW的計(jì)算以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)MW的對數(shù)對相對遷移率作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測樣品相對遷移率，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其MW。=

蛋白樣品距加樣端遷移距離cm溴酚藍(lán)區(qū)帶中心距加樣端距離cm

相對遷移率第25頁/共31頁注意事項(xiàng)丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的最大暴露量不超過0.5μg/kg，皮膚接觸可致中毒，癥狀為紅斑、脫皮、眩暈、動作機(jī)能失調(diào)、四肢無力等。丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，可以透過皮膚，不要接觸皮膚，戴手套、口罩操作。一定要催化充分，使之完全聚合。沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近。集中處理，實(shí)驗(yàn)中全部的膠由專門受過訓(xùn)練的人收集到一起，在一個特殊標(biāo)明的容器中保存，并進(jìn)一步催化使之反應(yīng)完全，最后送交學(xué)校危險品倉庫，統(tǒng)一處理。第26頁/共31頁Forexample:MarkersProetinsA