分子病理學(xué)技術(shù)講稿

關(guān)于分子病理學(xué)技術(shù)講稿第一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日

器官病理學(xué)細(xì)胞病理學(xué)超微病理學(xué)免疫病理學(xué)分子病理學(xué)遠(yuǎn)程病理學(xué)大體細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)分子基因病理學(xué)的進(jìn)步是病理技術(shù)的進(jìn)步第四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日病理學(xué)技術(shù)包括：

傳統(tǒng)病理學(xué)技術(shù)和現(xiàn)代新技術(shù)

人體病理學(xué)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)病理學(xué)技術(shù)

第五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日一免疫組織化學(xué)與免疫細(xì)胞化學(xué)第六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日原理與方法

免疫組織與細(xì)胞化學(xué)（Immunohistochemistryandimmunocytochemistry）：

是在單克隆抗體技術(shù)產(chǎn)生后，利用免疫學(xué)原理，將抗原抗體反應(yīng)應(yīng)用與組織細(xì)胞化學(xué)而進(jìn)一步通過級(jí)連放大，增加敏感性。最后用辣根過氧化物酶顯色。從而定位組織細(xì)胞中抗原（蛋白多肽、酶）等多種基因產(chǎn)物的特異方法。在病理學(xué)外檢工作中可用于對(duì)不同來源，HE難以診斷的的腫瘤進(jìn)行確診和鑒別診斷。

基本原理：形成“抗原－抗體復(fù)合物”。第七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日?qǐng)D1：CK19陽性的BEL-7402細(xì)胞

圖2：OV-6陽性的HepG2細(xì)胞第八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日肌動(dòng)蛋白第九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日雄激素受體第十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日CD3-T細(xì)胞第十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日雌激素受體（ER）第十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日免疫組織化學(xué)技術(shù)的主要步驟：

1．提取抗原(免疫原Immunogen);2．用免疫原免疫動(dòng)物(兔)制備抗血清(多克隆抗體)或免疫動(dòng)物(鼠)后，用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗體；3．純化抗體；4．抗體標(biāo)記組織切片；5．染色反應(yīng)；6．觀察結(jié)果。第十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日常用的抗體標(biāo)記物：1．酶為最常用的標(biāo)記物。作為標(biāo)記的酶應(yīng)具有以下條件：①底物是特異性的，且易于顯示；②酶反應(yīng)產(chǎn)物穩(wěn)定，不易擴(kuò)散；③容易獲得純酶分子且較穩(wěn)定；④酶標(biāo)記抗體后，不影響兩者的活性；⑤被檢組織中不應(yīng)存在內(nèi)源性相同的酶或其底物。常用的標(biāo)記酶有辣根過氧化物酶（HRP）、鹼性磷酸酶（AKP）、葡萄糖氧化酶（GOD）等。2．熒光素指在高能量光波的激發(fā)下能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)。常用的有異硫氰酸熒光素（FITC）、四甲基異硫氰酸羅達(dá)明（TRITC）。3．生物素其與卵白素的親和力明顯高于抗原抗體的結(jié)合力。4．金屬標(biāo)記物如鐵蛋白和膠體金。多用于免疫電鏡。第十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日三．常用免疫組織化學(xué)染色方法（一）直接法將熒光素(免疫熒光法)或酶直接標(biāo)記在第一抗體上，以檢查相應(yīng)的抗原。直接法具有特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，但敏感性差，耗費(fèi)抗體多。第十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日（二）間接法先用熒光素或酶標(biāo)記第二抗體，一抗為特異性抗體，二抗僅有種族特異性。特點(diǎn):⑴預(yù)先標(biāo)好二抗，較方便；⑵比直接法敏感，但仍差。第十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日（三）PAP法與雙PAP法：既過氧化物酶抗過氧化物酶復(fù)合物法(PerixidaseAntiperoxidaseComplexMethod,PAP)先將過氧化物酶（HRP）免疫兔/羊/鼠，制成兔/羊/鼠抗ＨＲＰ；然后再與ＨＲＰ結(jié)合，形成一個(gè)穩(wěn)定的多角形結(jié)構(gòu)（PAP）。特點(diǎn)：⑴敏感性較高；⑵背景染色低（相對(duì)）；⑶雙PAP敏感性更高，但背景相對(duì)較重。第十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日（四）ABC法：既卵白素－生物素過氧化物酶復(fù)合物法(AvidinBiotin-peroxidaseComplex,ABC)利用卵白素與生物素特有的高度親和力，先將生物素與酶結(jié)合形成生物素化HRP，再以生物素化HRP與卵白素按一定比例混合，形成一個(gè)復(fù)合物；同時(shí)先將二抗生物素化。１．如將卵白素?fù)Q成鏈霉親和素，則為：ＳＡＢＣ法：(StreptAvidinBiotin-peroxidaseComplex)２．將鏈霉親和素和生物素先連結(jié)起來，則稱：ＬＳＡＢ法：labelledStreptAvidin-Biotin３．用鏈霉素抗生物素蛋白連結(jié)辣根過氧化物酶，則為：Ｓ－Ｐ法：(StreptAvidinPeroxidaseconjugataedmethod)若用堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉卵白素則稱ＳＡＰ法。若分別用堿性磷酸酶和辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，則稱ＤＳ法特點(diǎn):⑴敏感性高，（比ＰＡＰ高８～４０倍）；⑵背景淡，鏈霉親和素更好；⑶方法較簡(jiǎn)便，時(shí)間較短；⑷應(yīng)用范圍廣，也可用于原位雜交和免疫電鏡。

第十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日四．免疫組織化學(xué)染色過程中需注意的有關(guān)事項(xiàng)

１．正確設(shè)置免疫組織化學(xué)的對(duì)照

對(duì)照原則：首先對(duì)照第一抗體；替代對(duì)照要注意相同的原則；陽性結(jié)果陰性對(duì)照，陰性結(jié)果陽性對(duì)照；染色清晰，定位準(zhǔn)確。陰性對(duì)照：（１）空白對(duì)照：用ＰＢＳ置換第一抗體；（２）血清替代對(duì)照：用同種動(dòng)物的正常血清代替第一抗體；陽性對(duì)照：用已知或已被實(shí)驗(yàn)證明為陽性的組織；自身對(duì)照：利用組織切片內(nèi)的各種不同的組織成分作對(duì)照。第十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日2．假陽性反應(yīng)：⑴非特異性反應(yīng)：邊緣現(xiàn)象、皺折和刀痕、出血和壞死等；⑵內(nèi)源性過氧化物酶：紅細(xì)胞、炎細(xì)胞、退變壞死細(xì)胞和某些腺上皮分泌物，以及某些富含過氧化物酶的組織，如腦、肝等；⑶抗體的交叉反應(yīng)：抗體本身含有與人體組織發(fā)生交叉反應(yīng)的成分；⑷試劑濃度過高或失效。第二十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日3．假陰性反應(yīng)：

⑴組織固定不當(dāng)或固定時(shí)間過長(zhǎng)；⑵抗體效價(jià)過低或久置失效；⑶組織中抗原被粘稠基質(zhì)或分泌物阻隔；⑷DAB或H2O2的濃度不當(dāng)。第二十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日五、免疫組織化學(xué)在腫瘤診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用

（一）在腫瘤診斷中應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的原因：１在常規(guī)病理活檢中,通常有５～１０％的疑難病例不能明確診斷。２形態(tài)結(jié)構(gòu)相似的腫瘤可為不同的組織來源（如未分化癌和惡性淋巴瘤）因而難于識(shí)別，給治療帶來困難。３一些轉(zhuǎn)移性腫瘤常常缺乏特有的組織學(xué)特征，因而無法確定其原發(fā)病灶（如甲狀腺癌和前列腺癌）。４通過一些反映細(xì)胞增殖和與腫瘤惡性程度有關(guān)的標(biāo)記物協(xié)助識(shí)別腫瘤的良惡性。第二十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日（二）各種不同組織及其腫瘤常見的標(biāo)記物：

1．上皮組織及其腫瘤標(biāo)記物：（１）存在于所有上皮細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記物：細(xì)胞角蛋白（Cytokeratin,ＣＫ）：一種中間絲蛋白（２）存在于大部分上皮細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記物：①角蛋白多肽（如ＣＫ１９）；②上皮細(xì)胞膜抗原（epithelialmembraneantigen,ＥＭＡ）。（３）選擇性存在于某些上皮細(xì)胞內(nèi)的標(biāo)記物：①癌胚抗原（ＣＥＡ）；②甲胎蛋白（ＡＦＰ）；③前列腺特異性抗原（ＰＳＡ）及激素類等。第二十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日2．間葉組織（軟組織）及其腫瘤標(biāo)記物：

（１）間葉源性腫瘤：波形蛋白（Vimentin）；（２）纖維組織源性腫瘤：纖維瘤、肉瘤，惡纖組。①抗胰蛋白酶（α1—ＡＴ，ＡＡＴ）；②抗胰糜蛋白酶（α—ＡＣＴ，ＡＣＴ）；③溶菌酶（Lysozyme）。第二十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日3．肌細(xì)胞及肌上皮腫瘤及其標(biāo)記物：肌瘤、肌肉瘤、肌上皮瘤。⑴結(jié)蛋白（Desmin），最常用，肌細(xì)胞分化最早的標(biāo)記；⑵肌動(dòng)蛋白（Actin），屬肌絲蛋白，６種亞型分別存在于不同的肌細(xì)胞、肌上皮細(xì)胞⑶肌球蛋白（Myosin），屬肌絲蛋白，分Ⅰ型（慢）和Ⅱ型（快）收縮纖維，存在于心肌、橫紋肌及平滑肌中，肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白均出現(xiàn)在肌細(xì)胞發(fā)育分化中期。⑷肌紅蛋白（Myoglobin），是心肌和橫紋肌結(jié)合氧的肌紅蛋白，存在于分化成熟的橫紋肌中。第二十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日４．內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤及其標(biāo)記物：血管內(nèi)皮肉瘤⑴第Ⅷ因子相關(guān)抗原（FactorⅧ-relatedAntigen,Ｆ８）⑵荊豆凝集素（UlexEuropaeus－1Lectin,ＵＥＡ－１）；⑶ＢＭＡ２００、ＣＤ３１、ＣＤ３４等。第二十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日５．骨、軟骨和脂肪組織腫瘤及其標(biāo)記物：

⑴Ｓ－１００，Vimentin陽性；⑵Lysozyme少數(shù)陽性。第二十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日６．滑膜及間皮腫瘤及其標(biāo)記物：雙向分化，無特異性標(biāo)記物。Keratin,EMA;Vimentin,FN,AAT,ACT,Lysozyme等均有可能陽性。第二十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日７．周圍神經(jīng)腫瘤及其標(biāo)記物：

⑴S-100：神經(jīng)纖維腫瘤，神經(jīng)鞘腫瘤。⑵髓性堿性蛋白（Myelinbasicprotein,MBA）；⑶髓鞘相關(guān)蛋白（MAG）；⑷層粘連蛋白（Laminin）。第二十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日8．淋巴造血組織腫瘤及其標(biāo)記物：(１)LCA（LeucocyteCommonAntigen，白細(xì)胞共同抗原）；(２)CD19，CD25，CD20－－標(biāo)記Ｂ淋巴細(xì)胞；(３)CD4，CD8，CD3－－標(biāo)記Ｔ淋巴細(xì)胞；(４)ＭＡＣ３８７、Ｌｙｓｏｚｙｍｅ－－標(biāo)記組織細(xì)胞；(５)ＣＤ１５、ＣＤ３０（Ki-antigen）－－標(biāo)記Ｒ－Ｓ細(xì)胞；(６)CD11，CD14－－標(biāo)記單核細(xì)胞、粒細(xì)胞。第三十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日9．神經(jīng)及神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤及其標(biāo)記物：（１）膠質(zhì)纖維酸性蛋白（Glialfibrillaryacidicprotein,ＧＦＡＰ）：膠質(zhì)細(xì)胞、室管膜細(xì)胞；（２）髓鞘堿性蛋白（ＭＢＰ）：少突膠質(zhì)細(xì)胞；（３）神經(jīng)細(xì)胞烯醇化酶（Neurunspecificenolosa,ＮＳＥ）：神經(jīng)細(xì)胞；（４）神經(jīng)微絲（Neurofilaments,ＮＦ）神經(jīng)細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、副節(jié)細(xì)胞、ＡＰＵＤ瘤；（５）嗜鉻素Ａ（ChromograninＡ）：神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。（６）其它：ＡＣＴＨ、Calcitotin、Gastrin、Glucagon、hGH、Insulin、Serotonin等。第三十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日免疫組織化學(xué)最突出的優(yōu)點(diǎn)：能在原位確定組織及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分。深入---------原位分子雜交和免疫電鏡。第三十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日電子顯微鏡技術(shù)電子顯微鏡（electronmicrosocope）簡(jiǎn)稱電鏡，是以電子束為照明源，通過電子流對(duì)生物樣品的透射以及電磁透鏡的多級(jí)放大后的熒光屏上成像的大型精密儀器。按工作原理和用途的不同可分為透射式電鏡（transmissionelectronmicroscope,TEM）和掃描式電鏡（scanningelectronmicroscope,SEM）二種基本類型。第三十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日?qǐng)D白藜蘆醇處理Jurkat細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

第三十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日一．透射式電鏡

主要用于觀察細(xì)胞內(nèi)部的微細(xì)結(jié)構(gòu)，由于電子的穿透力較弱，故用于透射電鏡觀察的標(biāo)本必須切成50~100nm的超薄切片。換句話說，一個(gè)細(xì)胞要被切成100~200個(gè)薄片才適于在透射電鏡下觀察。樣品在被超薄切片之前，一般要經(jīng)過固定、脫水和包埋等處理，在切片之后還要經(jīng)過染色等處理才能進(jìn)行觀察。第三十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日超薄切片術(shù)（techniquesofultrathinsection）是最基本的電鏡樣品制備技術(shù)，其基本過程同石蠟切片大體相似，包括取材、固定、漂洗、脫水、滲透與聚合、切片和染色等多個(gè)環(huán)節(jié)，但操作過程比石蠟切片更為細(xì)致與復(fù)雜。為了獲得理想的超薄切片，操作者必須認(rèn)真對(duì)待每一步驟，任何環(huán)節(jié)的疏忽都可能導(dǎo)致制樣的失敗。第三十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日合格的超薄切片樣品應(yīng)該達(dá)到以下基本要求：（1）切片的厚度應(yīng)在50nm左右，不能超過100nm，以獲得較高的分辨率和較高的反差；（2）切片應(yīng)能耐受電子束的強(qiáng)烈照射而不發(fā)生破裂、變形；（3）細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)保持良好，沒有明顯的物質(zhì)凝聚和丟失。第三十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日電子顯微鏡技術(shù)：細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器、細(xì)胞骨架或大分子水平的變化。細(xì)胞內(nèi)的病毒顆粒等。

腫瘤鑒別診斷病毒包涵體腎炎的分型

第三十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日二．掃描電鏡

掃描電子顯微鏡就是用聚得很細(xì)的電子束流照射要檢測(cè)的樣品表面。由于電子束與樣品的相互作用產(chǎn)生各種信息然后通過不同的檢測(cè)器接收相應(yīng)的信息，經(jīng)過處理后顯示出樣品的各種特征。

掃描電鏡具有以下特點(diǎn)：能夠直接觀察樣品的表面的結(jié)構(gòu)；樣品制備過程簡(jiǎn)單，不用切成超薄切片；可以從各種角度對(duì)樣品進(jìn)行觀察；景深大，圖像富有立體感；圖像的放大范圍廣，分辨率也比較高；電子束對(duì)樣品的損傷與污染程度較小；在觀察形貌的同時(shí)，還可利用從樣品發(fā)出的其他信號(hào)作微區(qū)成分分析。第三十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日掃描電鏡：血管破裂第四十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日掃描電鏡：小腸微絨毛第四十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第四十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日第五節(jié)生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)（biochiptechnology）是將大量具有生物識(shí)別功能的分子或生物樣品有序地點(diǎn)陣排列在支持物上并與標(biāo)記的檢體分子同時(shí)反應(yīng)或雜交，通過放射自顯影、熒光掃描、化學(xué)發(fā)光或酶標(biāo)顯示可獲得大量有用的生物信息的新技術(shù)。生物芯片技術(shù)包括基因芯片、蛋白質(zhì)芯片、細(xì)胞芯片、組織芯片、以及元件型微陣列芯片、通道型微陣列芯片、生物傳感芯片等新型生物芯片。可對(duì)DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞、組織以及其它生物成分進(jìn)行高效快捷的測(cè)試和分析。第四十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日一、基因芯片基因芯片(genechip)是指采用原位合成或顯微打印方法，將大量DNA探針固化于支持物表面上，產(chǎn)生二維DNA探針陣列，然后與標(biāo)記的樣品進(jìn)行雜交，通過檢測(cè)雜交信號(hào)來實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品快速、并行、高效地檢測(cè)?？勺詣?dòng)、快速地檢測(cè)出成千上萬個(gè)基因的表達(dá)情況，為基因診斷、藥物篩選以及新基因發(fā)現(xiàn)提供了有力的手段。第四十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日?qǐng)D基因芯片第四十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日二、蛋白芯片

蛋白芯片技術(shù)的基本原理是將各種蛋白質(zhì)有序地固定于滴定板、濾膜和載玻片等各種載體上成為檢測(cè)用的芯片，然后，用標(biāo)記了特定熒光素的蛋白質(zhì)或其他成分與芯片作用，經(jīng)漂將未能與芯片上的蛋白質(zhì)互補(bǔ)結(jié)合的成分洗去，再利用熒光掃描儀或激光共聚焦掃可描技術(shù)，測(cè)定芯片上各點(diǎn)的熒光強(qiáng)度，通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到檢測(cè)多種蛋白質(zhì)及其功能的目的。如抗體芯片可排列數(shù)百種單克隆抗體，通過這張芯片，人們?cè)谝淮螌?shí)驗(yàn)中就能夠比較幾百種蛋白的表達(dá)變化。對(duì)于診斷疾?。喝鐐魅静?、腫瘤、遺傳病等臨床工作以及信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡和神經(jīng)生物學(xué)等基礎(chǔ)研究都具有廣泛的應(yīng)用前景第四十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日三、組織芯片

織芯片又稱組織微列陣（tissuemicroarray）是將數(shù)十個(gè)數(shù)百個(gè)乃至上千個(gè)小的組織片整齊的排列在一起到載玻片,形成微縮的組織切片。

其特點(diǎn)有:1.體積小信息含量高.可根據(jù)不同需要進(jìn)行組合和設(shè)計(jì);2.即可用于形態(tài)學(xué)觀察也可用于免役組織化學(xué)染色.原位雜交,FISH等原位組織細(xì)胞學(xué)觀察和研究.3.高效快速,低消耗,自身內(nèi)對(duì)照和可比性強(qiáng),節(jié)時(shí)、省力、少材、高效利用庫存蠟塊腫瘤標(biāo)本的新方法。一個(gè)蠟塊可連續(xù)切片200張，以供原位分析腫瘤相關(guān)基因DNA及其表達(dá)的mRNA和蛋白質(zhì)，熒光原位分子雜交（FISH），mRNA原位雜交、免疫組化三種方法可同時(shí)在一個(gè)芯片蠟塊的連續(xù)組織芯片中應(yīng)用。因而可提高實(shí)驗(yàn)效率，一張組織芯片上可列陣數(shù)十至數(shù)百個(gè)樣本。實(shí)驗(yàn)條件最大程度上保持一致，有助于減少實(shí)驗(yàn)誤差，一個(gè)組織芯片蠟塊可連續(xù)切200張片，進(jìn)行許多分子標(biāo)記檢測(cè)。最大限度地利用有限的標(biāo)本資源，尤其是少見的病例標(biāo)本，最小破損原有蠟塊。可同時(shí)檢測(cè)一種腫瘤不同階段的基因表達(dá)狀況。能在一張片上同時(shí)看到一個(gè)腫瘤組織在原位、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)中的基因擴(kuò)增情況。第四十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日六激光顯微切割術(shù)

顯微切割（Lasermicro-desection）就是在顯微鏡下用手工或儀器采樣的方法從組織切片或細(xì)胞涂片上將所要研究的形態(tài)或表型相同的細(xì)胞從組織三維構(gòu)造中分離出來，獲得純的細(xì)胞群（purecellpopulation），以備進(jìn)一步作分子水平的研究。微切割技術(shù)的貢獻(xiàn)就是克服了組織的細(xì)胞成分非常繁雜這一重大的缺點(diǎn)。第四十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日?qǐng)D激光顯微切割儀

第四十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日一、微切割的方法

1．材料來源

組織切片冰凍切片培養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞涂片第五十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日二、微切割后的細(xì)胞處理

1．DNA提取

如果所獲細(xì)胞數(shù)量在105以上，則可用常規(guī)的方法提取DNA。2．RNA提取3.蛋白提取第五十一頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日三、微切割的應(yīng)用

1．細(xì)胞基因突變及微衛(wèi)星變異的研究2．細(xì)胞基因拷貝數(shù)的變化和甲基化水平的檢測(cè)3．定量RT-PCR4．比較基因組雜交5．cDNA微陣列（芯片）第五十二頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日七原位分子雜交

原位核酸分子雜交（insituhybridization,ISH）是應(yīng)用特定標(biāo)記的已知核酸探針與組織或細(xì)胞中待測(cè)的核酸按堿基配對(duì)的原則進(jìn)行特異性結(jié)合，形成雜交體，雜交后的信號(hào)可以在光鏡或電鏡下進(jìn)行觀察。由于核酸分子雜交的特異性強(qiáng)、敏感性高、定位精確、定量可能，因此該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的研究之中。第五十三頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日?qǐng)D食管癌腫瘤細(xì)胞c-fosmRNA原位雜交圖片

第五十四頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日八熒光原位分子雜交染色體分析技術(shù)

染色體原位分子雜交技術(shù)（ChromsomeAnalysisbyFluorescenceinsituHybridization）的發(fā)展為研究染色體上DNA的序列提供了一個(gè)最直接的方法。具有經(jīng)濟(jì)、安全、快速、穩(wěn)定，靈敏度高，多色彩FISH可在同一核內(nèi)顯示兩種或多種序列，還可對(duì)間期核染色體進(jìn)行研究；應(yīng)用不同的探針可顯示某一物種的全部基因，某一染色體染色片段及單拷貝序列；結(jié)合共焦激光顯微鏡可對(duì)間期核及染色體進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)研究，精確檢測(cè)雜交信號(hào)優(yōu)點(diǎn)。第五十五頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日組織切片間期染色體熒光原位雜交

第五十六頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日3．FISH基因定位（FISHmapping）基因定位時(shí)，不但需要確定某段靶序列在染色體上的位置，尚需確定兩個(gè)或兩個(gè)以上靶序列在線性DNA分子的排列次序和距離，才能繪出基因圖。一般用同位素雜交：先確定每一靶序列在中期染色體上的位置，然后根據(jù)它們到端粒的距離確定出線形排列次序。而用FISH方法，兩種或兩種以上的探針能同時(shí)與中期染色體雜交，只要根據(jù)兩種顏色雜交位點(diǎn)的相互位置，就能直接確定次序。但中期染色體是線形DNA分子經(jīng)過折疊和包裝后形成的，若兩個(gè)靶序列相距很近，例如間距小于1Mbp，受包裝過程的影響，它們?cè)诰€形DNA分子上的排列與在中期染色體上的排列不一定相同，甚至可能完全相反。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)，靶序列之間在間期核的平均相對(duì)距離與它們?cè)诰€形DNA分子上的距離呈正相關(guān)。利用間期核FISH分析不但能排除染色體包裝的影響，還能提高測(cè)距的分辨率。

第五十七頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日?qǐng)D食管癌細(xì)胞單條染色體涂染熒光原位分子雜交，用BAC位點(diǎn)探針特異位點(diǎn)定位BACFISH第五十八頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日四、FISH的應(yīng)用

1．基因定位與基因制圖（Genemapping）

FISH已經(jīng)極大地加速了人類基因定位和基因制圖的進(jìn)程。第五十九頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日2．基因診斷(Genediagnosis)

精確、直觀、明了第六十頁，共六十九頁，編輯于2023年，星期日4．FISH在腫瘤生物學(xué)中的應(yīng)用（1）腫瘤細(xì)胞遺傳學(xué)（Onco-cytogenetics）（2）基因定位：FISH可用于分離出的癌基因與抑癌基因初步定位（3）病毒基因插入基因組部分的檢測(cè)：雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒以激活原癌基因?yàn)橹?，也有象腺病毒、HPV、SV40等病毒以蛋白產(chǎn)物與抑癌基因蛋白產(chǎn)物相互作用而誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化。但病毒基因特別是DNA病毒多