植物組培脫毒技術(shù)及在花卉上的應(yīng)用

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植物組培脫毒技術(shù)及在花卉上的應(yīng)

用

摘要：綜述了植物組培脫毒技術(shù)的形成、研究發(fā)展、意義及其應(yīng)用植物組培脫毒技術(shù)的培養(yǎng)條件，并重點(diǎn)闡述了植物組培脫毒辦法及其在花卉上的應(yīng)用以及病毒檢測的重要性，最終淺析了植物組培脫毒技術(shù)存在的咨詢題及展望。

關(guān)鍵詞：植物組培脫毒；花卉；應(yīng)用；病毒檢測

英文摘要：Methodsofplanttissueintroduces,theformationoftheresearchprogressandapplication,meaningplanttissuecultureconditionsofvirus-freetechniques,andfocusesonplanttissueintheflowermethodanditsoverviewsoftheapplicationandtheimportanceofvirusdetection,andfinallyanalysestheplanttissueintroducesexistingproblemsandprospect.

1植物組培脫毒技術(shù)概述

1．1植物組培脫毒技術(shù)的形成

危害植物的病毒、植物菌原體、類細(xì)菌有幾百種，果樹、花卉、蔬菜等植物病毒也別下500多種，絕大多數(shù)植物種類是靠無性生殖的，由于病毒經(jīng)過無性生殖傳遞，在母體內(nèi)逐代積存，種性退化嚴(yán)峻，表現(xiàn)為植物生長受到抑制，形態(tài)畸變，產(chǎn)量下落，品質(zhì)變劣，嚴(yán)峻時(shí)只好拔除病株，因而造成非常大經(jīng)濟(jì)損失，而目前生產(chǎn)上對病毒病的防治尚無特效藥物。自從2O世紀(jì)5O年代發(fā)覺經(jīng)過植物組織培養(yǎng)的辦法，能夠脫除嚴(yán)峻患病毒病植物的病毒，恢復(fù)種性，提高產(chǎn)量、質(zhì)量，組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)便在生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用，且有很多國家已將其納入常規(guī)良種繁育體系，有的還特意建立了大規(guī)模的無病毒苗生產(chǎn)基地。

1．2植物組培脫毒技術(shù)研究發(fā)展

white于1943年首先發(fā)覺，在感染煙草花葉病毒的煙草植株生長點(diǎn)附近病毒的濃度非常低，甚至沒有病毒，同時(shí)病毒的含量隨植株部位和年齡而異。Morel等在那個(gè)啟發(fā)下，于1952年利用感染花葉病毒的大麗菊莖尖分生組織培養(yǎng)，得到了無毒植株。自1952年以來，經(jīng)過莖尖分生組織培養(yǎng)或熱處理與分生組織培養(yǎng)結(jié)合的辦法獲得成功的實(shí)例有100余種，其中最成功的實(shí)例之一是馬鈴薯的脫毒培養(yǎng)Ⅲ。隨著植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的進(jìn)展，2O世紀(jì)5O年代末經(jīng)過愈傷組織培養(yǎng)脫毒獲得成功。7O年代初植物原生質(zhì)體培養(yǎng)成完整的植株，為利用原生質(zhì)體哺育無毒植株提供了也許性。1975年Shepard_5經(jīng)過對瘟染病毒的煙草原生質(zhì)體的培養(yǎng)得到了無毒植株。1972年Navarro等將果樹嫁接辦法與莖尖分生組織培養(yǎng)法兩者有機(jī)結(jié)合，創(chuàng)立了一種新的植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)，即莖尖顯微嫁接法。這一技術(shù)的創(chuàng)立，為果樹的無病毒化開發(fā)了一條新的途徑。近幾年來，應(yīng)用上述技術(shù)在一些非常難脫毒的植物上，如菊花、唐菖蒲、矮牽牛、球根鳶尾、風(fēng)信子、水仙、文心蘭、香石竹等都獲得了別同程度的成功。

1．3研究植物組培脫毒技術(shù)的意義

經(jīng)過植物組培脫毒技術(shù)來生產(chǎn)脫毒苗能夠?qū)崿F(xiàn)防治目的，能夠消除危害植物的病毒、植物菌原體、類細(xì)菌對植株的危害，使植株原來的一些優(yōu)良性狀重新表現(xiàn)出來，并且由于消除了病毒的妨礙，植物的生長性能大大增強(qiáng)，能有效提高植物生長指標(biāo)和經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。研究表明，脫毒試管苗比常規(guī)苗有更好的生長性能，較高的商品價(jià)值和生產(chǎn)利用價(jià)值?；ɑ苊缒久摱竞蠡ㄈ好髌G，品質(zhì)優(yōu)良，提高了其欣賞價(jià)值和商品

性；經(jīng)濟(jì)林和用材林苗木脫毒后，能保持其優(yōu)良性狀，生長迅速，增加結(jié)果量，提高果實(shí)品質(zhì)和木材利用率；農(nóng)作物脫毒后表現(xiàn)出生長良好，單位產(chǎn)量和質(zhì)量提高，市場競爭力增強(qiáng)，達(dá)到增產(chǎn)增收的目的，而且假如脫毒苗移栽后治理得當(dāng)，防治措施做得好，再次感染病毒病的機(jī)率比

較小，所以植物組培脫毒技術(shù)顯得很重要。

1．4培養(yǎng)條件

運(yùn)用于脫毒的組培條件及培養(yǎng)基種類非常多。要緊生態(tài)因子：光照強(qiáng)度普通在1000～2000lx，日照時(shí)8～12小時(shí)；溫度(24±1)℃；濕度7O±5；pH值5．8±0．1；培養(yǎng)基有MS、White、B5、N6等為主體的添加培養(yǎng)基，較為廣泛應(yīng)用的是MS培養(yǎng)基添加2，4-D，6-BA，NAA等。其中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS添加6-BA0.5～2mg／L，2，4-D0.5-2mg／L,NAA0.2～0.5mg／L為宜；分化培養(yǎng)基以MS添加6-BA0.5～3mg／I，2，4-D1～2mg／L，NAA0.2～0.5mg／L為宜；生根培養(yǎng)基以1／2MS添加NAA0.2～0.5mg／I為宜。此外，4～5mg／LPP有利于芽的分化，0.3mg／LABT在生根過程中也較多運(yùn)用。常見的激素組合是MS+6-BA+NAA或MS+6-BA+2，4～D。此外，也有許多單獨(dú)添加植物激素的事情，但所用濃度稍微偏高。作為生長激素要緊有IAA、IBA、NAA、2，4-D，細(xì)胞分裂素要緊有6-BA、BAP、KT、ZT、GA，普通來講，較高濃度的細(xì)胞分裂素促進(jìn)芽的形成而抑制根的形成，而高濃度的生長素則利于根的形成而抑制芽的形成。

2植物組培脫毒辦法及其在花卉上的應(yīng)用

2．1莖尖培養(yǎng)脫毒

莖尖培養(yǎng)是切取莖的先端部分或莖尖分生組織部分舉行的無菌培養(yǎng)。最先開始采納的是Robbins，于1922年切取無菌發(fā)芽植物的芽先端長約1cm部分，接種到瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)。后來，White對番茄根尖培養(yǎng)也舉行了研究。在百合上，利用莖尖培養(yǎng)獵取無病毒植株或獲得脫毒種球,能有效消除百合潛在病毒(LSV)、黃瓜花葉病毒(CMV)等病毒病危害，促進(jìn)生長。香石竹一旦感染病毒病就別能治愈，目前解決此咨詢題的較為行之有效的辦法是經(jīng)過香石竹的莖尖脫毒培養(yǎng)。莖尖培養(yǎng)依照培養(yǎng)目的和取材大小可分為莖尖分生組織培養(yǎng)和一般莖尖培養(yǎng)。嚴(yán)格地說，莖尖分生組織僅限于頂端圓錐區(qū)，其長度別超過0．1mm，最小的僅有十至幾十vm。用這種莖尖分生組織培養(yǎng)，可獲得無毒植株。然而，那么小的莖尖實(shí)際上非常難取得，且培養(yǎng)成苗的時(shí)刻也非常長。所以，在實(shí)際培養(yǎng)中，常常采納帶有葉原基的生長錐來培養(yǎng)。這種稍大的莖尖容易培養(yǎng)，同時(shí)也也許得到無毒的植株，莖尖越大成活率越高，后期生長也越旺盛，而操作技術(shù)越簡單。如菊花0.6mm以下的莖尖脫毒效果可達(dá)100，但成活率僅為37%。

2．2熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)脫毒

為提高脫毒效果，有時(shí)將熱處理與莖尖培養(yǎng)結(jié)合起來，即先把植株放在一定溫度的環(huán)境下生長一段時(shí)咨詢，再取其莖尖舉行培養(yǎng)。首先應(yīng)用熱處理與莖尖培養(yǎng)相結(jié)合辦法是Thomson，于1956年將感染X，Y病毒的馬

鈴薯放在暗處發(fā)芽，當(dāng)芽長到1～2cm時(shí)用35℃處理7～28d后，取5mm的莖尖培養(yǎng)而獲得了無毒植株。宋瑞林、韋曉霞等利用此辦法脫除了切花菊的番茄別育病毒。近年來的研究證明．用熱處理和莖尖培養(yǎng)相結(jié)合的辦法哺育無病毒母本苗效果較好，特殊是關(guān)于一些難于用莖尖培養(yǎng)或熱處理脫毒的果樹病毒，此種辦法尤為重要。采納這種辦法，即使用大的外植體，也能增加無病毒株數(shù)]。用熱處理過的嫩梢舉行莖尖培養(yǎng)或?qū)⒃嚬苊缗e行熱處理，之后再莖尖培養(yǎng)，可提高脫毒率。在MS培養(yǎng)基上，附加5mg／L病毒唑培養(yǎng)唐菖蒲，再經(jīng)38℃～4O℃熱處理，切取微莖尖兩次，去除了危害唐菖蒲的3種要緊病毒TMV、CMV和TVY。百合珠芽經(jīng)(50±1)℃熱水處理40min，培養(yǎng)30d后，切取0.8～1.0mm莖尖培養(yǎng)的脫毒效果最好，脫毒率達(dá)100%。采納試管芽(37±1)℃熱水處理30d+0.2～0.3mm微莖尖培養(yǎng)處理辦法，能夠有效脫除水仙病毒。

2．3愈傷組織培養(yǎng)脫毒

經(jīng)過植物器官或組織的培養(yǎng)來誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，然后從愈傷組織再分化出芽長成植株而獲得無毒苗的辦法。許宏冠、舒秀珍等以感染單一病毒(TAV)的菊花莖尖作為外植體舉行組織培養(yǎng)，經(jīng)愈傷組織分化而得到脫除TAV病毒的植株。利用這種辦法先后在馬鈴薯、天竺葵、大蒜、草莓等多種植物上獲得成功。

2．4原生質(zhì)體培養(yǎng)脫毒

Shepard(1975)報(bào)道，從感染PVX的煙草葉片的原生質(zhì)體中可獲得無毒苗，他所得到4l4O棵再生植株中有7．5為無毒苗。病毒喪失的緣故也許與愈傷組織培養(yǎng)的事情相同，是由于病毒別能有均等的機(jī)遇侵染每一具細(xì)胞，所以從病葉或莖的健全部分分離得到原生質(zhì)體，再由原生質(zhì)體作為原始材料可獲得無病毒的植株。Shepard的研究還發(fā)覺，被PVX與PVY雙重侵染的植物葉片分離得到的原生質(zhì)體哺育出的植株，有95%是無毒的，但對這種現(xiàn)象未能做出解釋。

2．5生殖組織培養(yǎng)脫毒

目前已有人經(jīng)過培養(yǎng)花的組織成功地獲得了無毒的植株。這一培養(yǎng)辦法對柑桔品種尤為有效，因?yàn)榍秩靖探鄣拇蠖鄶?shù)病毒均別能種傳。將柑桔類的珠心組織分化成別定胚，最初獲得成功的是Rangan等(1958)。1969年Rangan等對單胚性柑桔類舉行了研究，并由珠心經(jīng)培養(yǎng)獲得了胚分化的成功，其成功率是所用珠心的l0～20，每一具珠心分化了15～2O個(gè)胚。Bitter等(1972)以及Navarro等(1977)正是利用柑桔病毒別能進(jìn)入珠心和胚珠組織這一特性，從單胚性柑桔類的無病毒化為目標(biāo)，成功地哺育出了健康無毒的柑桔。1974年XXX大澤勝次等，首先發(fā)覺草莓花藥培養(yǎng)出的植株能夠脫除病毒，并得到了植物病理學(xué)家和植物生理學(xué)家的證實(shí)

。此外，還有采納花藥培養(yǎng)(NiirT1i一2001)、花芽組培(zh01a一1992)獲得無毒百合植株的報(bào)道。大麗花花培辦法能夠使脫毒苗的成功率提高20倍左右，莖尖脫毒惟獨(dú)3～5%。

2．6莖尖微體嫁接脫毒

在莖尖培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，Murashige等提出了微體嫁接技術(shù)，即將莖尖分生組織嫁接在試管中經(jīng)脫毒培養(yǎng)的砧木上而得到完整植株n。微體嫁接解決了某些木本植物利用莖尖培養(yǎng)發(fā)根困難、生長緩慢的咨詢題，并可使復(fù)合侵染的病毒分離。1983年Navarro等在試管培養(yǎng)l0～14d的梨新梢上，利用長為0.5～1.0mm帶3～4個(gè)葉原基的莖尖舉行試管微體嫁接，最終獲得無毒苗。利用這種辦法往后相繼在桃、柑桔、蘋果等上也獲得了無毒苗。此外培養(yǎng)大麗花莖尖培養(yǎng)出來的新莖別生根，把脫毒的莖嫁接到健康的砧木上能得到完整的無毒植株(Morel和Martin(1952))。

3病毒檢測

經(jīng)過上述脫毒辦法獲得的組培苗，還別能確信是否徹底脫除了病原物，必須通過檢測證明是脫除了這類病原物的無毒苗，才干在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用。近十幾年來，人們向來在探究比較簡便、快速、準(zhǔn)確的檢測技術(shù)，以滿腳科研、教學(xué)和生產(chǎn)的實(shí)際需要。最初人們是經(jīng)過癥狀表現(xiàn)來推斷的，往后采納組織化學(xué)染XXX技術(shù)、熒光染XXX技術(shù)、免疫學(xué)技術(shù)即免疫熒光、免疫電鏡、ELISAl_5及PCR辦法。這些技術(shù)在別同的階段起到了有效檢測作用。利用文心蘭的莖尖生長錐誘導(dǎo)出原球莖后，經(jīng)過癥狀觀看、生物接種、電鏡觀看和血清學(xué)檢測辦法舉行了CMV、TMV、CYMV、ORSV等4種常見蘭花病毒病的檢測，成功地建立了3個(gè)品種的文心蘭脫病毒無性系。

4咨詢題及展望

組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)已得到愈來愈多的國家和地區(qū)的重視，正以突飛猛進(jìn)的速度向前進(jìn)展，并逐步走向工廠化和商品化。從目前進(jìn)展趨勢來看，植物病毒的防治仍應(yīng)以哺育無毒苗木、原種為主，而植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)的別斷改進(jìn)和提高以習(xí)慣大規(guī)模的生產(chǎn)已勢在必行．對抗病毒物質(zhì)研究的逐步深入，會(huì)大大增加組培脫毒技術(shù)的可靠性和可行性。對培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)用具的進(jìn)一步簡化，可落低組織脫毒苗的生產(chǎn)成本，有助于大面積推廣。植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)的推廣和利用，目前迫切需要與相應(yīng)的全國性治理體系舉行配套。對無毒種質(zhì)的保存技術(shù)也有待于進(jìn)一步改進(jìn)和提高。近年來，許多國家開展了相互引進(jìn)或出口高質(zhì)量無毒組培苗術(shù)的國際咨詢交流業(yè)務(wù)，所以應(yīng)加強(qiáng)對病毒檢測和鑒定技術(shù)的研究，以防止病毒經(jīng)過國際間的交流蔓延和傳播。隨著生物技術(shù)的進(jìn)展和提高，植物組織培養(yǎng)技術(shù)的更新和完善，植物組織培養(yǎng)脫毒技術(shù)也定會(huì)浮現(xiàn)新的發(fā)展和突破。

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