雙向凝膠電泳DPAGE

雙向凝膠電泳DPAGE1.蛋白質(zhì)組分析的技術(shù)路線要求流程技術(shù)路線蛋白質(zhì)組分析的首要要求將來自于全細(xì)胞、組織或生物體中所包含的多達(dá)幾千種混合蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、檢測和分析。生物學(xué)問題的提出實驗?zāi)Ｐ偷脑O(shè)計實驗組和對照組樣品的制備蛋白樣品的IEF和PAGE電泳分離圖像掃描和初步分析感興趣蛋白點的切取胰酶對脫色后蛋白質(zhì)的消化質(zhì)譜的多肽指紋圖、微測序分析質(zhì)譜結(jié)果的生物信息學(xué)分析和比對新蛋白質(zhì)的發(fā)現(xiàn)其它實驗的進(jìn)一步驗證蛋白信息的初步獲得蛋白質(zhì)組分析流程蛋白質(zhì)組研究的基本技術(shù)路線蛋白質(zhì)樣品的制備雙向電泳圖像分析轉(zhuǎn)印至膜上的蛋白凝膠中的蛋白溶液中的蛋白混合肽蛋白質(zhì)質(zhì)量N端測序肽序列質(zhì)譜數(shù)據(jù)肽指紋圖數(shù)據(jù)搜索新的或已知蛋白蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾的鑒定2.雙向電泳技術(shù)的發(fā)展及原理雙向凝膠電泳的發(fā)展雙向凝膠電泳的基本原理雙向凝膠電泳的發(fā)展雙向凝膠電泳的思路最早是由Smithies和Poulik提出(SmithiesO,PoulikMD.Two-dimensionalelectrophoresisofserumproteins.Nature,1956,177:1033)，蛋白質(zhì)第一向電泳是根據(jù)其自由溶液遷移率(free-solutionmobility)，在濾紙條上進(jìn)行；第二向電泳方向與第一向垂直，在淀粉膠上進(jìn)行。隨后，Raymond發(fā)明了聚丙烯酰胺凝膠電泳(RaymondS,WeintraubL.Acrylamidegelasasupportingmediumforzoneelectrophoresis.Science,1959,30:711)，雙向電泳的支持介質(zhì)逐漸轉(zhuǎn)向聚丙烯酰胺凝膠(MargolisJ,KenrickKG.Two-dimensionalresolutionofplasmaproteinsbycombinationofpolyac-rylamidediscandgradientgelelectrophoresis.Nature,1969,221:1056-1057)，這即是雙向凝膠電泳(two-dimensionalpolyacrylamidegelelectrophoresis,2DPAGE)。同年，2DPAGE在原理上又有了新的發(fā)展，以第一向為蛋白質(zhì)等電聚焦的雙向凝膠電泳技術(shù)建立起來，即IEF(DaleG,LatnerAL.Isoelectricfocusingofserumproteinsinacrylamidegelsfollowedbyelectrophoresis.ClinChimActa,1969,24:61-68；MackoV,StegemannH.Mappingofpotatoproteinsbycombinedelctrofocusingandelectrophoresisidentificationofvarieties.Hoppe-seyler’sZPhysiol.Chem,1969,350:917-919)。

20世紀(jì)70年代初，在第二向電泳中又使用了十二烷基磺酸鈉(SDS)(BarrettT,GouldHJ.Tissueandspeciesspecificityofnon-histonechromatinproteins.BiochimBiophysActa,1973,294:165-170；MartiniOHW,GouldH.J.Enumerationofrabbitreticulocyteribosomalproteins.JMolBiol,1971,62:403-405；StegemannH.proteinfraktionierungeninpolyacrylamidunddieanwendungaufdiegenetischeanalysebeipflanzen.AngewChem,1970,82:640)，使第二向電泳基本上根據(jù)蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量來分離，從而奠定了現(xiàn)代雙向凝膠電泳的基礎(chǔ)，即IEF-SDSPAGE。

1975年，O’Farrell、Klose和Scheele分別對雙向凝膠電泳做進(jìn)一步的優(yōu)化，建立了高分辨率的雙向凝膠電泳(O’FarrellPH.Highresolutiontwo-dimensionalelectrophoresisofproteins.JBiolChem,1975,250:4007-4021；KloseJ.proteinmappingbycombinedisoelectricfocusingandelectrophoresisofmousetissues.Anovelapproachtotestingforinducedpointmutationsinmammals.Humangenetik,1975,26:231-243；ScheeleGA.Two-dimensionalgelanalysisofsolubleproteins.JBiolChem,1975,250:5375-5385)。此項技術(shù)是目前唯一能將數(shù)千種蛋白質(zhì)同時分離并展示的分離技術(shù)，一般能分離1000–3000個蛋白質(zhì)點，最好的膠能分離得到11000個左右的蛋白質(zhì)點。雙向凝膠電泳的基本原理先將蛋白質(zhì)根據(jù)其等電點在pH梯度膠內(nèi)進(jìn)行等電聚焦，然后按照它們的相對分子質(zhì)量大小進(jìn)行SDS第二次電泳分離。第一向進(jìn)行等電聚焦(isoelectricfocusing,IEF)，由于蛋白質(zhì)具有兩性解離和等電點特性，將蛋白質(zhì)樣品加載至pH梯度介質(zhì)上進(jìn)行電泳時，會向與其所帶電荷相反的電極方向移動。移動過程中，蛋白分子可能獲得或失去質(zhì)子，并隨著移動的進(jìn)行，該蛋白所帶的電荷數(shù)和遷移速度下降。當(dāng)?shù)鞍走w移至其等電點pH位置時，其凈電荷數(shù)為零，在電場中不再移動。當(dāng)?shù)鞍讛U(kuò)散到低于其等電點

pH

區(qū)域時，帶正電荷，在電場的影響下重新向陰極移動。同樣，如果蛋白質(zhì)擴(kuò)散到高于其等電點的pH區(qū)域時，則帶負(fù)電，在電場的作用下會向陽極移動。根據(jù)各自不同的等電點，蛋白質(zhì)最終被聚焦在一個很窄的pH梯度介質(zhì)區(qū)域內(nèi)。目前常使用預(yù)制膠條(IPG,immobilizedpHgradient)用于蛋白質(zhì)的等電聚焦分離，將聚焦好的IPG膠條在含有SDS的緩沖液中平衡。第二向是將在IPG膠條中經(jīng)過第一向分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到SDS凝膠上，根據(jù)蛋白質(zhì)的相對質(zhì)量或分子量(MW)大小與第一向相垂直的分離。沿垂直的方向進(jìn)行SDS電泳，按分子量大小進(jìn)行分離。樣品經(jīng)過電荷和質(zhì)量兩次分離后，得到等電點和分子量的信息。IPG膠的材料是Immobilines，為擁有CH2=CH-CO-NH-R結(jié)構(gòu)的8種丙烯酰胺衍生物系列，其中R包含羧基或叔氨基團(tuán)，它們構(gòu)成了分布在pH3~10不同值的緩沖體系。根據(jù)公布的配方計算后，將適宜的IPG試劑添加至混合物中用于凝膠聚合，在聚合中緩沖基團(tuán)通過乙烯鍵共價聚合至聚丙烯酰胺骨架中而形成pH梯度。通過這種方式生成的IPG不會發(fā)生電滲透作用，因而可以進(jìn)行特別穩(wěn)定的IEF分離達(dá)到真正的平衡狀態(tài)。三種雙向凝膠等電聚焦系統(tǒng)根據(jù)第一向等電聚焦條件和方式的不同，可將雙向凝膠電泳分為三種系統(tǒng)：ISO-DALT、NEPHGE和IPG-DALT。在ISO-DALT系統(tǒng)中，等電聚焦在聚丙烯酰胺管膠(tubegel)中進(jìn)行，載體兩性電解質(zhì)(carrierampholyte)在外加電場的作用下形成pH梯度，pH梯度在堿性區(qū)不穩(wěn)定（陰極漂移）、重復(fù)性不易掌握和上樣量低是其主要缺點，并且一般不能分離等電點大于8.0的堿性蛋白質(zhì)，其優(yōu)點是電泳設(shè)備要求不高，電泳溶液容易配制，易于開展工作，各種電泳條件經(jīng)優(yōu)化后，可達(dá)到非常高的分辨率，也可獲得好的重復(fù)性，目前唯一分辨到10000個蛋白質(zhì)斑點的圖譜正是采用了這一系統(tǒng)。

NEPHGE為非平衡pH梯度電泳

(nonequilibriumpHgradientelectrophoresis)，是IPG(immobilizedpHgradient)膠發(fā)明前用于分離堿性蛋白質(zhì)的一種方法，蛋白質(zhì)在等電聚焦場中達(dá)到平衡前結(jié)束電泳，第一向的pH也是依靠載體兩性電解質(zhì)和電場來建立。

IPG-DALT的第一向電泳是采用1982年發(fā)明的IPG膠(BjellqvistB,EkK,RighettiPGetal.IsoelectricfocusinginimmobilizedpHgradient:principle,methodologyandsomeapplications.JBiochemBiophysMethods,1982,6:317-339)，其pH梯度的形成依賴于不同pK值的一種合成的化合物immobiline，該化合物是丙烯酰胺的衍生物，為非兩性的弱酸和弱減，在凝膠聚合過程中，能與聚丙烯酰胺共價結(jié)合，因此，IPG膠的pH梯度是穩(wěn)定的，不依賴于外加電場，基本上克服了ISO-DALT的主要缺點，無論在重復(fù)性和上樣量上均優(yōu)于ISO-DALT。非變性2D：兩向均在非變性條件下進(jìn)行，這樣分離的蛋白質(zhì)點的等電點和表觀分子量同生理條件下獲得的這些蛋白的值是一樣的；非變性/SDS-2D：第一向采用非變性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的條件下進(jìn)行。適于分析非共價鍵連接的蛋白-蛋白間的相互作用。非變性/還原/SDS-2D：非變性條件下IEF聚焦，之后用8M尿素+5%β-ME+2%SDS進(jìn)行平衡，再進(jìn)行第二向SDS電泳。此時分離的蛋白質(zhì)點可進(jìn)行點的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鑒定，提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息。變性2D：樣品先用2%SDS+5%β-ME+95℃變性5min,IEF在8M尿素+1%NP-40條件下進(jìn)行，之后膠條用2%SDS+5%β-ME平衡，然后進(jìn)行SDS。該技術(shù)適于DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析，或分析被碳?xì)滏I連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性，但此方式顯示的大于100KD的蛋白質(zhì)點少于第三種方式。雙向電泳的分類3.儀器簡介第一向：采用珀耳帖溫度控制聚焦平臺；最大電壓為10,000伏；有不同的電壓上升方式；可分步進(jìn)行時間或電壓·小時控制；重泡脹可采取整體的或獨立的步驟；程序可時時控制；可同時聚焦24根7cm，12根17cm膠條；有三個預(yù)設(shè)程序的方法；有十個用戶自定方法；采集運(yùn)行數(shù)據(jù)可經(jīng)RS232端口輸出或任何熱敏打印紙。BIO-RAD公司PROTEANIEFCell等電聚焦儀：AmershampharmciaBiotech公司IPGphor等電聚焦儀：電極區(qū)域為銅鍍金板；最多上12個樣品；平臺溫度為18-25℃±1℃；膠條槽(Holder)體為氧化鋁陶瓷，丙烯酸的蓋子；適合7、11、13和18cm的膠條；程序參數(shù)包括重泡脹時間、平臺溫度、每根膠條的最大限流、每步的電壓、每步的電流改變模式、每步的時間；可編輯10個程序，每個程序分有九個步驟；電壓輸出最大為8000V；最大電流為1.5mA；最大功率為12W。第二向：BIO-RAD公司PROTEANIIxiCell電泳槽：電極是直徑為0.01英寸的白金電極；適用于16.5×20cm凝膠電泳；凝膠厚度為1.0mm；可同時運(yùn)行1-2塊膠；上槽緩沖溶液350ml，下槽緩沖溶液1.2L；典型SDS電泳時間：無冷卻時為5小時，帶冷卻時為3.5小時。配套電源為PowerPac1000：在進(jìn)行電泳時，最大電壓不超過1000V，最大功率不超過80W，最大室溫不超過50℃。AmershampharmciaBiotech公司EttanDALTIISystem：

(1)此系統(tǒng)的電源控制為PowerSupply/ControlUnit：最大輸出功率是200W；溫度控制范圍是10-50℃最大電壓600V；最大電流1A。(2)使用Gelcaster灌膠模具：最多可同時灌25.5×20.5cm、1mm厚的梯度膠或均一膠14塊。AmershampharmciaBiotech公司HoefetminiVEelectrophoresisandelectrotransferUnit：膠大小為10.0×8cm;最多可同時跑兩塊膠；跑一塊膠時需1.7L電極緩沖液，跑兩塊膠時需1.2L電極緩沖液；最大電壓是600V，最大功率是25W；所配置電源為ElectrophoresisPowerSupplyEPS301。圖像分析軟件：AmershampharmciaBiotech公司：

imageMasterTM2Dversion:5.0BIO-RAD公司：

PDQuesTM4.雙向電泳分析中的樣品制備應(yīng)使所有待分析的蛋白樣品全部處于溶解狀態(tài)（包括多數(shù)疏水性蛋白），且制備方法應(yīng)具有可重現(xiàn)性。防止樣品在聚焦時發(fā)生蛋白的聚集和沉淀。防止在樣品制備過程中發(fā)生樣品的抽提后化學(xué)修飾（如酶性或化學(xué)性降解等）。完全去除樣品中的核酸和某些干擾蛋白。盡量去除起干擾作用的高豐度或無關(guān)蛋白，從而保證待研究蛋白的可檢測性。樣品的分級處理通過采用亞細(xì)胞分級、液相電泳和選擇性沉淀等方法對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分級處理，可降低樣品的復(fù)雜性并富集低豐度蛋白質(zhì)。當(dāng)前最簡單有效的處理是采用分級抽提，按樣品溶解度不同進(jìn)行分離。樣品的溶解是2-DE成功分離蛋白質(zhì)的最關(guān)鍵因素之一。1、樣品中非共價結(jié)合的蛋白質(zhì)復(fù)合物和聚積體完全破壞，從而形成各個多肽的溶解液（否則樣品中結(jié)合牢固的蛋白復(fù)合物可能使2-DE中出現(xiàn)新的蛋白點，相應(yīng)的表示單個多肽的點的強(qiáng)度會下降）；2、溶解方法必須允許可能干擾2-DE分離的鹽、脂類、多糖和核酸等物質(zhì)的去除；3、溶解方法要保證樣品在電泳過程中保持溶解狀態(tài)。溶解的目標(biāo)：增加樣品溶解性的手段變性劑：通過改變?nèi)芤褐械臍滏I結(jié)構(gòu)使蛋白質(zhì)充分伸展，將其疏水中心完全暴露，降低接近疏水殘基的能量域。其典型代表是尿素和硫尿。表面活性劑：經(jīng)過變性劑處理而暴露蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)后，還常需至少一種表面活性劑來溶解疏水基團(tuán)。常用的表面活性劑有離子去污劑SDS、非離子去污劑TritonX-100和NP-40、兩性離子去污劑CHAPS、OBG等。其中CHAPS和SB3-10最好。還原劑：在變性劑和表面活性劑聯(lián)用條件下，加還原劑可使已變性的蛋白質(zhì)展開更完全，溶解更徹底。常用含自由巰基的DTT或-巰基乙醇，以及不帶電荷的三丁基膦(TBP)進(jìn)行還原。起載體作用的兩性電解質(zhì)：即便在變性劑和表面活性劑存在的情況下，某些蛋白質(zhì)也需要在鹽離子的作用下才能保持其處于溶解狀態(tài)，否則這些蛋白質(zhì)在其處于PI點時會發(fā)生沉淀。Carrierampholytes的作用在于捕獲樣品中的少量鹽分，從而保證蛋白質(zhì)的溶解性。應(yīng)用時，兩性電解質(zhì)的濃度應(yīng)小于0.2％(w/v)。濃度過高會使IEF的速度降低。另外，為了保證實驗的精確性，在選擇不同pH范圍的IPG膠條時，也應(yīng)使兩性電解質(zhì)的pH值與之相符合。樣品中核酸的去除對電泳的影響：增加樣品粘度、與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物后會出現(xiàn)假象遷移和條紋。解決方法：用適量純的不含蛋白酶的核酸內(nèi)切酶進(jìn)行降解，或是利用合成載體兩性電解質(zhì)(SCA)同核酸結(jié)合形成復(fù)合物的能力，再通過超速離心來去除復(fù)合物。亞蛋白質(zhì)組樣品的制備用超離心技術(shù)分離出細(xì)胞器、質(zhì)膜和細(xì)胞核等成分，再用適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)溶解液進(jìn)行溶解。其優(yōu)點是不僅大大減少樣品的復(fù)雜性，而且可對分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位。但該法需要專業(yè)儀器，有時會出現(xiàn)假陽性。第一步：用Tris堿溶液裂解細(xì)胞提取高溶解性蛋白；第二步：把未溶解的pellet用標(biāo)準(zhǔn)IEF樣品液溶解提取高疏水性蛋白；第三步：用含復(fù)合表面活性劑的蛋白溶解液，最后抽提前兩次抽提后不能溶解的膜蛋白約占整個樣品的11%（W/W）。順序抽提法：根據(jù)細(xì)胞蛋白溶解性的差異，用具有不同溶解能力的蛋白溶解液進(jìn)行抽提的方法。特殊樣品的制備低豐度蛋白的分離：盡管增加上樣量和提高總蛋白的溶解度能增加分離時的低豐度蛋白的量,但同時增加了高豐度蛋白的負(fù)荷，且造成蛋白的疊加效應(yīng)而影響分離。現(xiàn)常用預(yù)分級＋窄pH膠的微制備技術(shù)進(jìn)行分離：即將總蛋白組分成蛋白質(zhì)組亞群，再用pH梯度小于2個pH單位的IPG膠進(jìn)行窄pH范圍的分離。

強(qiáng)堿性蛋白質(zhì)（如核糖體）的處理：先將蛋白預(yù)處理以富集，再用特殊pH梯度的IPG膠條（如pH3-12、4-12或10-12)進(jìn)行等電聚焦。其中窄范圍堿性IPG膠（如pH10-12)的挑戰(zhàn)是克服反向、陰極向陽極、電滲流和水平條紋模式，而寬范圍的堿性IPG膠（如pH3-12、4-12)等消除了窄范圍膠所需要的專門水化液。極端分子量的蛋白質(zhì)：小于8kD和大于200kD的蛋白在常規(guī)IPG-2D上不易看到，這可能是在Tris/glycine緩沖液中，樣品和游離的dodelcylsulfateions持續(xù)積累濃縮，與小分子量的蛋白質(zhì)發(fā)生對流混合，產(chǎn)生茸毛狀的或模糊的帶，從而降低小蛋白的分辨率；在膠底端，高濃度的十二磺酸使蛋白固定致染色困難。至于高分子量蛋白少的原因可能是在變性條件下，蛋白質(zhì)復(fù)合物變成了多肽，或者可能是大分子。5.雙向凝膠電泳技術(shù)流程IPG重泡漲及樣品加樣第一向等電聚焦第二向SDS檢測問題及解決辦法IPG膠條的重泡脹重泡漲時間至少要10h，泡漲不充分會影響相對分子量較高的蛋白質(zhì)的吸收。重泡漲液的體積和膠條的長度相匹配，操作時需參照相關(guān)說明書。不同的加樣方法和加樣量會導(dǎo)致最終結(jié)果的差異。溫度的選擇：重泡漲及等電聚焦時溫度一般穩(wěn)定在20℃，太低尿素會結(jié)晶出來，溫度不穩(wěn)也會造成膠上的蛋白質(zhì)點位置的變化。重泡漲時加上30-50V的低電壓會促進(jìn)膠條對蛋白質(zhì)的吸收，但這一點在制備型電泳時才有意義。商品化的膠條使用前是以干膠條的形式和塑料支撐薄膜粘在一起，加樣前需要先撕去薄膜在重泡漲液中泡漲。重泡漲液的成分是：8mol/LUrea,2%CHAPS,18mmol/LDTT,0.5%IPGBuffer,痕量BromophenolBlue，和裂解液成分基本相同，在10-100mmol/L濃度范圍內(nèi)適當(dāng)提高DTT的濃度可提高蛋白質(zhì)的檢測靈敏度。重泡漲可在等電聚焦盤內(nèi)進(jìn)行，此時樣品已經(jīng)加到重泡漲液中，在加樣杯上樣(cuploading)方式中，膠條在專門的重泡漲盤內(nèi)泡漲完成后再轉(zhuǎn)入等電聚焦盤內(nèi)加樣。泡脹的實質(zhì)：是讓樣品能完全以可溶性的形式進(jìn)入IPG內(nèi)，從而能進(jìn)行接下來的IEF。加樣樣品可以在重泡漲時加入，稱為膠內(nèi)重泡漲(in-gelrehydration)，也可以重泡漲完成后再加入，如加樣杯上樣。重泡加樣相對不可靠，操作比較困難而且蛋白質(zhì)容易在膠和樣品的界面產(chǎn)生沉淀，然而在某些特殊情況下，重泡漲后加樣具有優(yōu)勢，如使用pH

6-9

的膠條分離堿性蛋白質(zhì)時，在陽極用加樣杯加樣，可以得到更好的圖譜。一般而言，膠內(nèi)重泡漲是推薦方式，可以增加蛋白質(zhì)的上樣量，也避免了在陰極或陽極加樣的方向問題。分析型雙向凝膠電泳上樣量在幾十至幾百微克之間，制備型雙向凝膠電泳上樣量在數(shù)百（銀染）到最大幾十毫克（考馬斯亮藍(lán)染色）之間，上樣量的大小和膠條的pH范圍也有關(guān)系，pH范圍越窄，上樣量月大。但由于蛋白質(zhì)定量方法的重復(fù)性并不十分可靠，最佳的上樣量要根據(jù)實驗結(jié)果來優(yōu)化。蛋白載樣量影響IPG膠條對蛋白載樣量的因素包括：待分析的蛋白點的量應(yīng)滿足隨后的質(zhì)譜分析。電泳的目的：如果只是得到一張好的圖片，則無需考慮太多其它因素。待研究蛋白的豐度：樣品的復(fù)雜度：復(fù)雜度較高的樣品，為了盡可能的了解所包含的每種蛋白，需要反復(fù)實驗才能完成。如果將待檢樣品被富集以后則更易分析。IPG膠條的pH范圍：IPG膠條的蛋白質(zhì)大約載樣量IPGStriplengthAnalyticalLoad(silverstaining)PreparativeLoad(Coomstaining)7cm10~100g/125l200~500ug/125l11cm50~200g/185l250~1000ug/185l17cm100~300g/300l1~3mg/300lIPGIEF中pH梯度的選擇常用方法：先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，預(yù)試驗確定。預(yù)分步收集細(xì)胞漿細(xì)胞核細(xì)胞膜核糖體及其他特定細(xì)胞成份細(xì)胞分泌成份pH4-12pH3-10pH4-7pH5-8pH7-10pH6-11pH3-6pH3-4pH4-5pH5-6pH6-7pH7-8pH8-9pH9-10pH10-11pH11-12第一步第二步第三步用窄pH范圍陣列分離低豐度或交叉覆蓋蛋白陣列那些亞細(xì)胞定位位置的功能蛋白質(zhì)亞蛋白質(zhì)組陣列策略的框架圖3倍3倍聚焦時間的優(yōu)化重泡漲結(jié)束后，在膠條和電極之間加上潤濕的小紙片，它可以吸收鹽離子和補(bǔ)充水分。在陰極加上20mmol/LDTT潤濕的紙片可減少堿性端的水平條紋并且有助于堿性蛋白質(zhì)的聚焦。從理論上講，獲得最好的圖譜質(zhì)量和重復(fù)性所需的最佳時間是IEF分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時間。聚焦時間太短，會導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖然不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但會因為活性水轉(zhuǎn)運(yùn)而導(dǎo)致過多水在IPG膠表面滲出（電滲）而造成蛋白圖譜變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋以及蛋白丟失。最佳時間的確定需要根據(jù)不同蛋白樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度通過經(jīng)驗來確定。等電聚焦的電壓上升分為三個階段首先加上一個比較低的電壓，去出膠條中的過多的鹽離子；然后開始加高電壓，電壓上升的模式為緩慢上升；最后是持續(xù)高壓，電壓上升的模式為快速上升。一般原則是：根據(jù)膠條的pH范圍和上樣量的多少，總電壓時間積可以在一定的范圍內(nèi)調(diào)整。IEF的基本條件Stemp1Stemp2Stemp3totalvoltageTimeVolt-HoursRamp25020min－－－Linear400040002hr－－－－－－10,000V-hrLinearRapid5hr14,000V-hr7cmStemp1Stemp2Stemp3totaltotalStemp1Stemp2Stemp311cm17cm25025080001000010000800020min20min2.5hr2.5hr－－－－－－－－－－－－－－－－－－20,000V-hr40,000V-hr～30,000V-hr～50,000V-hr5.3hr7hrLinearLinearLinearLinearRapidRapid兩維間的平衡一維（等點聚焦）電泳結(jié)束后可馬上進(jìn)行二維電泳，也可保存在兩片塑料膜間于－80°保存數(shù)月。但在二維電泳前一定要進(jìn)行膠條的平衡，以便于被分離的蛋白質(zhì)與SDS完整結(jié)合，從而在SDS時電泳能順利進(jìn)行。建議方案是：用含2%(m/v)SDS、1%(m/v)DTT、6mM尿素和30%甘油的50mMTris(pH8.8)緩沖液先平衡15min，再用5%(m/v)碘乙酰胺取代DTT后的上述緩沖液平衡15min。如果用TBP代替DTT則只需一步平衡。二維SDS同普通SDS類似。但一般在垂直電泳系統(tǒng)中無需濃縮膠，可以把IPG膠條看作是壓縮膠，因為在IPG膠條中蛋白質(zhì)區(qū)域已得到濃縮，可以認(rèn)為非限制性IEF膠（低濃度丙烯酰胺膠）充當(dāng)了濃縮膠，所以只需使用分離膠（也可使用壓縮膠）。IPG膠條平衡好后，一般將膠條在電泳緩沖夜里浸一下，這樣一方面可以清洗膠條去除膠條上的平衡液，另一方面，潤濕的膠條也容易沿著玻璃板推到SDS膠上端。IPG膠條轉(zhuǎn)移到SDS有兩種方式：一種方式是先將IPG膠條放到SDS膠上，再加入熔化的瓊脂糖溶液；另一種方式是先加入熔化的瓊脂糖溶液，再將IPG膠條放到

SDS

膠上。兩種方法各有優(yōu)劣，第一種方式圖譜不易變形，但在兩塊膠之間容易有小氣泡發(fā)生，第二種方式非常好地解決了膠之間的氣泡問題，但瓊脂糖容易凝固，插入

IPG

膠時有時會造成圖譜變形。相比較之下，氣泡對圖譜的影響較小，故常推薦第一種方式。SDS膠的濃度需根據(jù)研究目的和樣品性質(zhì)而定。常用的是12%和12.5%的均一膠，灌膠方便，重復(fù)性好，但相對分子質(zhì)量較高的蛋白質(zhì)斑點較為聚集，分離不佳。如采用9-16%的線性梯度膠，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)點在整塊凝膠上分布比較均勻，但灌膠不易。電泳過程中溫度一般控制在10-15℃。聚丙烯酰胺凝膠和轉(zhuǎn)印到膜上的蛋白質(zhì)的檢測理想顯色劑的7S安全(safety)；靈敏(sensitivity)；簡單(simplicity)；特異性(specificity)；快速(speed)；穩(wěn)定(stability)；兼容性(synergy)。有機(jī)染料和銀染考染靈敏度為30~100ng，線性范圍是20倍；銀染的線性范圍是40倍，靈敏度是考染的100倍。膠體考馬斯亮藍(lán)染色技術(shù)可實現(xiàn)PAGE的無背景染色，其極限靈敏度為8~10ng，但這種染液會對蛋白質(zhì)進(jìn)行修飾而影響