傳染病病原診斷技術(shù)演示文稿

傳染病病原診斷技術(shù)演示文稿當(dāng)前1頁，總共99頁。傳染病病原診斷技術(shù)當(dāng)前2頁，總共99頁。FriendorFoe?RotavirusEbolavirusBacteriumAlgaeProtozoanVirus當(dāng)前3頁，總共99頁。當(dāng)前4頁，總共99頁。1973年以來部分新發(fā)的傳染病1973輪狀病毒嬰兒腹瀉的主要病因

1975細(xì)小病毒B195號(hào)病，慢性溶血性貧血的再障危象

1976隱孢子蟲隱孢子蟲病，急性小腸結(jié)腸炎

1977埃博拉病毒埃博拉出血熱

1977嗜肺軍團(tuán)菌軍團(tuán)病

1977漢坦病毒腎綜合征出血熱

1977空腸彎曲桿菌空腸彎曲菌腸炎

1977丁型肝炎病毒丁型肝炎

1980嗜人T細(xì)胞病毒I型T細(xì)胞淋巴瘤／白血病

1981金黃色葡萄球菌產(chǎn)毒株中毒性休克綜合征

1982大腸埃希菌O157：H7出血性結(jié)腸炎

1982嗜人T細(xì)胞病毒11型毛細(xì)胞白血病

1982伯氏疏螺旋體萊姆病

1983人類免疫缺陷病毒艾滋病(HIV)當(dāng)前5頁，總共99頁。1973年以來部分新發(fā)的傳染病(續(xù))1983幽門螺桿菌消化性潰瘍病1986環(huán)孢子球蟲環(huán)型孢子蟲病(頑固性腹瀉)1988人皰疹病毒6型突發(fā)性玫瑰疹1989丙型肝炎病毒丙型肝炎1990戊型肝炎病毒戊型肝炎19920139霍亂弧菌O139霍亂1992巴爾道氏體貓抓病，桿菌性血管瘤病1993漢坦病毒分離株漢坦病毒肺綜合征1994Sabia病毒巴西出血熱1994新變異型克雅氏病(人類瘋牛病)1985年瘋牛病（牛海綿狀腦炎BSE）

--1994年出現(xiàn)首例nvCJD--1996年提出nvCJD概念病原為朊蛋白PrP（英）1995庚型肝炎病毒庚型肝炎1997H5N1禽流感病毒人禽流感1998Nipah病毒尼巴病毒性腦炎1999西尼羅病毒西尼羅病毒性腦炎2000裂谷熱(RiftValley)病毒裂谷熱2003SARS冠狀病毒SARS（傳染性非典型肺炎）當(dāng)前6頁，總共99頁。大部分人類致命性疾病均是由動(dòng)物傳播，包括現(xiàn)正肆虐全球的禽流感。每年至少有一種新病原體，包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲、原生動(dòng)物和真菌等從動(dòng)物傳染給人類。前所未有的速度產(chǎn)生突變，并傳給人類，就如艾滋病、馬爾堡出血熱、SARS以及現(xiàn)正肆虐全球的禽流感等難抗病毒。研究人員分辨1407種令人類生病的病原體，發(fā)現(xiàn)其中至少800種越過種物界線，由動(dòng)物傳至人類。新發(fā)傳染?。瓌?dòng)物傳播當(dāng)前7頁，總共99頁。與人類行為及環(huán)境的改變有關(guān)過去25年來曾出現(xiàn)38種新病原體襲擊人類，其中四分三為源自動(dòng)物的疾病，包括艾滋病、馬爾堡出血熱、SARS及禽流感等。叢林打獵、密集耕種、全球變暖及長途旅行的普及，增加疾病跨種物傳播的機(jī)會(huì)，使動(dòng)物身體上的病原體容易產(chǎn)生突變，感染人類。一個(gè)典型例子是艾滋病毒，最初原是在非洲猿猴身上發(fā)現(xiàn)的一種病毒，其后傳播至人類身上，更演變成世紀(jì)絕癥。當(dāng)前8頁，總共99頁。新病原體的特征現(xiàn)時(shí)人類新傳染病的病原體，多屬于核糖核酸(RNA)病毒類，包括艾滋病毒及流感病毒，可于短時(shí)間內(nèi)發(fā)生突變，并容易適應(yīng)新宿主，令跨種物傳播機(jī)會(huì)變得更大。當(dāng)前9頁，總共99頁。人類與傳染病較量中的四方面重大突破隔離檢疫制度的建立;病原微生物的發(fā)現(xiàn);特效藥物的出現(xiàn);疫苗的誕生.當(dāng)前10頁，總共99頁。快速診斷是關(guān)鍵在人類與傳染病的斗爭中，診斷、治療和預(yù)防是三個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其中，及時(shí)正確診斷最為關(guān)鍵，是有效治療的基礎(chǔ)，也是制定預(yù)防策略的依據(jù)。及時(shí)發(fā)現(xiàn)、有效鑒別、快速診斷和提出預(yù)警，這是現(xiàn)代傳染病防治體系的最前沿

對已知傳染病要盡快明確診斷對未知新發(fā)傳染病要查病因

當(dāng)前11頁，總共99頁。傳染病的實(shí)驗(yàn)室診斷一般檢查;生化檢查;病原學(xué)檢查;免疫學(xué)檢查;病理組織檢查;影像學(xué)檢查.當(dāng)前12頁，總共99頁。傳統(tǒng)的和常規(guī)的病原學(xué)診斷分離培養(yǎng)(細(xì)胞,組織動(dòng)物);顯微鏡檢查(光學(xué)和電子顯微鏡);抗原成分檢測(ELISA,免疫熒光等);分子生物學(xué)基因診斷(核酸雜交,PCR等);當(dāng)前13頁，總共99頁。ElectronmicrographsAdenovirusRotavirus(courtesyofLindaStannard,UniversityofCapeTown,S.A.)當(dāng)前14頁，總共99頁。免疫熒光檢測Positiveimmunofluorescencetestforrabiesvirusantigen.(Source:CDC)(VirologyLaboratory,Yale-NewHavenHospital)當(dāng)前15頁，總共99頁。細(xì)胞病變效應(yīng)(cpe)Someviruseskillthecellsinwhichtheyreplicate,ofteneasilyvisibleascpe,othervirusesproducelittleornocpeTypicallyroundingordetachingofcellsandcellfusion(syncytia)FromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpressFromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress當(dāng)前16頁，總共99頁。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物L(fēng)aboratoryanimals-animalmodelsofhumaninfection.Historicallytheonlywaytostudyviruseswasfromanimaltoanimal.Problems-1)inconvenientandexpensive,2)notadefinedsystem-leadstogenerationofvirusmutants,3)animalwelfareissues,Advantages-1)somevirusescanonlybestudiedinthisway,2)givesuniqueinsightintoviruspathogenesisEmbryonatedeggsFromPrinciplesofVirology,FlintetalASMpress當(dāng)前17頁，總共99頁。核酸診斷的發(fā)展史核酸分子雜交聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）核酸定量分析核酸的直接檢測核酸擴(kuò)增檢測(PCR)定性PCR定量PCR當(dāng)前18頁，總共99頁。核酸分子雜交(nucleicacidmoleculahybridization)genomeprobe32P35S3H125I生物素地高辛酶genomegenomegenomeprobeprobeprobe檢測方法：放射自顯影底物顯色化學(xué)發(fā)光當(dāng)前19頁，總共99頁。常用核酸分子雜交技術(shù)斑點(diǎn)雜交（spotblothybridization)凝膠電泳印跡轉(zhuǎn)移雜交（Southernblothybridization)原位雜交（in-situhybridization)當(dāng)前20頁，總共99頁。聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）基本步驟和原理變性（高溫）退火（低溫）延伸（適溫）每一循環(huán)模板引物引物dATPdGTPdTTPdCTPTaq酶當(dāng)前21頁，總共99頁。PCR原理和步驟當(dāng)前22頁，總共99頁。定量PCR

---熒光實(shí)時(shí)定量PCRTaqman水解探針法雜交雙探針法分子信標(biāo)（環(huán)性探針）法

Amplisensor能量轉(zhuǎn)換法等當(dāng)前23頁，總共99頁。新發(fā)傳染病的病原體？？？當(dāng)前24頁，總共99頁。病原學(xué)發(fā)現(xiàn)的“科赫三定律”一、每種傳染病必定能發(fā)現(xiàn)其病原體；二、能培養(yǎng)出該病原體的純種；三、以培養(yǎng)出的純種病原體接種于動(dòng)物可以產(chǎn)生相同的病變。

當(dāng)前25頁，總共99頁。

建立該病原體的鑒定方法動(dòng)物試驗(yàn)臨床實(shí)驗(yàn)室診斷流行病學(xué)研究等分離到該病原體確定一種疾病病原體的基本步驟最終確定病原體與疾病的病因?qū)W關(guān)系當(dāng)前26頁，總共99頁?；舅悸坊卮饍蓚€(gè)問題：是否是已知的病原體或其變種？是否是完全未知的一種病原體？基本要求：快、準(zhǔn)當(dāng)前27頁，總共99頁。已知病原體的快速診斷高通量的檢測技術(shù)當(dāng)前28頁，總共99頁。高通量的病原體篩選技術(shù)病原體核酸的高通量檢測技術(shù)一：多重PCR（聯(lián)用技術(shù)：質(zhì)譜技術(shù)、液相芯片技術(shù)）技術(shù)二：病原體基因芯片病原體抗原或抗體的高通量檢測核心技術(shù)：蛋白質(zhì)芯片當(dāng)前29頁，總共99頁。MultiplexPCR-MassTagsystem多重PCR-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)當(dāng)前30頁，總共99頁。美國哥倫比亞大學(xué)Lipkin研究組發(fā)明了一種基于multiplexPCR-MassTag（多重PCR與質(zhì)譜聯(lián)用）的高通量病原體快速篩選技術(shù)。優(yōu)點(diǎn)：由于使用光敏感的分子量標(biāo)簽，增強(qiáng)了multiplexPCR引物設(shè)計(jì)的適應(yīng)性和靈活性，使檢測通量有大幅度的提高。應(yīng)用質(zhì)譜分析PCR產(chǎn)物上的分子量標(biāo)簽克服了凝膠電泳分辨率的局限或熒光染料種類的局限。當(dāng)前31頁，總共99頁。1.PCRamplificationwithconjugatedprimers90minutesBA2.PCRpurificationonfilterplate30minutes3.Elutioninto96-wellloadingplateformassspectrometeranalysis96-wellthermocyclerplateBA4.Automatedsampleinjection,photocleavageanddetection1:30minutes/samplePurifiedsamplesUltravioletLightCleavageofmasstagsfromampliconMSBABABABABABAIonizationanddetectionABABMassSizeAbundance5.IdentificationofpathogenbysignalanalysisPCR-MassTagsystem當(dāng)前32頁，總共99頁。NUCLEICACIDCONJUGATEDMASSTAGSPhotocleavablelinkerandspacerMSsensitivityenhancerVariablemassunit

當(dāng)前33頁，總共99頁。DETECTIONOF58DIFFERENTMASSTAGSBYAPCI-MS當(dāng)前34頁，總共99頁。目前，建立在此技術(shù)上的有呼吸道病原體檢測模塊（包括19個(gè)病毒和3種細(xì)菌），流感病毒亞型檢測模塊，出血熱病原體檢測模塊，痘疹病毒檢測模塊和腦炎腦膜炎病原體檢測模塊。盡管目前已開發(fā)的分子量標(biāo)簽只有64個(gè)，但根據(jù)質(zhì)譜分析的分子量范圍，還可有極大的拓展空間，保證了這一技術(shù)具有足夠的發(fā)展前景和潛力。應(yīng)用當(dāng)前35頁，總共99頁。RESPIRATORYSYNDROMEPANELInfluenzaAMatrixInfluenzaAN1InfluenzaAN2InfluenzaAH1InfluenzaAH2InfluenzaAH3InfluenzaAH5InfluenzaBHARSVGroupARSVGroupBMetapneumovirusEuropeanstrainsAmericanstrainsCoV-SARSCoV-OC43CoV-229EHPIV-1HPIV-2HPIV-3HPIV-4HPIV-4aHPIV-4bChlamydiapneumoniaeMycoplasmapneumoniaeLegionellapneumophilaStreptococcuspneumoniaeHaemophilusinfluenzaeInfluenzaAH7RhinovirusHerpesSimplexVirus1,2VaricellaZosterVirusCytomegalovirusHIV-1HIV-2MeaslesvirusMycobacteriumtuberculosisPneumocystiscariniiCoxiellaburnettiCurrent

Respiratory

PanelIn

ProgressEnterovirusAdenovirus當(dāng)前36頁，總共99頁。HEMORRHAGICFEVERPANELEbolavirus(Zaire)Ebolavirus(Sudan)MarburgvirusCrimean-CongohemorrhagicfevervirusRiftValleyvirusHantaanvirusSeoulvirusYellowFeverKyasanurForestvirusLassavirus (lineageIV)Ebolavirus(Reston)JuninvirusMachupovirusDobravavirusTacaribevirusGuanaritovirusSabiavirusLCMVChikungunyavirus

DenguevirusgroupBorreliaburgdorferiHerpesSimplexvirus(1,2)HIV-1,-2NeisseriameningitidisRickettsiaSpottedFeverGroupPlasmodiumspCurrentPanelIn

Progress當(dāng)前37頁，總共99頁。ACBLabNetworkEpidemiologyMicrobiologyresearchservicetraining

infectiousagentssamplesclinicaldataGLOBALSURVEILLANCENETWORKAnimalmodelsdrugsvaccinesDrosten,HamburgLipkin,NewYorkMackenzie,PerthPauli,BerlinPeiris,HongKongQian,BeijingPerez-Brena,MadridSwanepoel,SouthAfricaWebster,MemphisWen,Shanghai當(dāng)前38頁，總共99頁。MultiplexPCR-XMAP多重PCR-液芯聯(lián)用技術(shù)當(dāng)前39頁，總共99頁。DiagramLUMINEXXMAP技術(shù)：多指標(biāo)并行檢測系統(tǒng)（流式熒光技術(shù)或液芯技術(shù)）技術(shù)GENOCATemplex?PCR技術(shù):多指標(biāo)并行擴(kuò)增當(dāng)前40頁，總共99頁。SuperPrimerTemplex?PCR技術(shù)原理當(dāng)前41頁，總共99頁。Templex?PCR技術(shù)原理當(dāng)前42頁，總共99頁。巢示PCR引物提高了引物間的相容性低濃度的特異性引物降低了反應(yīng)過程中的背景值.僅有的一條生物素標(biāo)記的引物使得更容易擴(kuò)大生產(chǎn)以及質(zhì)量控制.當(dāng)前43頁，總共99頁。流式熒光技術(shù)（液芯）原理——XMAP熒光編碼微球技術(shù)當(dāng)前44頁，總共99頁。每種微球的地址由兩種紅色熒光顏料的摻入比例唯一決定顏色編碼的微球當(dāng)前45頁，總共99頁。共價(jià)交聯(lián)技術(shù)CONH當(dāng)前46頁，總共99頁。反應(yīng)模式當(dāng)前47頁，總共99頁。MultiplexAssayswithColorSeparetion當(dāng)前48頁，總共99頁。Luminex100多功能流式點(diǎn)陣儀流式熒光檢測儀當(dāng)前49頁，總共99頁。

呼吸道感染Ⅰ型

11種DNA基因組的病原體當(dāng)前50頁，總共99頁。呼吸道感染Ⅱ型

13種RNA基因組病毒型病原體當(dāng)前51頁，總共99頁。蛋白質(zhì)芯片MASATM液相芯片當(dāng)前52頁，總共99頁。一.基本原理微小的乳膠顆粒（Beads,微球）分別染成不同的熒光色，然后再把針對不同檢測物的蛋白（如抗原抗體）以共價(jià)方式結(jié)合到特定顏色的微球上。應(yīng)用時(shí)，先把針對不同檢測物的、用不同顏色編碼的微球混合，再加入被檢測物（被測物可以是血清中的抗原、抗體、或酶等）。當(dāng)前53頁，總共99頁。固定生物分子的微球當(dāng)前54頁，總共99頁。懸浮點(diǎn)陣多分析物組合靈活當(dāng)前55頁，總共99頁。TheRedLaserisUsedtoIdentifytheBeadCodeTheGreenLaserisUsedtoIdentifytheReporterSignal當(dāng)前56頁，總共99頁。

液相芯片的特點(diǎn)：

液相芯片的獨(dú)特設(shè)計(jì)使得它擁有常規(guī)的蛋白質(zhì)檢測方法所不具備的特點(diǎn)：

1.重復(fù)性好

2.通量大

可對同一樣本中的多種不同目的分子同時(shí)進(jìn)行分析在35-60分鐘內(nèi)可對96個(gè)不同樣本進(jìn)行檢測。當(dāng)前57頁，總共99頁。

3.靈活性好

4.靈敏度高

5.信噪比好

6.操作簡便，不需洗滌，耗時(shí)短

7.液相環(huán)境更有利于保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象，也更有利于探針和被檢測物的反應(yīng)

當(dāng)前58頁，總共99頁。HybridizationTime%ofMaximumMinutes當(dāng)前59頁，總共99頁。

MASATM和ELISA靈敏度的比較當(dāng)前60頁，總共99頁?；蛐酒℅eneChip）

何謂基因芯片：基因芯片（或DNAChip,或Microarray）又稱DNA微陣列，是指固定在固相載體上的高密度DNA微點(diǎn)陣。即將大量靶基因或寡核苷酸片段有序地，高密度地（點(diǎn)與點(diǎn)間距一般小于500μm）排列在玻璃、硅等載體上，稱之為基因芯片?；蛐酒姆N類：

按應(yīng)用，基因芯片主要可分為3類：1、表達(dá)譜基因芯片：主要用于基因功能研究；2、診斷基因芯片：如肝癌診斷芯片、糖尿病診斷芯片、病原體多基因診斷芯片等：3、檢測芯片：如商品檢疫芯片、病原體檢測芯片等。當(dāng)前61頁，總共99頁。ViralPathogenCustomMicroarray病原體診斷基因芯片當(dāng)前62頁，總共99頁。當(dāng)前63頁，總共99頁。HighSensitivityScanner0.05CPSMCPSM-whatdoesitmean?Chromphorespersquaremicron0.05cpsmor5moleculesofdyeper10micronpixel.Competitorsbestis10moleculesofdyeper10micronpixel.Toachievehighsensitivity:DynamicAutofocusLaserstabilityControlHighresolutionscanning0.05CPSMDetect5dyemolecules

in10umpixel

0.1CPSMDetect10dyemolecules

in10umpixel當(dāng)前64頁，總共99頁。eArray

DeliveringCustomContentandFormatsBackNameYourDesignSelectArrayFormat當(dāng)前65頁，總共99頁。ProkaryoticArrayCustomDesignsAgrobacteriumAnopheles(AG)andPlasmodium(PB)...ie.malariamicroarrayArchaeon,Halobacteriumsp.BacilluscereusBacterialpathogensBifidobacteriumlongumBordetellaPertussisChlamydophilaabortusCulexpipiensCyanobacteriumSynechocystisE.ColiErwiniacarotovoraatroseptica/SolanumtuberosumLactobacillusplantarumMethylobacteriumextorquensAM1PlasmodiumfalciparumPseudomonasaeruginosaS.aureus;N.meningococcus;E.coliSalmonellatyphimuriumStaphylococcusaureus當(dāng)前66頁，總共99頁。SARSCoronavirus當(dāng)前67頁，總共99頁。HumanCoronavirusOC43當(dāng)前68頁，總共99頁。HumanCoronavirus229E當(dāng)前69頁，總共99頁。GreeneChip1.1CATCTGGTGTGGAAGCCTTATCGGAACAAGGACCAGAGCCACCTGGGCTGAGAACATCTASample:WNVNY99100,000RNAcopies/ml32/45tophitsareWNV-specific;remainderareJEVgrouporotherflavivirus-genusprobesCollaborationbetweentheGreeneLaboratoryofColumbiaUniversity,ICTV,NortheastBiodefenseCenter,andAgilentCorporation當(dāng)前70頁，總共99頁。CATCTGGTGTGGAAGCCTTATCGGAACAAGGACCAGAGCCACCTGGGCTGAGAACATCTASample:SARS-CoV100,000RNAcopies/mlGreeneChip1.1Columbia(Briese,Lipkin,Liu,LussierPalacios),ICTV(Büchen-Osmond),andAgilent(Hirschberg)251,000sequencedatabase,1710vertebrateviruses當(dāng)前71頁，總共99頁。未知新病原體的發(fā)現(xiàn)當(dāng)前72頁，總共99頁。發(fā)現(xiàn)新病毒的主要技術(shù)路線表達(dá)cDNA文庫篩選技術(shù)寬范圍PCR（基于保守序列的PCR）差異顯示技術(shù)：代表性差異分析（RDA）抑制性消減雜交（SSH）序列非依賴的擴(kuò)增：隨機(jī)PCR（randomePCR）序列非依賴的單引物擴(kuò)增（SISPA）當(dāng)前73頁，總共99頁。當(dāng)前74頁，總共99頁。cDNA文庫篩選cDNA文庫篩選常被用來檢出RNA病毒的核酸。收集病毒顆粒（感染組織勻漿過濾，或者血漿超速離心以收集病毒顆粒），提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,構(gòu)成cDNA表達(dá)文庫。最常用的表達(dá)型載體是λgt11,插入的cDNA片斷可以融合蛋白形式表達(dá)，保留抗原性。病毒在感染過程刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體，因而常用患者恢復(fù)期的血清對cDNA庫進(jìn)行免疫學(xué)篩選。當(dāng)前75頁，總共99頁。HCV的發(fā)現(xiàn)

1989年Choo等小組從被感染的黑猩猩的血漿中用超離心的方法收集病毒顆粒，提取核酸（包括RNA和DNA），充分變性后逆轉(zhuǎn)錄cDNA，構(gòu)建λgt11cDNA表達(dá)文庫。用慢性非甲非乙肝炎患者的血清篩選庫，結(jié)果得到一個(gè)反應(yīng)性克隆。該cDNA克隆與正常人的DNA不雜交，說明他來源于外源基因組。與被感染黑猩猩的肝組織RNA雜交，與未感染黑猩猩的肝組織RNA不雜交，提示該因子可能就是輸血相關(guān)肝炎的一種致病因子。發(fā)現(xiàn)該cDNA克隆僅與被感染黑猩猩的肝組織RNA雜交，而與DNA不雜交，提示該因子是一種RNA病毒。序列分析表明屬于黃病毒科，命名為HCV。當(dāng)前76頁，總共99頁?；诒Ｊ匦蛄械木酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)

（ConsensusSequenceBasedPCR）基本原理：基于保守序列的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（以下簡稱保守序列PCR）就是通過已知的一種生物和另一種生物之間高度保守的DNA序列設(shè)計(jì)引物，用PCR的方法去擴(kuò)增另一種生物的未知DNA序列。當(dāng)一種未知病毒與可能與另一種已知的病毒相似時(shí)，可以根據(jù)已知病毒的保守序列設(shè)計(jì)引物，然后用PCR方法擴(kuò)增出未知病毒的相應(yīng)序列。當(dāng)前77頁，總共99頁。新型漢坦病毒的發(fā)現(xiàn)

1993年5月，在美國西南部爆發(fā)了一場高死亡率的急性呼吸道疾病。血清學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)。病人的血清能與一些已知的漢坦病毒抗原起交叉反應(yīng)，提示該病的病原體有可能是一種以前未能發(fā)現(xiàn)的新漢坦病毒。1993年Nichol等根據(jù)已知的漢坦病毒基因組M片斷的包膜糖蛋白G2編碼區(qū)的保守部位設(shè)計(jì)了PCR引物，擴(kuò)增出一個(gè)278bp的DNA片斷。序列分析表明，與其他個(gè)血清型的漢坦病毒至少有30%的不同源性，在系統(tǒng)發(fā)生上與IV型希望山病毒（ProspectHillvirus,PH）最為接近，說明該病毒是一種新的漢坦病毒。當(dāng)前78頁，總共99頁。基于保守序列的PCR技術(shù)要點(diǎn)---引物設(shè)計(jì)一種是簡并PCR，其所用的是一個(gè)混合的引物庫，包含了已知某種病毒高度保守氨基酸區(qū)域的所有可能的核苷酸序列（設(shè)計(jì)引物之前，列出該病毒家族所有成員的對比圖），但簡并度很高時(shí)有效引物的濃度不足。另一種是根據(jù)密碼子的偏向性設(shè)計(jì)單一的引物：依照高度保守的氨基酸序列，選擇每個(gè)氨基酸最常用的密碼子組成一條完整的引物。適用于分離親緣關(guān)系較近的相關(guān)序列，但對親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的序列則不能檢出。當(dāng)前79頁，總共99頁。簡并引物設(shè)計(jì)目前已經(jīng)可以有計(jì)算機(jī)軟件來設(shè)計(jì)，常用的軟件有:

PrimoDegenerate3.4GenefisherCODEHOPSimpledegenerateprimer(U:Oregon)

當(dāng)前80頁，總共99頁。差異顯示技術(shù)

（differentialdisplay)最先是Liang和Pardee等提出用于比較兩種細(xì)胞或同種細(xì)胞在不同狀態(tài)下mRNA表達(dá)差異的技術(shù);現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展了多種分離和鑒定差別表達(dá)基因的技術(shù)，其中代表性差異技術(shù)(RDA)和抑制消減雜交技術(shù)(SSH)以其靈敏度高、假陽性率低和重復(fù)性好而相對更受歡迎當(dāng)前81頁，總共99頁。代表性差異分析

（RepresentationalDifferenceAnalysis,RDA）基本原理：病原微生物感染靶器官或組織時(shí)，同時(shí)帶入自己的基因組，這樣病理組織就比正常組織多出了病原體基因組。RDA可以把單拷貝的外源基因組從高度復(fù)雜的人染色體DNA本底中檢測出來。當(dāng)前82頁，總共99頁。RDA流程分別提取實(shí)驗(yàn)組(Tester)和對照組(Driver或驅(qū)動(dòng)子)的總RNA或者DNA用四堿基內(nèi)切酶充分酶切，分別連上寡核苷酸接頭，并用特異性的接頭引物擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物去除接頭，再在實(shí)驗(yàn)組擴(kuò)增子上連上新接頭，將兩份擴(kuò)增子雜交，以新接頭為引物進(jìn)行擴(kuò)增只有那些未能與驅(qū)動(dòng)擴(kuò)增子雜交而自身退火的樣品DNA的兩端因都能與引物配對才以指數(shù)形式擴(kuò)增，而待檢樣品單鏈DNA和驅(qū)動(dòng)樣品DNA只有一端與引物配對而線性擴(kuò)增當(dāng)前83頁，總共99頁。GBV病毒的發(fā)現(xiàn)GB肝炎是Deinhardt等在1970年首先報(bào)道。后研究表明GB肝炎因子不同于甲-戊型肝炎病毒。1995年Simons等用GB肝炎因子感染狨猴取同一狨猴感染前和感染后急性期的血漿，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作RDA分析，7個(gè)cDNA克隆序列分析表明，屬于兩種黃病毒，與HCV有一定同源性命名為GBV-A和GBV-B。當(dāng)前84頁，總共99頁。RDA的缺點(diǎn)其本身不能消除不同mRNA分子豐度的差異,因而往往需要進(jìn)行多輪雜交而每輪雜交都涉及到接頭的連接和去除效率問題以及綠豆核酸酶消化去除單鏈等操作當(dāng)前85頁，總共99頁。抑制性消減雜交技術(shù)（SSH）1996年Diatchenko等將抑制性PCR和減法雜交結(jié)合起來，創(chuàng)立了SSH技術(shù)。該技術(shù)通過接頭特異性的引物選擇性地?cái)U(kuò)增差異表達(dá)基因片段的同時(shí)，可以抑制非靶片段的擴(kuò)增。利用雜交二級動(dòng)力學(xué)原理巧妙地在減法雜交過程中消除了不同mRNA分子間豐度的差異，因而通過一次減法雜交可將差異片段富集1000倍以上。一般只需兩輪雜交，3-4天即可得到幾十或上百個(gè)差異片段當(dāng)前86頁，總共99頁。SSH的基本步驟當(dāng)前87頁，總共99頁。RDA與SSH原理相似：都是建立在PCR技術(shù)和減法雜交的基礎(chǔ)上。RDA是先對樣品的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增再雜交，而SSH則是先減法雜交再擴(kuò)增。兩者都具有高效、重復(fù)性好、陽性率高等優(yōu)點(diǎn)。共同的缺點(diǎn)：由于驅(qū)趕子和待檢測的標(biāo)本的背景往往不完全相同，富集的差異片段可能不是微生物學(xué)鑒別的有用標(biāo)記。當(dāng)前88頁，總共99頁。最新的技術(shù)序列非依賴的擴(kuò)增法：隨機(jī)PCR(randomPCR)技術(shù)序列非依賴的單引物擴(kuò)增(SISPA:sequenceindependentsingleprimeramplification）當(dāng)前89頁，總共99頁。RandomPCR基本原理：在合成隨機(jī)引物時(shí)在其加上一個(gè)相同的接頭，這個(gè)接頭含有一個(gè)限制性的酶切位點(diǎn)可以便于隨后的片斷克隆進(jìn)載體，然后對插入序列測序并進(jìn)行BLAST比對即可初步獲得未知病毒的種系來源信息。這種隨機(jī)PCR法不僅可以檢出DNA病毒也可以檢出RNA病毒。利用這種方法Allander等在2005年在呼吸道感染的標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)了一種人的parvovirus；StangA等也在2005年使用這種方法在慢性疲勞綜合癥的病人漱口液中意外檢測出了HSV-1型病毒。當(dāng)前90頁，總共99頁。SISPASISPA是單引物擴(kuò)增法中最常用的一種方法，用于鑒定低濃度的未知序列的病毒核酸?；驹恚簩蚪MDNA常用識(shí)別四個(gè)堿基的酶先切割，然后在雙鏈核酸片段的兩端連接上一個(gè)相同序列的接頭（adaptor），這個(gè)接頭可作為隨后PCR反應(yīng)的引物，進(jìn)行單引物擴(kuò)增。通過將這些產(chǎn)物克隆即可進(jìn)行測序。SISPA有很多的衍生方法，主要是通過對引物進(jìn)行修飾如引入酶切位點(diǎn)、單鏈接頭或者平頭、粘性末端；或者是未知的