實驗二銀耳多糖含量的測定

關于實驗二銀耳多糖含量的測定第一頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一一、實驗目的學習和掌握多糖含量測定的原理和方法。第二頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一三、實驗原理多糖在濃硫酸中水解，進一步脫水生成糖醛及其衍生物，與蒽酮（10-酮-9,19-二氫酮）反應生成藍綠色復合物，在620nm處有最大吸收值。以標準葡萄糖溶液作標準，在620nm波長處進行比色，可計算出總糖的含量。第三頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一（1）糖經(jīng)濃無機酸處理后，脫水生成糠醛或糠醛衍生物；第四頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一（2）糠醛和糖醛衍生物在濃無機酸的作用下，能與蒽酮化合物反應生成有色物質。（3）反應液顏色的深淺，反映出糖濃度的高低。第五頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一四、儀器、試劑與藥品試劑：0.1mg/ml的葡萄糖標準品、蒽酮試劑、蒸餾水樣品液：0.5mg/ml試管、電爐、可見光分光度計、容量瓶etc.第六頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一五、實驗操作1、標準曲線的制作(1)加樣：(2)將加好的樣品混勻，沸水浴10min，室溫冷卻，于620nm處比色。(3)以第一管為空白，進行比色。以光密度（OD值)為縱坐標，糖的含量(μg)數(shù)為橫坐標，得標準曲線。第七頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一2.樣品的準備稱取適量樣品，先加少量的水溶解，最后定容于50ml，至溶液濃度約為0.5mg/ml.3.樣品中多糖含量的測定分別吸取0.1、0.3和0.5ml樣品液，用蒸餾水補足1.00ml。加入蒽酮試劑，同標準曲線制作之操作，比色測定。根據(jù)標準曲線和樣品濃度計算含量。第八頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一第九頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一六、思考題1、根據(jù)樣品液多糖含量，計算實驗一中多糖的提取率。2、根據(jù)蒽酮測糖原理，設計測定化合物中淀粉量的方案。第十頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一注意事項：加樣要求準確。第十一頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一實驗三豬胃粘膜中提取胃膜素、胃酶第十二頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一一、實驗目的學習從豬胃粘膜中提取胃膜素、胃酶的原理和方法，了解有機溶劑分級沉淀法的應用。第十三頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一二、簡介胃膜素：功效：一種以黏蛋白為主要成分的生物活性藥物，有極強的黏附作用，可直接作用于消化道內(nèi)壁，在胃及十二指腸潰瘍面形成一層保護膜，減少胃酸對它的刺激，利于潰瘍面的愈合；另一方面有潤滑作用，使進入消化道的食物易于在消化道內(nèi)移行，有利于減少某些物質對潰瘍面的刺激。胃膜素臨床上用于胃及十二指腸潰瘍。性質描述:淡黃色或淡灰色粉末，或微小顆粒。著水脹為粘漿。顯微溶狀態(tài)，略帶類蛋白胨臭。具有很強的粘附力。第十四頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一胃蛋白酶：存在于動物胃液中，以無活性的胃蛋白酶原形式，存在于胃底的主細胞中，在酸性條件下，胃蛋白酶原變化成有消化蛋白質能力的胃蛋白酶。在醫(yī)學上主要用于治療消化不良、食欲不振、慢性胃炎等，工業(yè)上可作水解蛋白用。干燥的胃蛋白酶為白色或淡黃色粉末，引濕性強，易溶于水；對熱較穩(wěn)定，100℃10min不破壞。水溶液中，70℃以上破壞。第十五頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一三、實驗原理胃粘膜一般指胃底粘膜，分泌胃液的主細胞集中在胃底粘膜，呈暗紅色，直徑約10-12厘米圓塊，約100g。胃膜素是從豬胃粘膜經(jīng)胃蛋白酶和鹽酸消化后的上層液中，60%左右的乙醇所沉淀的部分。蛋白質、酶等極性物質的水溶液加入與水混溶的有機溶劑，可沉淀析出。第十六頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一四、儀器、試劑與藥品水浴鍋，攪拌器，冰箱，真空干燥，鹽酸，氯仿，丙酮，乙醇，離心機等。第十七頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一四、實驗操作1.激活提取豬胃粘膜0.55Kg（5只豬肚）+水約220ml升（胃粘膜的40%），用1：1鹽酸調(diào)pH2.5-3.0，45-50℃攪拌提取3h(在攪拌的過程中需注意不停的調(diào)節(jié)pH)。2.脫脂分層雙層紗布過濾，冷卻至室溫，緩慢加入約55ml氯仿（胃粘膜的10%），攪拌2h，室溫靜置24h后，放掉底層的氯仿和雜質，上清液預冷至5℃以下第十八頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一3.胃膜素分離上清液在攪拌下（同一方向，否則胃膜素會散開）緩緩加入預冷至5℃以下的丙酮（γ=0.708）至比重約0.97，撈出胃膜素，以適量的75%乙醇洗兩次，真空干燥。4.胃酶的沉淀母液再加丙酮至比重約0.91，有黃色沉淀產(chǎn)生，離心（4℃,

7000rpm,10min)取沉淀，70℃以下真空干燥。第十九頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一實驗四胃蛋白酶活力的測定第二十頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一一、實驗目的學習和掌握以牛血紅蛋白為底物的胃蛋白酶活力測定的原理和方法，掌握紫外分光光度計的使用。第二十一頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一二、實驗原理胃蛋白酶能催化水解芳香環(huán)氨基酸連接的肽鍵。在一定條件下，可定量催化水解牛血紅蛋白產(chǎn)生不被三氯醋酸（TCA）所沉淀的酚基氨基酸（如酪氨酸）。酪氨酸在275nm波長處有最大吸收，以酪氨酸為對照，可以求出胃蛋白酶活力。第二十二頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一三、儀器、試劑與藥品水浴鍋，紫外分光光度計，酪氨基，鹽酸，三氯醋酸，牛血紅蛋白等。第二十三頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一四、實驗操作1、對照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的酪氨酸適量，加鹽酸溶液〔取1mol/l鹽酸溶液65ml，加水至1,000ml〕制成每1ml中含0.5mg的溶液，搖勻，備用。2、供試品溶液的制備：精密稱取實驗三提取的胃酶干粉40-60mg，用上述鹽酸溶液制成每1ml中約含0.2～0.4U的溶液。（稱本品（一般3500U/g以上）40-60mg，用上述鹽酸溶液定容至100ml，再取5ml用上述鹽酸溶液定容至50ml，即0.04-0.06mg/ml）。第二十四頁，共二十六頁，編輯于2023年，星期一3、測定方法：取試管6支，其中3支各精密加入對照品溶液1ml，另3支各精密加入供試品溶液1ml，置37±0.5℃水浴中，保溫5分鐘，精密加入預熱至37±0.5℃的牛血紅蛋白試液5ml，搖勻，并準確計時，在37±0.5℃水浴中反應10分鐘。立即精密加入5%三氯醋酸溶液5ml，搖勻，過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液備用。另取試管2支，各精密加入血紅蛋白試液5ml，置37±0.5℃水浴中保溫10分鐘，再精密加入5％三氯醋酸溶液5ml，其中1支加供試品溶液1ml，另1支加對照樣品鹽酸溶液1ml，搖勻，過濾，棄初濾液，取續(xù)濾液，分別作為供試品和對照品的空白對照，按照分光光度法在275nm的波長處測定吸收度，算出平均值ＡS和Ａ，按下式計算。Ａ×Ｗｓ×ｎ每g含蛋白酶活力單位數(shù)＝───────────Ａs×Ｗ×10×181.19式中：ＡS為對照品的平均吸收度；Ａ為供試