Mozzarella干酪成熟中蛋白水解及功能特性的變化

-.zMozzarella干酪成熟中蛋白水解與功能特性的變化摘要:為控制干酪的質(zhì)量,對Mozzarella干酪成熟過程中蛋白質(zhì)的水解(測定SDS凝膠電泳和可溶性氮)和未融化干酪的質(zhì)構(gòu)變化以及融化干酪功能特性變化進(jìn)展了研究,干酪成熟過程中由于凝乳酶和乳酸菌酶的作用使蛋白水解,從而使pH4.6可溶性氮(SN)和12%TCASN逐漸增加;凝乳酶主要影響酪蛋白的水解范圍,乳酸菌及其酶,不但影響酪蛋白的水解范圍,而且主要影響酪蛋白的水解深度。干酪中的殘留凝乳酶和乳酸菌酶使酪蛋白水解為大分子量的肽段,而乳酸菌酶還可將大分子量的肽段進(jìn)一步降解為小分子量的肽段和游離氨基酸。由于酪蛋白的水解,使干酪的硬度和彈性下降,融化性和油脂析出性增加,隨著小分子量肽和游離氨基酸的增加,干酪的褐變性提高。關(guān)鍵詞:Mozzarella干酪;蛋白水解;功能特性0引言Mozzarella干酪是PastaFilata(帕斯特-費拉特)干酪中的重要成員,其成熟過程中,在殘留的凝乳酶、乳中的胞漿素和發(fā)酵劑乳酸菌的共同作用下,干酪中的蛋白質(zhì)和脂肪(主要是蛋白質(zhì))發(fā)生降解[1]。在加工干酪時的乳清排出階段,大局部凝乳酶隨乳清流失,而在熱燙拉伸階段,一局部凝乳酶要失活,盡管如此,仍有一些凝乳酶殘留在干酪中。在Mozzarella加工中使用的嗜熱發(fā)酵劑,由于有蛋白和脂肪的包裹,大局部菌在熱燙拉伸之后也不會死亡,所以在干酪的成熟過程中會繼續(xù)繁殖,菌體自溶后胞內(nèi)酶釋放出來,使酪蛋白發(fā)生水解。據(jù)Mcmahon報道,由于蛋白質(zhì)的降解,會造成蛋白膠束構(gòu)造的變化,進(jìn)而影響干酪的質(zhì)構(gòu)和功能特性。國外對不同工藝參數(shù)、不同的凝乳酶、不同的菌種在Mozzarella干酪成熟過程中的蛋白水解進(jìn)展了系統(tǒng)研究,對控制該種干酪的質(zhì)量和貯藏穩(wěn)定性提供了理論指導(dǎo)。中國對Mozzarella干酪的研究剛剛起步,對這種干酪成熟過程中蛋白質(zhì)水解規(guī)律的研究還未見報道,本文以中國黑白花牛乳為原料,采用無鹽漬新工藝制得的新型Mozzarella為材料,研究Mozzarella干酪在成熟過程中蛋白質(zhì)的水解特點和未融化干酪的質(zhì)構(gòu)變化、融化干酪功能特性的變化及其相互間的關(guān)系,并設(shè)計試驗?zāi)Ｐ?模擬干酪),以期將凝乳酶和乳酸菌對干酪成熟的作用區(qū)分開來,對于說明Mozzarella干酪的成熟規(guī)律,生產(chǎn)適合中國人口味的Mozzarella干酪,控制干酪的質(zhì)量具有重要的意義。1材料與方法1.1試驗材料1)原料乳:新鮮牛乳,來源于中國農(nóng)科院畜牧所,密度1.030g/mL,干物質(zhì)含量11.05%,蛋白質(zhì)含量3.03%,酪蛋白含量2.27%,將脂肪標(biāo)準(zhǔn)化至3.0%,使C/F(酪蛋白:脂肪)=0.76。2)乳酸菌種:唾液鏈球菌嗜熱亞種(Streptococcussalivariussubsp.Thermophilus)CH9,保加利亞德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckilsubsp.Bulgaricus)LB,來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)畜產(chǎn)品實驗室。3)凝乳酶:Stami*1150(CHRHANSEN生產(chǎn),活力為35000U/g)。1.2主要試劑及儀器pH4.6醋酸鹽緩沖溶液,12%TCA溶液。干酪加工設(shè)備:自制圓桶形干酪槽(容量50kg),干酪刀,帶軋輥的干酪拉伸設(shè)備;質(zhì)構(gòu)儀(StevensQts25MaterialsEvalutionSystem,美國);穩(wěn)壓穩(wěn)流定時電泳儀(DYY-Ⅲ型,六一儀器廠);電泳槽(BIOCRAFTBE-210N型,日本);全自動色差計(PC-PIIG型,奧依克儀器公司);Petri氏培養(yǎng)皿;9cm定量濾紙;半微量凱氏定氮儀(天長市滬試儀器公司);萬分之一電子天平(1602MP8-1型,德國);電子天平(MP200B型,**精細(xì)科學(xué)儀器公司)。1.3測定方法干酪的融化性用改良的Schreiber試驗法測定干酪的融化性,方法為:用特制打孔器順著干酪纖維方向取圓柱的干酪樣品,其直徑為17.6mm,厚7mm。將樣品放置于預(yù)先鋪有濾紙的直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi),在室溫下回復(fù)溫度30min,然后將其放入預(yù)熱至100℃的烘箱內(nèi),加熱1h取出,在室溫下回復(fù)30min,測定融化干酪的直徑,測4個值,準(zhǔn)確到0.1mm,計算平均數(shù),表示干酪的融化性。干酪的油脂析出性傳統(tǒng)的脂肪滲漏法經(jīng)改良用于油脂析出性的測定,方法為:用特制打孔器順著干酪纖維方向取圓柱的干酪樣品,其直徑為17.6mm,厚7mm。將樣品放置于預(yù)先鋪有濾紙的直徑9cm的培養(yǎng)皿內(nèi),在室溫下回復(fù)溫度30min,然后將其放入預(yù)熱至100℃的烘箱內(nèi),加熱1h取出,在室溫下回復(fù)30min,油圈形成,測定油圈的直徑,測4個值,準(zhǔn)確到0.1mm,計算平均數(shù),表示干酪的油脂析出性。未融化干酪的色澤去掉干酪的包裝后,立即用色差計進(jìn)展測定,用亨特系數(shù)表示,以標(biāo)準(zhǔn)白板為標(biāo)準(zhǔn),測定反射色,同一樣品測3個點,求平均值。以L表示亮度,L=100為白,L=0為暗;L值越大,色澤越白。a>0表示紅色程度,a<0表示綠色程度;b>0表示黃色程度,b<0表示藍(lán)色程度。干酪加熱色澤試驗粉碎的干酪放入Φ25×150mm的試管內(nèi),在沸水中水浴60min,使用色差計以L、a、b為測色模型,試管的底部被夾緊與測光頭密合。每個試管有8個數(shù)據(jù)被讀取,每旋轉(zhuǎn)45°讀取一個數(shù)據(jù),取其平均值[6]。SDS凝膠電泳參照Yun的方法,經(jīng)改良而得[7]。10mg干酪參加0.5mL樣品處理液中(含有20%甘油、0.2%SDS、0.063mol/LTris-HCl(pH6.8)、6mol/L尿素),再加20μLβ-巰基乙醇(2-ME)和20μL飽和溴酚蘭溶液,定容到1mL。濃縮膠和別離膠分別用0.125mol/LTris-HCl(pH6.8)和0.38mol/LTrisHCl(pH8.8)進(jìn)展配制,均含有0.1%SDS。濃縮膠濃度4%,別離膠濃度12.5%。電泳緩沖液含有0.025mol/LTris,0.192mol/L甘氨酸,0.1%SDS。上樣量5μL。濃縮膠局部電流15mA,別離膠局部電流25mA。電泳完畢后,將膠片固定4h(固定液33%甲醇和12%TCA),染色3h(考馬斯亮蘭G-250染色液含有0.9g考馬斯亮蘭,1mol/L硫酸,10mol/LNaOH,12%TCA)。1.3.6pH4.6SN(SolubleNitrogen可溶性氮)測定準(zhǔn)確稱取0.75g干酪,參加25mLpH4.6的醋酸鹽緩沖液,將干酪充分磨碎,再用25mL的緩沖液充分沖洗,懸浮液在4000r/min的離心機(jī)中離心20min,取上清液定量地移入凱氏消化瓶,進(jìn)展半微量凱氏定氮,并以占干酪總氮量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。1.3.712%TCASN測定準(zhǔn)確稱取1.5g干酪,參加25mL12%TCA溶液,將干酪充分磨碎,再用20mL的緩沖液充分沖洗,懸浮液在4000r/min的離心機(jī)中離心20min,取上清液定量地移入凱氏消化瓶,進(jìn)展半微量凱氏定氮,并以占干酪總氮量的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示。1.4干酪的準(zhǔn)備Mozzarella干酪的加工方法:原料乳→過濾→標(biāo)準(zhǔn)化(C/F=0.76)→巴氏殺菌(63℃,30min)→冷卻(36℃)→加發(fā)酵劑(0.5%)→預(yù)酸化(21°T)→加凝乳酶→凝乳→切割→加熱收縮(38℃)→排乳清→堆釀(pH5.25)→粉碎加鹽→熱燙、拉伸(58℃)→成型→冷卻→真空包裝→成熟(4℃)1.5試驗?zāi)Ｐ?模擬干酪)的制作原料乳的殺菌方法與上述方法一樣,然后用0.1mol/L的鹽酸將牛乳的滴定酸度調(diào)整為22°T,其余步驟與上述干酪加工方法一樣,在凝塊堆疊階段,將凝塊切碎,分次參加5%的乳酸,直到凝塊的pH值到達(dá)5.25,以后的加工方法同上。2結(jié)果與分析2.1Mozzarella干酪和模擬干酪成熟過程中SN變化分別取Mozzarella干酪和模擬干酪在成熟0、10、20、30、40、50d的干酪樣品,測定其pH4.6SN和12%TCASN,結(jié)果如圖1、圖2所示。分析Mozzarella干酪與模擬干酪成熟過程中pH4.6SN和12%TCASN含量變化趨勢圖可以看出,無論是Mozzarella干酪還是模擬干酪,在整個成熟過程中pH4.6SN和12%TCASN都隨著成熟時間的延長而逐漸增加,但Mozzarella干酪中的變化幅較大,說明乳酸菌對干酪中蛋白質(zhì)的水解起著重要的作用。在模擬干酪中由于只有非發(fā)酵劑乳酸菌和其他污染的雜菌(數(shù)量很少),所以乳酸菌酶對蛋白的分解程度非常小。而在Mozzarella干酪中,12%TCASN隨成熟時間的延長逐漸增加,且變化范圍較大,這是由于乳酸菌釋放的胞內(nèi)蛋白酶作用形成的。一般認(rèn)為pH4.6SN表示蛋白水解的廣度,而12%TCASN表示蛋白水解的深度。在Mozzarella干酪中pH4.6SN和12%TCASN隨著時間的延長逐漸增高,而且pH4.6SN的增長速度比12%TCASN快,這與Yun和Thunell等人的研究結(jié)果是一致的。2.2Mozzarella干酪和模擬干酪成熟中SDS凝膠電泳Mozzarella干酪和模擬干酪在50d成熟中SDS凝膠電泳圖見圖3、圖4。從圖3可以看出Zone1和Zone2是凝膠中主要的電泳帶,位于凝膠的上方。Zone1包含αS1-和αS2-酪蛋白,Zone2主要包含β-酪蛋白,Zone3包含副κ-酪蛋白,在牛乳中存在κ-酪蛋白,而在干酪中主要是副κ-酪蛋白。αS-酪蛋白和β-酪蛋白的水解片段處在Zone2和Zone3之間以及Zone3以下。從Mozzarella電泳圖可以看出,在Zone3以下的小分子量的快速遷移肽隨時間逐漸增多,而Zone2和Zone3之間的大分子量的快速遷移肽增加不明顯,這是由于乳酸菌發(fā)酵劑的菌酶將大分子量的快速遷移肽及時地進(jìn)一步水解為小分子量的快速遷移肽的結(jié)果。從模擬干酪的電泳圖(圖4)可見,在Zone3以下的小分子量快速遷移肽幾乎沒有變化,而位于Zone2和Zone3之間的大分子量的快速遷移增加很明顯,說明只有凝乳酶將酪蛋白水解為大分子量的快速遷移肽,由于沒有乳酸菌繼續(xù)將大分子量肽降解,所以造成酪蛋白水解物(大分子量肽)的積累。根據(jù)酶促反響的動力學(xué)平衡,這種積累影響了凝乳酶對干酪酪蛋白的水解,所以模擬干酪中pH4.6SN的上升速度沒有Mozzarella干酪中快。在牛乳的泳道中存在κ-酪蛋白,而在制成干酪以后,其中的κ-酪蛋白在凝乳酶的作用下水解為副κ-酪蛋白,使其分子量減小,所以電泳帶向下移動。2.3未融化干酪的質(zhì)構(gòu)變化未融化干酪的質(zhì)構(gòu)特性用干酪的TPA硬度(te*tureprofileanalysis,TPAhardness)、TPA彈性(TPAspringness)和TPA粘彈性(TPAcohesiveness)來表示,分別重復(fù)測定3次,取平均值。測定結(jié)果制成的曲線圖如圖5,圖6和圖7所示。從圖5、圖6、圖7可以看出,隨著成熟時間的延長,干酪的TPA硬度呈快速下降趨勢;而TPA彈性總體上也是呈下降的趨勢,但在成熟的前15d之內(nèi)下降速度較慢,在15～30d這段時間下降速度最為明顯,其后TPA彈性穩(wěn)定在一定的水平。TPA粘彈性則表現(xiàn)為先下降,后上升的趨勢,在成熟的前30d之內(nèi),TPA粘彈性呈下降的趨勢,在前15d下降速度較慢,在15～30d之間,呈快速下降趨勢,在成熟的后一段時間,TPA粘彈性隨著成熟時間的延長逐漸增大。未融化Mozzarella干酪的質(zhì)構(gòu)的變化與干酪成熟中的蛋白水解有關(guān)。Micketts和Olson發(fā)現(xiàn)在貯藏6周以后干酪的硬度增加,可能與干酪中的自由水進(jìn)入Mozzarella干酪的纖維構(gòu)造中并與蛋白膠束結(jié)合有關(guān)。在本文研究中,由于采用干鹽法所以干酪具有均勻的構(gòu)造,而且制成的干酪使用真空包裝密封在塑料袋內(nèi),防止了水分的蒸發(fā),另一方面干酪本身的含水量也較高,所以自由水對TPA硬度的影響不大。這種Mozzarella干酪在貯藏過程中的軟化,在其他的研究中也有發(fā)現(xiàn)。TPA彈性在整個成熟期間有一定程度的下降,這是由于蛋白質(zhì)的水解,使蛋白質(zhì)膠束構(gòu)造變得薄弱的原因。但在Mozzarella干酪中蛋白水解程度十分有限,所以干酪的彈性僅有微小的下降,這與Renda等人的研究結(jié)果是一致的。TPA粘彈性表示用質(zhì)構(gòu)儀測量干酪時,第二次壓縮所作的功與第一次壓縮所作的功之比。Mozzarella干酪的粘彈性在干酪成熟的初期逐漸下降,可能是由于干酪中蛋白膠束構(gòu)造逐漸變得脆弱,干酪在壓縮之后回復(fù)性變差的結(jié)果。在干酪成熟的后期,由于干酪中的自由水進(jìn)入蛋白膠束之間,變成不易流動的水,使蛋白分子之間的氫鍵和范德華力增強(qiáng),使干酪的壓縮回復(fù)性得到一定程度的改善,所以干酪的TPA粘彈性又有所提高。關(guān)于這一點,還有待實驗的進(jìn)一步證實。2.4未融化干酪的色澤變化在Mozzarella干酪的成熟過程中,L值(Lvalue)隨著成熟時間的延長,呈逐漸下降的趨勢,說明干酪的白度在下降;而與此同時,b值在成熟的前10d內(nèi)呈下降趨勢,在10～40d之間,b值根本穩(wěn)定在一定的水平,在成熟的后期,b值有逐漸上升的趨勢。未融化干酪的L值逐漸下降,是因為在干酪成熟時,蛋白水解使膠束構(gòu)造變得脆弱,干酪對光的反射和散射作用減弱,并使蛋白膠束包裹的脂肪滲透出來,由于脂肪中溶解有脂溶性色素,所以干酪的白度下降。在Mozzarella干酪成熟的初期,b值有所下降;隨著成熟時間的延長,b值有所提高。這種變化趨勢與Michael的結(jié)果相一致。這可能是由于在成熟的初期,脂肪和蛋白質(zhì)之間的相互作用,使干酪的質(zhì)地較為均勻,所以黃度有所下降,但隨著成熟時間的進(jìn)展、蛋白質(zhì)的水解,脂肪逐漸從酪蛋白的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造中釋放出來,使干酪的b值逐漸提高。2.5融化干酪的功能特性Mozzarella干酪的融化特性包括許多指標(biāo),其中最重要的是干酪的融化性、油脂析出性和干酪在加熱時的褐變性,這些特性與Mozzarella干酪作為Pizza(比薩)配料和再制干酪原料的加熱特性有關(guān)。根據(jù)實驗結(jié)果制成的干酪融化性、油脂析出性和加熱時的色澤變化曲線如圖10、圖11和圖12所示。從圖10可以看出,Mozzarella干酪的融化性,隨著成熟時間的延長呈上升趨勢,在成熟的前20d,上升較明顯,在成熟的后期,干酪的融化性有所增加,但速度變慢。在Mozzarella干酪的成熟過程中,干酪的融化性隨著成熟時間的延長而逐漸提高,這與Yun等人的研究結(jié)果是一致的。這與干酪在成熟過程中的蛋白水解有關(guān),在成熟過程中αS1-、β-酪蛋白在凝乳酶和乳酸菌酶的共同作用下,肽鍵發(fā)生斷裂,削弱了蛋白膠束之間的連接,在加熱的情況下,蛋白的熵變小,分子之間流動所需的能量變小,所以干酪的融化性逐漸增大。從圖11可以看出,Mozzarella干酪的油脂析出性隨著成熟時間的延長,呈逐漸上升的趨勢,在成熟的前30d,上升速度較快,而后期干酪的油脂析出性根本穩(wěn)定在一定的水平。由于蛋白質(zhì)的水解,蛋白膠束的構(gòu)造變?nèi)?膠