多糖提取的相關(guān)操作

DEAE柱：準(zhǔn)備柱子：洗柱：洗滌劑、自來水、去離子水，洗至不掛水珠、水不成股下流。浸泡濾膜：95%酒精，浸泡柱上下濾膜（包括膠圈）至少30min，時(shí)間可延長（5h左右），主要作用是脫去脂溶性雜質(zhì)。每次柱使用完畢后都要做此步驟。洗布氏漏斗：用10%HCL抽濾，后用蒸餾水洗滌，去除濾膜板中可能灰塵。裝柱：鐵夾夾緊對齊，裝完柱后要檢查是否漏水。準(zhǔn)備填料：（再生步驟）DM過酸過堿：0.2M/LHCL和NaOH浸泡填料，先堿后酸，從加入堿時(shí)開始計(jì)時(shí)，一般為30min，加入時(shí)用玻棒攪動(dòng)，以防與堿作用不充分。但若是新填料，浸泡20min后即可使用。堿對填料有影響，忌浸泡時(shí)間超過30min，一般20min即可。入堿后，用去離子水（﹥2L，充分去除OH根離子）在布氏漏斗上過濾。脫水完全(洗2-3遍至中性)。后浸泡酸。重生方法同上。脫氣：先溶解DM，再倒入抽濾瓶，真空抽濾，至無白沫，可時(shí)而搖晃，抽至無白沫無氣泡。重要，最好能延長脫氣時(shí)間。上柱：傾倒填料時(shí)濃度盡量稀，使填料貼壁下流。靜止。待填料沉降，吸出上清液，統(tǒng)一收集，反復(fù)此操作，盡可能回收填料。（盡量不起氣泡）沉降一段時(shí)間后，待上清未完全沉降時(shí)倒入尚未倒完的膠，防止多次傾倒引起的分層現(xiàn)象。此時(shí)，用夾子夾住軟管，使其不漏液，待沉降完全，出現(xiàn)清水層，去除夾子，滴液。平衡：若上柱平衡后暫時(shí)不上樣，可隔一天平衡一次，防止長菌。滴數(shù)：三秒1滴，20分鐘收集一管約10ml，33小時(shí)過柱一體積。水層不能滴干，防止膠出現(xiàn)干裂現(xiàn)象。檢驗(yàn)：用1MAgNO3檢驗(yàn)過柱水中Cl離子是否洗凈，至無Cl離子后再過一柱體積。皆用去離子水。上樣：上樣前樣品水溶，離心，先取上清，收集保留不溶物。粗柱子：DEAE量占柱體積80%高度（標(biāo)記高度，要有足夠的塔板數(shù)），上8克樣。上樣步驟：先將螺旋擰開，用夾子夾緊軟管，放在液面以上，使其液面不下降。取出上層流動(dòng)相，使液面與填料面相切，用移液管加樣，加樣使盡量靠近填料，貼著柱子壁轉(zhuǎn)一圈，均勻加樣。加完后用流動(dòng)相洗一下殘留在壁上的樣品。松開夾子，使其滴液，待樣品吸附上填料后，夾緊夾子，放在液面以上，在柱子內(nèi)加入一段流動(dòng)相，擰上螺旋，開始走樣。流速：六秒一滴。流動(dòng)相：視多糖的實(shí)際情況而定。硫酸苯酚法測多糖：先確定樣品出現(xiàn)的管數(shù)，確定頭和尾后，三管一測。方法：100微升樣品，400微升5%苯酚(槍頭)，2ml濃硫酸(移液管)。振蕩后靜置1小時(shí)。490nm處測量。試劑的配置：苯酚沸水浴溶解，制備5%溶液500ml備用。收集：旋蒸：收集到一定量后，進(jìn)行旋蒸，濃縮至10ml內(nèi)。透析：透析袋的準(zhǔn)備：剪20cm左右透析袋，燒杯中沸煮5分鐘后用蒸餾水60℃沖洗2分鐘，4℃待用。使用后用蒸餾水或者加0.05%-0.1%的疊氮鈉的蒸餾水保存，每次使用之前都用水清洗、沸煮。（非即用型）透析袋的選擇：一般根據(jù)所得的糖的分子大小來選擇透析袋，在未知的情況下使用孔徑最小的透析袋（截留分子量3000）。透析：加樣至透析袋的2/3，兩頭用夾子夾住，純水透析，一小時(shí)換一次水，4至5次。過夜。11、再次濃縮至高度少于1cm，凍干。二、G100柱：1、G100的準(zhǔn)備：（1）先確定裝柱的體積，再確定裝柱的質(zhì)量，具體換算公式為：1克凝膠吸水10ml*10倍即100（G100型號判定）。（2）將膠泡在將膠泡在超純水，3天，多放點(diǎn)水，要換水去雜質(zhì)。（新膠）（3）脫氣。2、裝柱：（1）將膠混勻裝柱，不可起泡，倒入裝柱，玻棒引流。最好是邊輕輕攪動(dòng)邊倒膠。（2）沉降，接恒流泵，平衡流速極慢。平衡至膠的高度不變。3、流速：上樣后流速50分鐘6ml。4、流動(dòng)相：萬分之一的NaN3，其他視實(shí)驗(yàn)要求而定。5、當(dāng)柱子壓力變大，流速自動(dòng)變慢后，可倒流沖洗，流速可快一點(diǎn)。6、上樣：110mg左右，溶至1ml，震蕩漩渦器充分溶解，上樣之前過濾。上樣時(shí)，取出膠面上層的清夜，將樣品貼在柱子內(nèi)側(cè)成圈狀加樣，越靠近膠面越好，殘留在柱子上的樣品越少越好。少量流動(dòng)相清洗柱子壁。待樣品都吸附在膠上，加上上清流動(dòng)相，開始走樣。7、檢測方法：50ul樣+1ml5%苯酚（配制苯酚時(shí)，所有容器預(yù)熱）+2ml濃硫酸，室溫后測量。490nm。收集到一定量后，濃縮至10ml以內(nèi)。8、透析：加樣至透析袋的2/3，純水透析，一小時(shí)換一次水，4至5次。過夜。用最小截留分子量的透析袋。透析袋分即用型和非即用型，即用型用蒸餾水沖洗后直接使用，無需前處理。非即用根據(jù)說明書進(jìn)行前處理，比較常見的處理方法為：用沸水煮五至十分鐘，再用蒸餾水洗凈。使用時(shí)，一端用透析夾夾緊，由另一端灌滿水，用手指稍加壓，檢查不漏，方可裝入待透析液，通常要留三分之一至一半的空間，以防透析過程中，透析的小分子量較大時(shí)，袋外的水和緩沖液過量進(jìn)入袋內(nèi)將袋漲破。含鹽量很高的蛋白質(zhì)溶液透析過夜時(shí)，體積增加50％是正常的。為了加快透析速度，除多次更換透析液外，還可使用磁子攪拌。透析的容器要大一些，可以使用大燒杯。小量體積溶液的透析，可在袋內(nèi)放玻璃棒，以使透析袋沉入液面以下。使用時(shí)需戴手套。使用后的透析袋洗凈后可存于4℃蒸餾水中，若長時(shí)間不用，可加少量NaN3，以防長菌。一旦已呈濕狀即不可再完全干躁。9、再濃縮：濃縮后的量越少越好，液體的厚度不要超過1cm。10、凍干。三、蛋白檢測：考馬斯亮藍(lán)法測蛋白：1、考馬斯亮藍(lán)染色液的配制：準(zhǔn)確稱取100mgCBB，溶于50ml95%乙醇溶液中，與100ml85%磷酸（W/V）混合，加水至1000ml。充分溶解去固體。2、標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的配制：已知濃度的蛋白溶液（BSA），用生理鹽水配制成100ug/ml蛋白溶液。制成母液。3、標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定：試管編號0123456100ug/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白（ml）0.00.10.20.30.40.50.60.15mol/LNaCl（ml）10.90.80.70.60.50.4考馬斯亮藍(lán)試劑（ml）5555555搖勻，室溫放置5min，以0號管為空白對照，在595nm處比色。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。4、樣品的測定：四、分子量測定：HPLC色譜儀由BeckmanCoulterSystemGold508自動(dòng)進(jìn)樣器，Gold126gradientHPLC泵及Sedex75ELSD檢測器構(gòu)成；色譜柱為TSK-GELG4000PW（XL）。流動(dòng)相為0.003mol/LNH4AC，流速0.5mL/min，樣品溶于流動(dòng)相中，濃度為0.2%（w/v），進(jìn)樣量10μ五、GC-MS前處理：1、判斷多糖極性：取樣品2mg，溶于4mL2mol/LTFA中，110℃下封管水解1.8h，加甲醇反復(fù)減蒸發(fā)縮至干，以完全去除TFA。水解產(chǎn)物溶于0.2mL水中，取5μL進(jìn)行TLC分析。展開劑系統(tǒng)為乙酸乙酯：吡啶：冰乙酸：水=5：5：1：3（v/v），展開距離為8cm。待溶劑揮干后，用苯胺-鄰苯二甲酸試劑（將1.6g鄰苯二甲酸溶于100mL水飽和正丁醇中，加入0.9mL苯胺。）顯色。用該試劑噴霧后，于1052、中性多糖：TFA水解產(chǎn)物溶于2mLH2O中，加入25mgNaBH4，室溫下還原2h，間歇振蕩，用乙酸中和至無氣泡產(chǎn)生，反復(fù)加甲醇減壓蒸發(fā)至完全干燥。于100℃下干燥15min，加入2mL乙酸酐（可多加些），100℃反應(yīng)1h。反復(fù)加甲苯減壓蒸發(fā)除去乙酸酐（蒸干徹底），產(chǎn)物經(jīng)氯仿萃取，水洗四次，氯仿層經(jīng)無水硫酸鈉干燥，濃縮至503、Conrad法：將15mg多糖樣品溶于10mL水中，加入N-環(huán)己基-N’-（2-N-甲基嗎啉代乙基）-碳二亞胺-對甲苯磺酸鹽300mg，磁力攪拌下滴加0.01mol/L的HCl，用自動(dòng)電位滴定儀使pH保持為4.75，維持2h。滴加2mol/L硼氫化鈉溶液（20mL），此時(shí)pH值急劇上升，須用4mol/L的HCl將pH控制在7.0，持續(xù)攪拌，控制硼氫化鈉溶液在45min內(nèi)加完，若反應(yīng)中生成大量泡沫，可滴加幾滴異戊醇消泡。加完后，在室溫下繼續(xù)反應(yīng)1h，滴加冰醋酸使pH為6.8。然后將反應(yīng)液對蒸餾水透析，內(nèi)液減壓濃縮至10mL，冷凍干燥。此反應(yīng)通常須進(jìn)行2-3次，取少量樣品經(jīng)2mol/LTFA完全水解后進(jìn)行TLC分析以確定是否完全還原。4、酸性多糖：1）取一部分TFA水解產(chǎn)物按與中性多糖相同的方法進(jìn)行處理，測定其中中性糖基的組成；2）另取一部分多糖先用Conrad法[16]還原，再經(jīng)TLC法檢測還原是否完全。完全還原后的產(chǎn)物用中性多糖相同的方法進(jìn)行處理，然后進(jìn)行GC-MS分析。比較同一樣品還原前后的GC結(jié)果，若其中某一中性糖含量明顯增加，即可確定所含糖醛酸的種類及含量。步驟1）中水解時(shí)部分釋放的糖醛酸可能形成內(nèi)酯，經(jīng)硼氫化鈉還原為糖醇，從而導(dǎo)致GC測定時(shí)某些中性糖含量增加，因而由此計(jì)算出的糖醛酸含量通常偏低。5、注意事項(xiàng)：去水蒸干時(shí)，試劑可以多加一些，蒸干時(shí)要徹底。六、甲基化：取9mg樣品于反應(yīng)瓶中，置于盛有五氧化二磷的干燥器中真空干燥過夜。樣品溶于2mL無水二甲亞砜（經(jīng)4A分子篩干燥）中，加入粉末狀氫氧化鈉20mg左右，室溫下攪拌10min，后滴加碘甲烷2mL（可多加一些3ml），室溫下攪拌30min，<30℃減壓蒸發(fā)除去未反應(yīng)的碘甲烷，反應(yīng)液對蒸餾水透析，內(nèi)液減壓濃縮（蒸不出去可加點(diǎn)水共沸）后凍干。此過程重復(fù)4次后，取少量甲基化產(chǎn)物以五氧化二磷為干燥劑真空干燥24h，然后用石蠟?zāi)しǎ∟ujol）測定IR譜，以確定甲基化是否完全。完全甲基化的多糖，其IR譜中3400cm-1完全甲基化的多糖用90%的甲酸（2mL）于100℃加熱解聚4h，減壓蒸干，然后加入2mol/LTFA（3mL），于100℃下加熱水解6h，加甲醇反復(fù)減壓濃縮至干，以完全出去TFA。水解產(chǎn)物溶于2mLH2O中，加入25mgNaBH4，室溫下還原3h，間歇振蕩，后用乙酸調(diào)pH至5左右，加入2mL甲醇及一滴乙酸，減壓蒸干，重復(fù)三次使硼氫化鈉完全分解，并轉(zhuǎn)化為乙酸鈉。100℃注意：碘甲烷為危險(xiǎn)試劑，操作中小心。所有甲基化操作的試劑和儀器要干燥過夜，干燥罐口多抹一點(diǎn)凡士林，保持密封。七、紅外光譜分析：α、β構(gòu)象分析：取1mg樣品，KBr壓片，于4000—500cm-1進(jìn)行紅外掃描。甲基化產(chǎn)物采用石蠟?zāi)浩?。八、核磁共振分析：取樣?0mg，溶于0.5mLD2O中，置于Φ5mm核磁管中，于室溫下測定。九、硫酸化：氯磺酸-吡啶法：分別取50mg樣品加入5mL甲酰胺，室溫下磁力攪拌15min，加入1.33mL吡啶，然后逐滴加入0.67mL氯磺酸，室溫下攪拌2h。反應(yīng)液于40℃下保溫4h，之后加入10mL甲醇，最后用2.5mol/LNaOH調(diào)節(jié)PH至7.0注意：氯磺酸為危險(xiǎn)試劑，最好在通風(fēng)櫥中操作，操作小心。滴加時(shí)用槍滴加，每次加樣少量。否則容易爆炸。十、硫酸基含量的測定：氯化鋇-明膠法：試劑配制：（1）1mol/LHCl溶液：取8.3mL濃鹽酸（12M）加水定容至100mL。（2）氯化鋇-明膠試劑：取1.25g明膠溶于50mL水中，加熱溶解，定容至250mL。取200mL此溶液，加入2g氯化鋇，溶解后靜置4h，離心除去沉淀，4℃（3）3%三氯乙酸溶液（w/v）：將3g三氯乙酸溶于水中，加水定容至100mL。（4）標(biāo)準(zhǔn)硫酸基溶液：精確稱取88mg無水硫酸鈉，用1mol/LHCl溶液定容至100mL。測定方法：標(biāo)準(zhǔn)曲線測定：精確