常用液相色譜柱原理及使用與維護保養(yǎng)

關于常用液相色譜柱原理及使用與維護保養(yǎng)第一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一1.2液相色譜柱的結構及其主要功能

液相色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲（封頭）與柱填料等組成。柱管：多用不銹鋼制成，若果使用時柱壓不高于70kg/cm2時，也可采用厚壁玻璃或石英管，管內(nèi)壁要求有很高的光潔度。用于柱填料的裝填。壓帽：即色譜柱兩端套合于柱管端外壁的塑性圓柱帽，中部有小孔，多為聚四氟乙烯制成，用于固定篩板。密封環(huán)：位于接頭螺旋環(huán)內(nèi)壁的彈性環(huán)，多為聚四氟乙烯制成，用于色譜柱兩端壓帽與柱外壁的密封。

第二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一1.3液相色譜柱的分類與應用范圍

分類方法很多，可按鍵合相類型、用途（分析型與制備型）、基質(zhì)種類等進行分類。1.3.1硅膠基質(zhì)柱（4大類）目前，分析型液相色譜柱多為硅膠基質(zhì)柱，細分為：高純硅膠柱：以高純度硅烷化硅膠（Silica）為填料，應用范圍較廣，但只能在PH2.0-7.5，小于60度的條件下使用。又由于強極性硅羥基（Si-OH)的次級保留效應較強，所以應用受到局限，已被鍵合相柱所取代。反相硅膠柱：是以硅烷化硅膠為基質(zhì)，表面鍵合弱極性官能團的固定相。目前多用C18（ODS）、C8（MOS）、C4（B）、C6H5（phenyl，苯基）等。用于分離大多數(shù)有機化合物，應用范圍最廣。第三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一正相硅膠柱：是以硅烷化硅膠為基質(zhì)，表面鍵合極性官能團的固定相。目前較多的為：NH2—（氨基）、CN—（氰基）、DIOL（二羥基，也常做HILIC單獨分類列出，多用于分離有機酸、蛋白質(zhì)等）。多用于分離光學異構體和反相柱子不能分離的極性比較大的物質(zhì)

。離子交換柱：是以硅烷化硅膠為基質(zhì)，以磺化交聯(lián)鍵合強陽/陰離子基團（磺酸鹽/季銨堿）的固定相，又分為強酸性、強堿性、弱酸性、弱堿性等不同規(guī)格。用于分離解離性較強的有機鹽類化合物。（注意：不要同離子色譜混淆，離子色譜主要是分離無機鹽類化合物或某些帶點離子。）第四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

1.3.2聚合物基質(zhì)柱

聚合物基質(zhì)柱是指采用聚苯乙烯—二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸脂、多孔性微球蛋白等聚合物凝膠作為主要填料的一類色譜柱。其相對于硅膠柱具有更強的疏水性及更寬泛的pH范圍（1.0～14.0），但柱效較低，目前主要應用于凝膠滲透色譜（GPC）、凝膠過濾色譜（GFC）及分子排阻色譜（MEC）。主要用于分離蛋白質(zhì)類等大分子化合物。1.3.3其他無機物填料柱

這類色譜柱僅限于特殊用途，主要有石墨化碳、氧化鋁（Al2O3）、氧化鋯（ZrO2）等填料。不需要進行表面改性，其自身表面即可對各類化合物有強保留?？稍谌我鈖H（氧化鋁除外，不能大于12.0）及高溫度（可達100℃）下使用。其中，第五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一石墨化碳填料柱能分離多種化合物，主要用于分離幾何異構體；氧化鋁柱剛性強，柱床穩(wěn)定，可分離多種化合物且多用于制備色譜；氧化鋯柱較氧化鋁柱有更強的pH適用范圍及能耐受更高的溫度，但其應用尚待進一步研究。1.3.4建立色譜柱檔案

應同色譜儀器檔案一樣重視色譜柱檔案，主要內(nèi)容包括：品牌、型號、系列號、購進日期、購進發(fā)票、使用記錄（使用日期、使用人、使用目的、使用情況）、維護保養(yǎng)記錄（老化時間、老化人、故障現(xiàn)象、故障原因、處理方法、處理結果及附圖）等，并以檔案盒形式保存，最好做到專柱專用。第六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一1.3.5常用液相色譜柱主要應用范圍與特點匯總1.3.5.1反相色譜柱柱填料類型主要應用范圍特點C18（ODS）可分離多種化合物，最適合用于極性樣品或做離子抑制的樣品的分析

普適性好；保留性強，用途廣

；可用于正相。C8（辛基）

與C18相似與C18相似，但保留值稍小C3，C4多用于肽類與蛋白質(zhì)

保留值更小

C1[三甲基單氯硅烷(TMS)]普通反相溶劑分析疏水性強的化合物；使用高水含量溶劑分析高極性化合物

；分離多功能團化合物保留值最小；最不穩(wěn)定；可用于反相與正相

苯基，苯乙基

多用于分離分析同時含極性和非極性芳香化合物的混合物

保留值適中；選擇性有所不同

，對極性芳香化合物選擇性更強；可用于正相。第七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一1.3.5.2正相色譜柱柱填料類型主要應用范圍特點CN（氰基）

適用于在ODS上無保留或分離時間太長的組分的分離，以及樣品中同時含有親水與疏水性化合物而在ODS上色譜優(yōu)化困難的場合，也可用于氨基酸分析。屬中等級性柱，普適性好；保留適中，可用于正相與反相。

NH2（氨基）

主要用于分析單糖類、烴類化合物保留性弱；極性大，不穩(wěn)定，酸性條件下易水解；亦可用于反相。OH（二醇基，DIOL）

多用于有機酸、肽類與蛋白質(zhì)分析

極性大于CN，小于NH2，常做HILIC用?？煞聪嘤?。高純硅膠柱多用于制備LC，適用于多種化合物普適性好；價廉；操作不太方便；pH窄（2-7.5）；次級保留效應強（硅羥基），易峰拖尾或前延，分叉等。第八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一1.3.5.3聚合物基質(zhì)柱（eg.聚苯乙烯柱）

單獨的聚苯乙烯類填料柱主要用于分離蛋白質(zhì)類等大分子化合物，多用于GPC、GFC、MEC等；若與離子交換基團共鍵則形成離子交換柱，用于分離酸性化合物（磺酸基團）、堿性合物（季銨基團）及藥物代謝產(chǎn)物等。特點：在1＜PH＜13的流動相中穩(wěn)定；分離峰形較好，柱子壽命較長。1.3.5.4其他無機物填料柱

如氧化鋁、石墨化碳、氧化鋯、硅藻土等，主要作制備色譜用。

柱填料類型主要應用范圍特點Chiral（手性柱）

常用于分離手性異構體，根據(jù)分離不同機理選擇。不同化學性質(zhì)的異構體需采用不同類型的手性柱

。部分亦可用于反相。HILIC（親水作用柱）最常用Diol柱、丙基酰胺基鍵合硅膠柱，多用于分析極性化合物、端基異構體、如藥物極性代謝產(chǎn)物、多肽、有機酸、糖類等。多用于ELSD檢測，C18無保留化合物，毒品檢查等?？捎糜诜聪?。第九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一1.4液相色譜柱制備工藝簡述

不同品牌色譜柱制備工藝各異，但都可歸納為如下流程（以硅膠柱為例）：硅烷化硅膠制備（四乙氧基硅烷脫乙基與聚合）→Si-OH基暴露（

脫乙基，置換成H）→海綿狀多孔硅膠構造（物理勻質(zhì)過程）→官能團鍵合（各種官能團與Si-OH鍵合）→端基封口（對殘余的Si-OH用小分子的氯-甲基、氯-乙基鍵合

）→潤濕混合（加乙醇等調(diào)勻，其配方各廠家均有專利保護）→裝填（機械裝填或手工裝填，層層裝填，壓緊，潤濕）→高壓平衡（軸向加壓或徑向加壓，各廠家均有專利保護）→干燥（此步為關鍵工藝步驟，各廠家均有專利保護）→削平→組件安裝→預平衡→柱效測試流動相平衡→柱效測試→封口→包裝第十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一1.5液相色譜柱分離機理概述

色譜柱類型分離機理備注常規(guī)反相柱相似相溶常規(guī)正相柱相似相溶離子交換柱樣品離子與色譜柱離子達到置換動態(tài)平衡要關注pH條件手性柱（Chiralcolumn）氫鍵作用、偶級-偶級作用、π-π作用、靜電作用、疏水作用、空間作用

一般，AGP、HSA、BSA等以疏水作用、空間作用為主

。親水性色譜柱（HILIC）氫鍵作用、偶極作用和靜電作用等多種次級效應及相似相溶基于NP原理氨基酸分析柱相似相溶基于RP原理第十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2、常用液相色譜柱使用方法與維護保養(yǎng)

(1)認識色譜柱規(guī)范化使用與保養(yǎng)的必要性：延長色譜柱使用壽命，降低色譜柱使用成本，逐步提高分析人員色譜柱使用與維護水平，確保試驗數(shù)據(jù)的準確性、可靠性和重現(xiàn)性，提升個人在色譜領域的競爭力。(2)熟悉幾個概念：

液相色譜柱：指用于液相色譜分離的柱形固定相，由柱管、壓帽/卡套、篩板（濾片）、填料、接頭等組合而成，可用于液相色譜分析與制備。色譜柱再生：指色譜柱在非正常情況下，針對異常現(xiàn)象及原因采取的一系列修復補救措施，以提高色譜柱柱效和延長其使用壽命的處理過程。運載溶劑（ShippingSolvent）：指色譜柱生產(chǎn)廠商在柱出廠測試合格后飽和于色譜柱內(nèi)的合適溶劑，以利于運輸保存，多與保存溶劑相同。保存條件（StorageConditions）：指色譜柱生產(chǎn)廠商根據(jù)不同柱類型及其色譜柱填料的制備、鍵合、裝填、高壓定型、凈化干燥等工藝條件的不同要求而特別制定的色譜柱保存前凈化飽和的處理程序與儲存條件，包括凈化程序、凈化溶劑和保存溶劑、保存溫度。保存溶劑（StorageSolvent）：用于保存色譜柱并指定了溶劑組成與

比例的溶液。第十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一(3)對新柱正確老化處理的必要性認識：新購色譜柱出廠前均采用適合的運載溶劑（ShippingSolvent）飽和，密封，由于運輸過程周期較長，柱床容易干涸，所以新柱使用前需重新飽和與老化。若老化方法不正確或時間不夠，極易導致色譜柱在使用較短時間后即產(chǎn)生分離度下降、峰形變差、峰拖尾等柱效降低的情況。需根據(jù)色譜柱不同類型選擇不同飽和與老化方法。2.1普通C8及C18反相色譜柱（C8&C18Reversed-phasechromatographycolumn）（1）準備新鮮超純水及色譜級乙腈或甲醇，沖洗色譜儀器系統(tǒng)，保證儀器系統(tǒng)管路干凈。（新柱老化前，此步?jīng)Q不可忽略）（2）將色譜柱反向連接，不接檢測器。用水-有機相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速沖洗20～30min。（目的是沖洗出柱入口端無機雜物與篩板孔雜物，使篩板正常）（3）再將色譜柱正向連接，不接檢測器。用水-有機相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速沖洗20～30min。（目的是沖洗出柱出口端無機雜物與篩板孔雜物，使篩板正常）第十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（4）連接檢測器，開啟柱溫達30℃～40℃，用水-有機相（90：10～95:5），以0.3～0.6ml/min流速沖洗4h以上。（目的是充飽和色譜柱，去除柱內(nèi)空氣）

（5）用水-有機相（10：90～5:95），以0.3～0.6ml/min流速沖洗2h以上[或在120min內(nèi)以水-有機相（95:5→0:100）梯度變化，以0.3～0.6ml/min流速沖洗]→再用100%有機溶劑，以0.3～0.6ml/min流速沖洗1h以上→最后用100%有機溶劑，以1ml/min流速沖洗1h以上。（目的是老化色譜柱）

（6）在平衡前根據(jù)水相-有機相的比例，首先調(diào)整水-有機相的比例接近流動相水相-有機相的比例，以1ml/min流速沖洗30左右（目的是相平衡過渡）。如果流動相中含有緩沖鹽，決不可在柱老化后立即用流動相平衡，必需先用90%以上水進行預平衡30min以上，否則，會導致緩沖鹽在柱內(nèi)析出結晶，嚴重時會將新柱永久不可逆地損壞。第十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（7）然后更換成新制并經(jīng)0.45um濾膜過濾，超聲脫氣后的流動

相，按檢測方法平衡至少1h，待基線穩(wěn)定后，開始進樣檢測。

（8）由于是新柱首次使用，在進樣完成后需立即對色譜柱進行凈化和有機溶劑飽和。方法是：用水-有機相（90：10～95:5），以0.6ml/min流速沖洗1h以上→再用水-有機相（90：10～95:5），以1ml/min流速沖洗30min以上（或者采用溶劑梯度變化至100%有機相沖洗120min以上）→最后用100%有機溶劑，以1ml/min流速沖洗1h以上。若流動相中有緩沖鹽，建議用100%水沖洗1h以上后，再重復上述凈化程序（但個別品牌C8或C18色譜柱不耐受純水沖洗者例外）。

在新色譜柱使用幾次，均正常后，運行完畢凈化處理程序可簡化為：用水-有機相（90：10～95:5），以1ml/min流速沖洗1h以上→再用100%有機溶劑，以1ml/min流速沖洗30min以上→選擇柱說明書中保存條件（StorageConditions）規(guī)定的保存溶劑（StorageSolvent）沖洗10倍柱體積以上→封口，保存。

（9）凈化完畢，若次日不再使用，可取下色譜柱，用封頭螺絲密封，交色譜柱管理人員入庫保存于防塵環(huán)境下，備案。第十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（10）備注：老化用有機溶劑推薦使用色譜級甲醇，不同品牌色譜柱需區(qū)別對待；水需用去離子的超純水。若色譜柱使用后入庫保存，長時間未使用，重新使用時仍需重新飽和。方法是：用水-有機相（90：10～95:5），以0.6ml/min流速沖洗1h以上→再用100%有機溶劑，以1ml/min流速沖洗30min以上→然后調(diào)整水-有機相的比例接近流動相水相-有機相的比例，以1ml/min流速沖洗30左右→最后用流動相平衡1h以上，進樣檢測。必需注意流動相pH值不能超過色譜柱pH耐受范圍，過酸容易使鍵合相變態(tài)，過堿則易導致硅膠溶解柱床塌陷。（11）特別提示：當供試品溶液中含有一定量表面活性劑，多次進樣后，由于表面活性劑會在篩板及硅膠表面形成表面膜，導致峰變寬、拖尾甚至分叉。此時，處理方法如下：將色譜柱反向連接接，不接檢測器，用水-乙腈（90：10～95:5），以0.6ml/min流速沖洗2h以上→再用100%乙腈，以0.6ml/min流速沖洗1h以上→然后正向連接好色譜柱，用水-乙腈（90：10～95:5），以1ml/min流速沖洗1h以上→再用100%乙腈，以1ml/min流速沖洗1h以上，即可恢復。第十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（12）警告：無論何時，必須保證色譜柱柱床不干涸，尤其是進樣檢測和柱沖洗過程中不能讓流動相長時間（30min以上）走空，否則易使色譜柱干涸且?guī)氪罅繋缀鯚o法排出的氣泡，甚至導致柱床局部塌陷或中部開裂。使用與保存時，嚴禁用力甩，絕對杜絕不小心猛烈撞擊或高處掉落，否則，易導致柱床機械性損壞，則再無再生可能。2.2正相色譜柱（Normal–PhaseChromatographycolumn）

目前，正相色譜分析最常用的是氨基柱與氰基柱。2.2.1氨基柱（-NH2）

氨基柱可以同時用于正相條件和反相條件，但多用于正相色譜條件。使用時需注意，正相反相交替使用時必需用異丙醇過度，保證柱保存溶劑與流動相互溶。新購氨基柱老化處理及使用基本程序如下：1）若需要在正相條件下使用：①用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速沖洗約50倍柱體積[備注：氨基柱出廠保存溶劑多用正相溶劑，eg.正己烷-乙腈（99：1）]。

第十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一②再根據(jù)待分析用正相流動相極性選用極性相近的氯仿或二氯甲烷以相同的流速沖洗約10倍柱體積。③用正相流動相平衡1h以上，確保柱壓控制在6000Psi以內(nèi)，以防止柱頭塌陷。待基線平穩(wěn)后，進樣檢測。如果要使用的流動相中含有緩沖鹽類，在使用流動相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。④分析完畢，用異丙醇，以0.5ml/min流速沖洗色譜柱約30倍柱體積→再用甲醇，以1ml/min流速沖洗色譜柱約10倍柱體積→再用異丙醇，以0.5ml/min流速沖洗色譜柱約10倍柱體積。若使用的分析用流動相中含有緩沖鹽類，分析完畢需先用不含緩沖鹽的同比例流動相沖洗約30倍柱體積，再按上述方法沖洗。⑤再用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑以1ml/min沖洗約10倍柱體積，保存即可，一般用正己烷-乙腈（99：1）。⑥重新在正相條件下使用時，重復上述①～⑤過程即可，時間可適當減少一半左右。第十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2）若需要在反相條件下使用：①先用正己烷-乙腈（99：1）以0.5ml/min的流速沖洗約30倍柱體積→再依次以0.5ml/min的流速，用等量的氯仿→異丙醇→甲醇→甲醇-水（50：50）分別沖洗柱子約10倍柱體積→再以0.5ml/min的流速，用pH11.0以下的氫氧化鈉溶液沖洗柱子約30倍柱體積（注意：pH值切不可超過11.0）→立即用水以0.5ml/min的流速沖洗柱子約30倍柱體積→最后換成反相流動相平衡1h以上，待基線平穩(wěn)，進樣檢測。（備注：若要使用的反相流動相中含有緩沖鹽類，在用反相流動相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。在反相條件下使用時，要特別注意控制pH值范圍及流動相中水的比例，pH值越低越易發(fā)生鍵合相水解，流動相中水的比例越高也越易發(fā)生鍵合相水解。最理想的pH范圍在pH3.0-7.0，決不允許超過11.0。）②反相條件下使用完畢，凈化處理程序同C18柱,但需注意，沖洗溶劑中有機相不能低于10%；凈化完畢，先用甲醇以0.5ml/min的流速沖洗柱子約10倍柱體積→然后用異丙醇以0.5ml/min的流速沖洗柱子約10倍柱體積→最后用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑[一般用正己烷-乙腈（99：1）]以1ml/min沖洗約10倍柱體積→密封，保存即可。第十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2.2.2氰基柱（-CN）

氰基柱可以同時用于正相條件和反相條件，但多用于正相色譜條件。使用時需注意，正相反相交替使用時必需用異丙醇過度，保證柱保存溶劑與流動相互溶。新購氰基柱老化處理及使用基本程序與氨基柱基本相同，主要程序如下：1）若需要在正相條件下使用：①用異丙醇或正己烷以0.5ml/min的流速沖洗約30倍柱體積。（備注：氰基柱出廠保存溶劑多用正相溶劑，eg.正己烷或異丙醇。）②再根據(jù)待分析用正相流動相極性選用極性相近的氯仿、異丙醇或二氯甲烷以相同的流速沖洗約10倍柱體積。③用正相流動相平衡1h以上，確保柱壓控制在6000Psi以內(nèi)，以防止柱頭塌陷。待基線平穩(wěn)后，進樣檢測。如果要使用的流動相中含有緩沖鹽類，在使用流動相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。第二十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一④分析完畢，用異丙醇，以0.5ml/min流速沖洗色譜柱約30倍柱體積→再用甲醇，以1ml/min流速沖洗色譜柱約10倍柱體積→再用異丙醇，以0.5ml/min流速沖洗色譜柱約10倍柱體積。若使用的分析用流動相中含有緩沖鹽類，分析完畢需先用不含緩沖鹽的同比例流動相沖洗約30倍柱體積，再按上述方法沖洗。⑤再用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑以0.5ml/min沖洗約10倍柱體積，保存即可，一般用正己烷或異丙醇。⑥重新在正相條件下使用時，重復上述①～⑤過程即可，時間可適當減少一半左右。2）若需要在反相條件下使用：操作和維護與C18柱基本相同，但需注意，沖洗溶劑中有機相不能低于10%。第二十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一①新柱先用正己烷或異丙醇以0.5ml/min的流速沖洗約30倍柱體積→再依次以0.5ml/min的流速，用等量的水-乙腈（95:5）→THF（四氫呋喃）→水-乙腈（5:95）分別沖洗柱子約10倍柱體積[最好再繼續(xù)用水-乙腈（5:95）以0.2-0.3mL/min過夜沖洗]→最后換成反相流動相平衡1h以上，待基線平穩(wěn)，進樣檢測。（備注：若要使用的反相流動相中含有緩沖鹽類，在用反相流動相平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例流動相過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。在反相條件下使用時，要特別注意控制pH值范圍及流動相中水的比例，pH值越低越易發(fā)生鍵合相水解，流動相中水的比例越高也越易發(fā)生鍵合相水解。最理想的pH范圍在pH1.5-7.0。）②反相條件下使用完畢，凈化處理程序同C18柱；凈化完畢，先用甲醇以0.5ml/min的流速沖洗柱子約10倍柱體積→然后用異丙醇以0.5ml/min的流速沖洗柱子約10倍柱體積→最后用色譜柱說明書中規(guī)定的正相保存溶劑（一般用正己烷或異丙醇）以0.5ml/min沖洗約10倍柱體積→密封，保存即可。第二十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2.3陰/陽離子交換色譜柱（negion/cationexchangecolumn）

陰/陽離子交換柱屬于強離子交換柱，分為玻璃柱與不銹鋼柱，多用不銹鋼柱。陽離子交換柱填充硅膠基質(zhì)，鍵合強陽離子基團，含有磺酸鹽功能團，屬于酸性離子柱，特別設計用于常規(guī)HPLC分析有機和無機陽離子。陰離子交換柱填充硅膠基質(zhì)，鍵合強陰離子基團，含有季胺堿功能團，屬于堿性離子柱，特別設計用于常規(guī)HPLC分析有機和無機陰離子。對于新柱而言，二者老化、使用與保養(yǎng)程序類似，主要方法如下：（1）首先在開始使用系統(tǒng)以前檢查柱子有否微生物生長，否則柱子會堵塞，柱壓會升高到無法接受的水平。然后，不接檢測器，正向安裝色譜柱，使用純甲醇以0.6ml/min流速沖洗約5倍柱體積。（2）再連接檢測器，用純甲醇以0.6ml/min流速沖洗約10倍柱體積。（3）然后使用去離子水以0.6ml/min流速沖洗約10倍柱體積。第二十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（4）最好再確保連接好保護柱（多使用相應柱制造商針對性提供

的保護柱），再用選用的洗脫液以0.6ml/min流速平衡1h以上，進樣檢測。同樣，若洗脫液中含有緩沖鹽類，在用分析洗脫液平衡之前，先用不含緩沖鹽的同比例洗脫液過渡，沖洗約10倍柱體積，避免緩沖鹽在分析柱內(nèi)析出。

（5）特別提示：

①洗脫液要求是新制的低電導率緩沖液，或者是有UV吸收的緩沖液。對于陽離子交換柱，多用檸檬酸或酒石酸緩沖液（或其混合溶液）、鄰苯二甲酸緩沖液，pH范圍從2.5到6.5；對于陰離子交換柱，多用磷酸緩沖液、硝酸銨溶液（1mMol/L），鄰苯二甲酸緩沖液，pH范圍從2.5到6.5。絕對禁止使用水楊酸緩沖液，因水楊酸分解產(chǎn)物會改變固定相的性質(zhì)。洗脫液在使用以前必須用0.45微米濾膜過濾并徹底脫氣，以防止發(fā)生檢測和泵送問題。

②提倡在室溫環(huán)境使用，為了提高分析的穩(wěn)定性，可以設置高于室溫5～10℃的柱溫，最好不要在40℃以上使用。第二十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一25③使用過程中不要超過其耐受最高壓力（不銹鋼柱：4500psi；玻璃柱：3000psi）。④增加流速或者降低流速要采取小的間隔變化以防止柱床的擾動。更換柱子，必須先降低流量至0，等待洗脫液完全流出柱子，壓力變化到0（約2分鐘）后再更換。⑤必須防止將來自流動相或者樣品中的疏水性或與流動相極性差別很大的化合物進入色譜柱，特別地，要絕對禁止導入顆粒雜質(zhì)，以防止操作壓力增高，污染物難以或者不能去除。（6）分析完畢，凈化程序基本同C18柱，先用去離子水以0.6ml/min流速沖洗約20倍柱體積→然后用甲醇以0.6ml/min流速沖洗約10倍柱體積，純甲醇飽和后→密封保存即可。（注意：一定要確保在柱子內(nèi)沒有緩沖液或者其他含鹽類的洗脫液的情況下保存色譜柱。）（7）長時間保存后重新使用，重復上述（1）～（6）即可。第二十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一26（8）使用并正確處理完畢，入庫保存于防塵環(huán)境下，登記備案。（9）特別說明：部分離子交換柱的使用條件、保存溶劑與保存條件、預平衡溶劑與方法、再生方法等有特殊要求。[eg.phenomenexRezexROA-OrganicAcidH+(酸性陽離子柱)]①柱壓必須控制在600psi之內(nèi)；流動相中有機相比例不得超過10%，流速應小間隔上升至0.6ml/min，且不得超過0.6ml/min，降低流速亦然；柱子用超純水飽和后保存于4℃左右冰箱中；運行時，柱溫不超過85℃。②分析完畢，用超純水清洗30倍柱體積以上，密封保存。③為防止色譜柱長時間保存時長菌，應使用0.05mol/L左右的硫酸溶液（陽離子交換柱）或氨水溶液（陰離子交換柱）飽和后保存于4℃左右冰箱中。新柱或舊柱再次使用前均需先用去離子水，以0.6mL/min流速沖洗色譜柱約30倍柱體積，將柱內(nèi)硫酸或氨水徹底洗出→然后用流動相平衡，進樣檢測即可。分析完畢，先用去離子水，以0.6ml/min流速沖洗色譜柱約30倍柱體積→再用0.5mol/L左右的0.05mol/L左右的硫酸溶液（陽離子交換柱）或氨水溶液（陰離子交換柱）沖洗色譜柱約10倍柱體積→密封，保存即可。具體流速需根據(jù)柱長與柱內(nèi)徑選擇，一般不允許超過0.6ml/min，因流速過大易導致鍵合相隨流動相流出。其他具體要求，請仔細閱讀相關說明書，并以說明書為準。第二十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2.4手性色譜柱（ChiralHPLCColumn）

手性色譜柱（ChiralHPLCColumn）是由具有光學活性的單體，鍵合在硅膠或其它聚合物上制成手性固定相（ChiralStationaryPhase）。通過引入手性環(huán)境使對映異構體間呈現(xiàn)物理特征的差異，從而達到光學異構體分離的目的。主要有刷（Brush）型或稱為Prikle型、纖維素（Cellulose）型、環(huán)糊精（Cyclodextrin）型、大環(huán)抗生素（Macrocyclicantibiotics）型、蛋白質(zhì)（Protein）型、配位交換（Ligandexchange）型、冠醚（Crownethers）型等類型，此類色譜柱可用于正相系統(tǒng)與反相系統(tǒng)，多用于正相系統(tǒng)。

常用的是蛋白質(zhì)（Protein）型，其分離依賴于疏水相互作用和極性相互作用，大多可用于反相色譜條件。目前使用較多的是α-酸性糖蛋白（α-AcidGlycoprotein，AGP）、人血清白蛋白（HumanSerumAlbumin，HSA）、牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin，BSA）和卵類粘蛋白（Ovomucoid，OV）。第二十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一28避免過度超載

由于手性柱一般都較為昂貴，使用不當又極易導致?lián)p壞，且再生尤其困難，所以使用、維護與保養(yǎng)均需特別慎重

。對于新的手性柱，使用、老化與保養(yǎng)程序基本類似，但由于制造商工藝條件各異，需要根據(jù)不同基質(zhì)特點分析，參照并嚴格按照相應說明書進行處理。一般（以AGP柱為例）主要程序如下：（1）將色譜柱接到色譜儀器之前，必須先用合適的溶劑沖洗流路（包括六通閥和定量環(huán)）。絕對杜絕流路中殘存丙酮、氯仿、DMF（二甲基甲酰胺）、DMSO（二甲基亞砜）、乙酸乙酯、二氯甲烷、THF（四氫呋喃）等，以防止破壞手性固定相。如果在進樣檢測，進樣間隔的洗針液必須更換成合適的溶劑，最好是15%～20%的異丙醇溶液。然后連接好色譜柱，不接檢測器，用純水以0.5ml/min流速沖洗約20min。（注意：流速需小間隔從0升至0.5ml/min）（2）連接檢測器，再用純水以0.5ml/min流速沖洗約120min。（3）用15%以內(nèi)的異丙醇溶液以0.5ml/min流速沖洗約60min。（4）再用純水以0.5ml/min流速沖洗約60min。第二十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（5）用流動相以不超過0.8ml/min流速平衡約1h直至基線平穩(wěn)，進樣檢測。（6）分析完畢，用純水以0.5ml/min流速沖洗約60min，以徹底洗出緩沖鹽，然后用15%以內(nèi)的異丙醇溶液以0.5ml/min流速沖洗約30min，密封，保存于10℃左右環(huán)境中，登記備案。（7）特別注意：①必須確保柱壓在50bar～100bar之間，一定不要超過100bar。流速一般不大于0.8ml/min，具體應以不超過色譜柱使用壓力上限為準。升高或降低流速均需以小間隔逐步升高或降低。②提倡在室溫下使用，但一般要求柱溫不超過25℃。③要特別注意流動相及樣品溶解溶液的pH值，最佳pH范圍為4.0～7.0，切不可超過10.0，以防止硅膠溶解而損壞填料，所以pH最好不要超過8.0。否則，極易導致手性分離不佳、色譜峰嚴重變寬、色譜峰拖尾及分叉等。強堿性溶液的導入，尤其容易導致手性柱不可逆損壞，無再生可能而徹底報廢！第二十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一④以上（1）～（6）是在反相條件下使用情況，如果要換成正相使用，必需先用100%異丙醇以0.5ml/min流速沖洗約30min過渡，其他要求同上。⑤色譜柱保存時，必需保證柱內(nèi)無緩沖鹽或其他鹽類物質(zhì)殘存。⑥手性柱在使用過多次且正常后，可簡化上述程序，將時間適當縮短即可。（8）特別建議：①當分離分析酸堿性手性化合物時，有必要在流動相加入少量電荷遷移添加劑（濃度不超過10mMol/L）來提高手性柱的手性選擇性。常見的有：分離酸性化合物時，添加酸性添加劑[如三氟乙酸(TFA)、乙酸(Aceticacid)、甲酸(Methanoicacid)、七氟乙酸（HFBA）、辛酸（OA）]，濃度0.01%～0.5%；分離堿性化合物時，添加堿性添加劑[如二乙胺(DAE)、三乙胺（TAE）、丁胺(Butylamine，BAE)、乙醇胺(Ethanolamine，EthAE)、N，N-二甲胺（DMOA）]，濃度0.01%～0.5%。第三十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一②辛酸（OA）及N，N-二甲胺（DMOA）與水的互溶性有限，在常溫下，僅僅2mMol/L（OA）或5mMol/L（DMOA）能均一的溶解于水中，若超此限度，將分層。因此，需特別注意兩者水溶液的濃度。③由于上述電荷遷移添加劑與手性柱柱床有很好的親和力，難以從柱上洗除，長期使用可能會導致柱性能下降。因此，建議添加上述電荷遷移添加劑使用后的手性柱應作為某一品種分析專用柱。（9）特別說明：①部分手性柱（以AGP柱為例）使用前要求用10mMol/L的醋酸銨緩沖液（AmmoniumacetrateBuffer，冰醋酸調(diào)pH至5.8）-異丙醇（2-PrOH）（95:5）進行預平衡。操作程序基本同上，不同在于：需先用純化水以0.5ml/min流速沖洗色譜柱30倍柱體積以上→再用10mMol/L的醋酸銨緩沖液（AmmoniumacetrateBuffer，冰醋酸調(diào)pH至5.8）-異丙醇（2-PrOH）（95:5）以0.5ml/min流速沖洗色譜柱30倍柱體積以上→然后用純化水以0.5ml/min流速沖洗色譜柱10倍柱體積以上→最后用流動相平衡1h以上，進樣檢測即可。分析完畢，凈化保養(yǎng)程序同上（1）～（6）。第三十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一②部分HSA及BSA手性柱，使用保養(yǎng)程序較為簡易。即先用水-有機相（95:5或100:0），小間隔升高流速至0.5或1ml/min，沖洗約30倍柱體積→再用流動相平衡1h左右，進樣檢測即可。分析完畢，用水-有機相（95:5或100:0），小間隔升高流速至0.5或1ml/min，沖洗約30倍柱體積→然后用100%有機溶劑（一般多用乙腈）同流速沖洗約10倍柱體積→再以小間隔將流速降至0→密封，保存即可。③也有部分品牌手性柱（eg.YMCCHIRALNEV手性柱）用純乙腈保存，通常在反相條件下使用。使用前，應用純水小間隔升高流速至0.5ml/min，沖洗約60min或老化4h或更久→再更換成流動相小間隔升高流速至所需流速平衡至基線平穩(wěn)，進樣檢測即可。分析完畢，亦用純水以0.5ml/min流速沖洗約60min→再用乙腈沖洗約30倍柱體積，密封保存即可。柱溫要求30～45℃。柱壓（扣除系統(tǒng)背景壓力）有特殊要求，一般，150mm柱不得高于20MPa（3000Psi）；250mm柱不得高于25MPa（3700Psi）。流動相pH范圍為2.0～6.5。第三十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2.5親水性色譜柱（Hydrophilicchromatographiccolumn，HILIC）親水性色譜是正相色譜的一個變種。

HILICHPLCColumn親水性色譜柱是以超純硅膠為基質(zhì)，表面鍵合有二氧化硅(silica，弱酸性)，氰基（cyano，弱酸性）,

二羥基（diol，中性），二丙基乙酰胺基（valpromide，弱堿性），丙基酰胺基（Venusil，弱堿性），氨基（amino，弱堿性）,

吡啶基（Pyridine，弱堿性），咪唑基（Imidazole，弱堿性）等親水基團的極性固定相?？捎糜谡?、反相和親水液相色譜，是代替氨基柱和硅膠柱的最佳選擇。與傳統(tǒng)硅膠柱相比，具有更好的重現(xiàn)性和柱壽命。HILICHPLCColumn親水性色譜柱適合于分離在反相色譜柱上不保留的極性化合物，尤其是對強極性堿性化合物的保留能力強，因此，其成為研究藥物代謝、藥物發(fā)現(xiàn)和組合化學科學的首選，尤其適用于LC-MS及LC-ELSD。通常主要用于分離水溶性極強的極性化合物，如有機酸（eg.水楊酸）、糖類等。其檢測靈敏度可比使用反相色譜柱提高10～1000倍。其使用與保養(yǎng)基本同正相色譜柱，主要程序及注意事項如下：第三十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（1）新柱老化時，應采用水-乙腈（50:50）以0.4～0.8ml/min流速，沖洗至少50倍柱體積進行一次預平衡→再用水-乙腈（30:70）以檢測條件流速，沖洗約10倍柱體積進行二次預平衡。（2）再用初始流動相條件按檢測方法沖洗約20倍柱體積進行初始平衡。（3）然后進樣1至2針，進行進樣平衡。（4）再用初始流動相條件按檢測方法沖洗約20倍柱體積進行最終平衡。（5）進樣檢測。（6）分析完畢，凈化處理程序如下：首先用水-乙腈(90:10)以0.4～0.8ml/min流速，沖洗約30倍柱體積（洗出強極性物質(zhì)）→再用水-乙腈（50:50）以0.4～0.8ml/min流速，沖洗至少50倍柱體積（洗出中等極性物質(zhì)）→再用水-乙腈（10:90）以0.4～0.8ml/min流速，沖洗至少30倍柱體積（洗出弱極性物質(zhì)及飽和色譜柱）→密封，保存即可（保存溶劑多為90%乙腈溶液，多保存于10℃左右環(huán)境中）。第三十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（7）特別注意：①進樣檢測時，必需要保證流動相中至少含有40%左右的有機相（以乙腈多用）。流動相中若需使用添加劑時，一般避免添加離子對試劑，推薦使用醋酸銨、甲酸銨以提高進樣重現(xiàn)性，但要謹慎使用磷酸鹽等無機鹽，以避免沉淀在柱內(nèi)析出（因其在較高濃度有機溶劑下難溶）?？梢允褂玫话悴唤ㄗh使用甲酸等低分子量低黏性酸，且濃度多用0.2%，最好不要使用磷酸（因其黏度較大，易固定保留在固定相上，且易導致保留時間漂移）。流動相pH穩(wěn)定范圍一般為1.5-8.0。②梯度洗脫時，不允許從100%有機相（因為100%的乙腈可能不利于HILIC色譜柱中親水基團部分鍵合相的伸展，使得保留性能下降。）到100%水相，必需保證至少含有40%左右的有機相（以乙腈多用）。由于HILIC柱的固定相是親水性的，且在一定pH值范圍內(nèi)是帶電荷的，而HILIC的流動相是作為固定相的一部分來起作用的，因此必需在流動相中保持一定量的水相（比例保持在5%～60%）。第三十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一③等度洗脫時應注意避開流動相比例拐點。一般情況下，使用HILIC柱時，有機相比例增加，保留時間會延長，但HILIC柱在60%左右比例的有機相時會有一個拐點，即隨有機相比例增高，保留時間縮短。具體的拐點比例與生產(chǎn)廠商的填料有關，一般在50%-60%比例的有機相之間。（備注：親水色譜填料設計的初衷是為MS設計的，目的是使極性化合物在高有機相的環(huán)境下有保留。所以使用HILIC柱時，無論是等度洗脫還是梯度洗脫，不能使用100%的乙腈，推薦使用到95%就可以了；不推薦使用含乙腈60%以下的流動相，因為水相超過40%是沒有意義的，如此，雖然梯度范圍較小，但是足夠用了。）④過濾樣品溶液時，避免使用帶有橡膠密封圈的針管，而應使用玻璃針筒及不銹鋼針。樣品溶解溶劑最好是100%的有機相（但往往無法實現(xiàn)），最好不用純水，而應該保證有機溶劑至少40%的比例。第三十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一⑤應根據(jù)色譜柱型號選擇進樣體積，一般：5～50μLfor4.6mmi.d.column；0.5～5μLfor2.1mmi.d.column。⑥進樣器與進樣針及進樣間隔的清洗溶液，推薦使用含有95%有機相的水溶液或與流動相組成及極性相似的混合溶液（不含緩沖鹽及其他試劑）。⑦HILIC色譜柱的最佳流速范圍是0.4～0.8ml/min，但需根據(jù)色譜柱型號選擇，一般為：1.0mL/minfor4.6mmi.d.column；0.2mL/minfor2.1mmi.d.column。⑧柱溫無特殊要求，但不允許高于色譜柱說明書規(guī)定的最高耐受溫度。（8）警告：部分親水性色譜柱（eg.YMCDiol-GFC柱）運載溶劑與保存溶劑為具有高毒性的0.05%的疊氮化鈉（SodiumAzide，能通過吸入、食入及經(jīng)皮吸收等途徑侵害人體，具有氰化物樣毒性，易導致血紅蛋白酶形成受阻而呈現(xiàn)急性血壓驟降甚至死亡。）溶液。使用與保養(yǎng)程序基本同上，尤其要注意安全防范和環(huán)境保護。（現(xiàn)已基本退出市場）第三十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一2.6氨基酸分析柱（VenusilAA）氨基酸分析柱（VenusilAA）是一種改良的C18柱，基于陽離子交換柱分離、柱后茚三酮衍生、光度法測定的離子交換色譜法（IEC）、反相分離原理等，對蛋白質(zhì)水解液及各種游離氨基酸的組分進行含量分析。每一根色譜柱均經(jīng)過嚴格的18種氨基酸的分離檢測，保證了結果的可靠性。特別適用于分析酸性和酸不穩(wěn)定性氨基酸，以及用陽離子交換分離不完全的氨基酸對。其使用與保養(yǎng)與C18柱基本相同，主要程序及注意事項如下：（1）儀器基本結構與普通HPLC相似，但需針對氨基酸分析進行細節(jié)優(yōu)化（添加茚三酮試劑防氧化氮氣保護裝置、惰性管路、在線脫氣、洗脫梯度及柱溫梯度控制、溶液和樣品的制冷控制等特殊模塊）。（2）需根據(jù)具體分析樣品的要求選擇合適的色譜系統(tǒng)。通常分為兩種系統(tǒng)：蛋白水解分析系統(tǒng)（鈉鹽系統(tǒng)）和游離氨基酸分析系統(tǒng)（鋰鹽系統(tǒng)），利用不同濃度和pH值的檸檬酸鈉或檸檬酸鋰進行梯度洗脫。其中鈉鹽系統(tǒng)一次最多分析約25種氨基酸，速度較快，基線平直度好；鋰鹽系統(tǒng)一次最多分析約50種氨基酸，速度較慢，基線一般不如鈉鹽系統(tǒng)好。

第三十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（3）需根據(jù)具體分析樣品的要求選擇合適的樣品衍生方法（使其具有紫外吸收或熒光發(fā)射特性）。通常有柱前衍生與柱后衍生兩種：一般采用柱前衍生法，因其與柱后衍生法相比具有以下優(yōu)點：①固定相采用C18(反相色譜)柱，可分辨分子結構細小的差異；②流動相為極性溶劑，如甲醇、乙二腈等，避免對熒光檢測的干擾，可提高靈敏度及檢測速度；③不需要添加額外的反應器和泵，可實現(xiàn)色譜儀一機多用。但隨著氨基酸自動分析儀的技術水平提高，現(xiàn)趨向于使用柱后衍生法，如茚三酮柱后衍生反應。本法需額外的添加柱后反應器和泵，使經(jīng)色譜分離的各種氨基酸與茚三酮反應生成的藍紫色化合物（570nm），其顏色深淺與各有關氨基酸的含量成正比。[但脯氨酸和羥脯氨酸則生成黃棕色化合物（440nm），需在另外波長處定量測定。]

第三十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（4）樣品必須經(jīng)正確預處理后進樣檢測，包括：①檢測游離氨基酸含量時，需先除去脂肪雜質(zhì)后，再上柱分析。②測定蛋白質(zhì)的氨基酸組成時，樣品必須經(jīng)酸水解→去糖和淀粉→去脂肪→去核酸→去無機鹽等過程后，再上柱分析。（5）測定必須在pH5～5.5、100℃條件下進行；衍生化反應進行時間為10～15min；生成的紫色物質(zhì)在570nm波長下測定，而生成的黃色化合物在440nm波長下測定。（6）顯色反應用茚三酮試劑極易被氧化，隨著時間延長發(fā)色率會降低。故在較長時間測定樣過程中應隨時采用已知濃度的氨基酸標準溶液上柱測定以檢驗其變化情況。（7）要注意氨基酸分析柱柱填料為疏水性高聚物薄殼型離子交換劑，最好確保流動相pH值在2～10范圍內(nèi)使用。余者，諸如老化、凈化、保養(yǎng)等，請參考C18柱。第四十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

3、液相色譜柱常見問題分析與解決方案

這部分內(nèi)容為長期實踐積累，重點關注色譜柱使用中經(jīng)常遇到的問題，并針對這些問題進行適當處理，以延長柱壽命。這些解決辦法也不能保證百分之百有效，但一般情況下，可以嘗試，往往能得到意外的驚喜?，F(xiàn)根據(jù)常用液相色譜柱的常見問題分類別詳述如下：3.1普通C8及C18反相色譜柱（C8&C18Reversed-phasechromatographycolumn）

當色譜柱使用較長時間之后，就可能發(fā)生柱壓升高、分離度不好、柱效降低、峰形不好等情況，這時就需要根據(jù)故障原因?qū)ιV柱進行清堵與再生，以延長色譜柱的使用壽命。具體原因及處理方法如下：第四十一頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（1）篩板堵塞與柱頭塌陷：主要現(xiàn)象有柱壓嚴重升高或不穩(wěn)定、色譜峰拖尾、色譜峰變寬、色譜峰分叉、禿峰等，需要進行清堵與彈性復原處理。（此方法適合于任何類型有相同故障的色譜柱的處理，不同的是溶劑要與相應類型色譜柱匹配。）主要處理方法如下：①一般情況下，將色譜柱反接，不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速沖洗約4h→再正向連接，接或不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.6ml/min流速沖洗約1h→再提高流速至1.0ml/min沖洗1h，觀察柱壓變化。若不湊效，則擰開柱頭螺母（色譜柱進口），小心取下篩板，用5%左右的硝酸溶液超聲處理20min左右，再用純水超聲20min左右。用小勺清理掉柱進口污染的部分填料，再將用乙醇調(diào)和后的相應的硅膠裝入柱入口（也可用已經(jīng)報廢的同類柱中的填料替代），用平面不銹鋼小鏟壓緊填平至略高出柱管口，但量不宜太多，否則，壓得太緊柱壓會升高，然后裝上清洗過的篩板，注意篩板安裝方向必需與原裝相同，最后緊固。第四十二頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一②沖洗與飽和：清堵緊固后，先反向連接色譜柱，不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速沖洗約4h→再換成甲醇以0.5ml/min流速沖洗約2h→再正向連接色譜柱，接或不接檢測器，用純水或水-有機相（多用甲醇、乙腈）（95:5）以0.3ml/min流速沖洗約2h→再換成甲醇以0.5ml/min流速沖洗約1h→然后用甲醇或乙腈以1ml/min流速沖洗約1h以上，再根據(jù)測試用流動相比例調(diào)整水-甲醇（或乙腈）比例，以1ml/min流速沖洗約1h，最后用測試用流動相平衡2h，進樣測試即可。③特別說明：如不是特殊情況，按其他辦法可行，則最好不要反沖色譜柱和拆卸篩板。（2）柱效降低：主要特征性現(xiàn)象有柱壓基本正常，但出現(xiàn)拖尾峰、禿峰、分叉峰、前延峰、峰變寬、基線漂移、理論板數(shù)降低、分離度降低等。需要進行再生處理，具體方法如下：第四十三頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一①一般情況下，順接色譜柱，按如下溶劑順序及條件沖洗：95%水-5%甲醇（或乙腈）（1.0ml/min，1h以上）→100％甲醇（1.0ml/min，1h以上）→100％乙晴（1.0ml/min，1h以上）→75％乙晴-25％異丙醇（0.5ml/min，10倍柱體積以上）→100％異丙醇（0.5ml/min，10倍柱體積以上）→100％二氯甲烷（0.5ml/min，10倍柱體積以上）→100％正己烷（0.5ml/min，10倍柱體積以上，根據(jù)實際情況可忽略）→100%異丙醇（0.5ml/min，20倍柱體積以上）→95%水-5%甲醇（或乙腈）（0.5ml/min，30min；再升至1.0ml/min，10倍柱體積以上）→檢測用流動相平衡2h或至基線平穩(wěn)，進樣測試。在沖洗過程中，隨時關注柱壓變化，確保不超過4000psi；若超出，可通過降低流速，升高柱溫來調(diào)整，具體操作可咨詢具備相關專業(yè)知識背景和實踐經(jīng)驗的人士。第四十四頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一②若上述方法效果不理想，可按如上溶劑順序和條件，先反接色譜柱沖洗→再順接色譜柱，用100%乙腈以1ml/min流速沖洗約2h→再用與流動相同比例的水-有機相以1ml/min流速沖洗約30min→最后用流動相平衡2h或至基線平穩(wěn)，進樣測試即可。③特別說明：再生過程必須隨時關注柱壓變化，柱壓過高易導致硅膠變形與開裂及鍵合相極性端連接順序紊亂，同時要保證再生時間足夠。（3）當分析復雜樣品時間過長，尤其是中藥分析，若出現(xiàn)柱壓正常而色譜峰形變差，分離度降低時可嘗試如下方法再生：先用5%甲醇（或乙腈）-95%水，將色譜柱反向連接，以1ml/min沖洗60分鐘以上→再用四氫呋喃（或丙酮）以0.5ml/min沖洗60分鐘以上（去除脂類）→再用65%甲醇（或乙腈）-35%水，以流速1ml/min沖洗60分鐘→然后用純甲醇或乙腈沖洗30分鐘→接著用與流動相同比例的水-有機相以1ml/min流速沖洗約30min→最后用流動相平衡2h，進樣測試即可。第四十五頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一（4）特別提醒：再生時最好選擇不具備在線脫氣的獨立泵送系統(tǒng)色譜儀器進行，以防正相溶劑損壞脫氣機密封膜或分子篩及比例閥等儀器精密部件。3.2正相色譜柱（Normal–PhaseChromatographycolumn）3.2.1氨基柱（-NH2）①在正相條件下使用時，故障率較低。但要注意不可進樣含有醛基、羰基的化合物，不可用于還原糖的分析；流動相要徹底脫氣，并不得含有羰基化合物和過氧化物（質(zhì)量較差的乙醚、四氫呋喃等溶劑中含有少量）。任何時候更換流動相時都要確保新流動相與柱子原保存液可互溶，若不互溶，必需用異丙醇過渡。第四十六頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

當使用氨基柱進行酸性物質(zhì)分析時，酸性物質(zhì)溶液有質(zhì)子存在，會使略帶負電荷的氨基官能團質(zhì)子化，導致使用一段時間后被測成分保留性質(zhì)有所改變或柱效下降。這時，建議按如下方法處理：

首先用異丙醇，以0.5ml/min流速，沖洗約50倍柱體積→然后用甲醇，以0.5ml/min流速，沖洗約50倍柱體積→再用異丙醇，以0.5ml/min流速，沖洗約10倍柱體積過渡，回到平常使用的正相流動相平衡2h，進樣檢測即可。若上述方法不湊效，可嘗試按以下程序沖洗與再生：

首先用含0.5%～1.0％NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速沖洗該柱約5～10倍柱體積→然后用不含NH3的50%乙腈-50%水溶液，以1.0ml/min流速沖洗該柱約5～10倍柱體積以洗去多余NH3→再用添加少許NH3（如0.1％）的酸性分析物的流動相平衡2h左右，進樣檢測即可。第四十七頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一②在反相條件下使用時，-NH2鍵會水解，尤其是在該柱子pH范圍以外，在極端酸性和堿性條件下柱效會下降很快，所以故障率較高。若出現(xiàn)柱壓增高柱效降低等情況，建議采用如下方法處理：

若流動相含有緩沖鹽，先以流動相比例的水-有機溶劑，以檢測分析時同流速沖洗約30倍柱體積→再用純甲醇，以1.0ml/min流速沖洗約50倍柱體積→然后用異丙醇，以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積過渡→再用二氯甲烷以0.6ml/min流速沖洗色譜柱約10倍柱體積→再用異丙醇以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積過渡回到甲醇條件下，以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積，密封保存或用流動相平衡2h左右（若流動相含有緩沖鹽，需先用與流動相同比例的水-有機相以1.0ml/min流速沖洗約30min），進樣檢測即可。若上述方法不湊效，可嘗試如下程序沖洗與再生：第四十八頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一

95％水-5％乙腈，以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積→THF（四氫呋喃），以0.6ml/min流速沖洗約10倍柱體積→95％乙腈-5％水以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積→保持95％乙腈-5％水，以低流速0.2-0.5mL/min沖洗過夜→流動相平衡2h（若流動相含有緩沖鹽，需先用與流動相同比例的水-有機相以1.0ml/min流速沖洗約30min），進樣檢測即可。3.2.2氰基柱（-CN）

①在正相條件下使用時，故障率較低，操作和維護與氨基柱基本完全相同。但當柱子使用一定時間后，若出現(xiàn)柱效下降，柱子老化，可通過沖洗再生來恢復其柱性能。具體方法如下：

用氯仿以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用異丙醇以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積→然后用二氯甲烷以0.5ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用流動相（pH1.5-7.0為佳）平衡1h，待基線平穩(wěn)，進樣檢測即可。第四十九頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一②在反相條件下使用時，-CN鍵會水解，尤其是在pH1.5-7.0范圍以外，在極端酸性和堿性條件下柱效會下降很快，所以故障率較高。如果在這個條件下使用，一定要注意及時清洗。若出現(xiàn)柱效下降，柱子老化，可通過沖洗再生來恢復其柱性能。具體方法如下：

若流動相含有緩沖鹽，先以流動相比例的水-有機溶劑，以檢測時同流速沖洗約30倍柱體積→再用95%水-5%乙腈以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用THF（四氫呋喃）以0.6ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用95%乙腈-5%水以1.0ml/min流速沖洗約10倍柱體積→再用流動相平衡2h（若流動相含有緩沖鹽，需先用與流動相同比例的水-有機相以1.0ml/min流速沖洗約30min），進樣檢測即可。若上述方法不湊效，可嘗試如下程序沖洗與再生：第五十頁，共五十八頁，編輯于2023年，星期一