核酸與蛋白質(zhì)的研究方法

關(guān)于核酸與蛋白質(zhì)的研究方法第一頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

從20世紀(jì)中葉開(kāi)始，分子生物學(xué)研究得到高速發(fā)展，除了基礎(chǔ)理論的重大突破，主要原因之一是研究方法，特別是基因操作和基因工程技術(shù)的進(jìn)步。第二頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

基因操作主要包括DNA分子的切割與連接、核酸分子雜交、凝膠電泳、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、核酸序列分析以及基因人工合成、定點(diǎn)突變和PCR擴(kuò)增等，是分子生物學(xué)研究的核心與基本技術(shù)。第三頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

基因工程是指在體外將核酸分子插入病毒、質(zhì)?；蚱渌d體分子，構(gòu)成遺傳物質(zhì)的新組合，使之進(jìn)入原先沒(méi)有這類分子的寄主細(xì)胞內(nèi)并進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定的繁殖和表達(dá)（細(xì)菌、細(xì)胞、動(dòng)物、植物）。第四頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

基因工程技術(shù)是核酸操作技術(shù)的一部分，只不過(guò)它強(qiáng)調(diào)了外源核酸分子在另一種不同的寄主細(xì)胞中的繁衍與性狀表達(dá)。事實(shí)上，這種跨越物種屏障、把來(lái)自其它生物的基因置于新的寄主生物細(xì)胞之中的能力，是基因工程技術(shù)區(qū)別于其它技術(shù)的根本特征。第五頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一第六頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一重組DNA技術(shù)回顧三大成就：第一，在20世紀(jì)40年代確定了遺傳信息的攜帶者、即基因的分子載體是DNA而不是蛋白質(zhì)——解決了遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)問(wèn)題；第二，50年代提出了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)制——解決了基因的自我復(fù)制和世代交替問(wèn)題；第七頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三，50年代末至60年代，相繼提出了“中心法則”和操縱子學(xué)說(shuō),成功地破譯了遺傳密碼——闡明了遺傳信息的流動(dòng)與表達(dá)機(jī)制。第八頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一重組DNA技術(shù)史上的主要事件年份事件1869FMiescher首次從萊茵河鮭魚(yú)精子中分離DNA。1957A.Kornberg從大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了DNA聚合酶I。1959-1960Ochoa發(fā)現(xiàn)RNA聚合酶和信使RNA，并證明mRNA決定了蛋白質(zhì)分子中的氨基酸序列。1961Nirenberg破譯了第一個(gè)遺傳密碼；Jacob和Monod提出了調(diào)節(jié)基因表達(dá)的操縱子模型。1964Yanofsky和Brenner等人證明，多肽鏈上的氨基酸序列與該基因中的核苷酸序列存在著共線性關(guān)系。1965Holley完成了酵母丙氨酸t(yī)RNA的全序列測(cè)定；科學(xué)家證明細(xì)菌的抗藥性通常由“質(zhì)?！盌NA所決定。第九頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一1966Nirenberg，Ochoa，Khorana，Crick等人破譯了全部遺傳密碼。1967第一次發(fā)現(xiàn)DNA連接酶1970Smith，Wilcox和Kelley分離了第一種限制性核酸內(nèi)切酶，Temin和Baltimore從RNA腫瘤病毒中發(fā)現(xiàn)反轉(zhuǎn)錄酶。1972-1973Boyer，Berg等人發(fā)展了DNA重組技術(shù)，于72年獲得第一個(gè)重組DNA分子，73年完成第一例細(xì)菌基因克隆。1975-1977Sanger與Maxam和Gilbert等人發(fā)明了DNA序列測(cè)定技術(shù)，1977年完成了全長(zhǎng)5387bp的噬菌體φx174基因組測(cè)定。1978首次在大腸桿菌中生產(chǎn)由人工合成基因表達(dá)的人腦激素和人胰島素。1980美國(guó)聯(lián)邦最高法院裁定微生物基因工程可以被專利化。1981Palmiter和Brinster獲得轉(zhuǎn)基因小鼠，Spradling和Rubin得到轉(zhuǎn)基因果蠅。1982美、英批準(zhǔn)使用第一例基因工程藥物——胰島素，Sanger等人完成了入噬菌體48,502bp全序列測(cè)定。第十頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一1983獲得第一例轉(zhuǎn)基因植物。1984斯坦福大學(xué)獲得關(guān)于重組DNA的專利。1986GMO首次在環(huán)境中釋放。1988Watson出任“人類基因組計(jì)劃”首席科學(xué)家。1989DuPont公司獲得轉(zhuǎn)腫瘤基因小鼠—“Oncomouse”。1992歐共體35個(gè)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合完成酵母第三染色體全序列測(cè)定(315kb)。1994第一批基因工程西紅柿在美國(guó)上市。1996完成了酵母基因組(1.25×107bp)全序列測(cè)定。1997英國(guó)愛(ài)丁堡羅斯林研究所獲得克隆羊。2000完成第一個(gè)高等植物擬南芥的全序列測(cè)定（(1.15×108bp)。2001完成第一個(gè)人類基因組全序列測(cè)定(2.7×109bp)。第十一頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一GMO-GeneticallyModifiedOrganismGMO，是“轉(zhuǎn)基因生物

(geneticallymodifiedorganism)”的縮寫(xiě)?！稗D(zhuǎn)基因”的意思是通過(guò)某種方式改變基因組，這種方式是自然、雜交或者重組無(wú)法達(dá)到的。雜交過(guò)程是一種基因重組的自然方法，把一個(gè)物種的花粉轉(zhuǎn)移到另一個(gè)相關(guān)物種上，從而獲得新的栽培變種。但是如果通過(guò)媒介幫助把基因轉(zhuǎn)移給其他植物，就不是自然過(guò)程而叫做轉(zhuǎn)基因。細(xì)胞融合也被稱為轉(zhuǎn)基因。相反，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)突變，如化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的植物則不是“轉(zhuǎn)基因體”。轉(zhuǎn)基因植物包含一個(gè)或者更多由人工手段引入的基因。甚至不相關(guān)物種的基因也可以通過(guò)這樣的方式被傳遞給其它物種。這樣一來(lái)，某種期望的特性，如對(duì)除草劑的忍耐力或者對(duì)昆蟲(chóng)的抵抗力就可以被準(zhǔn)確地賦予農(nóng)作物。第十二頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

限制性核酸內(nèi)切酶能夠識(shí)別DNA上的特定堿基序列并從這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)DNA分子。第一個(gè)核酸內(nèi)切酶EcoRI是Boyer實(shí)驗(yàn)室在1972年發(fā)現(xiàn)的，它能特異性識(shí)別GAATTC序列，將雙鏈DNA分子在這個(gè)位點(diǎn)切開(kāi)并產(chǎn)生具有粘性末端或平端的小片段。

（1）限制性核酸內(nèi)切酶第十三頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一幾種主要DNA內(nèi)切酶所識(shí)別的序列及其酶切末端第十四頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一DNA連接酶能把不同的DNA片段連接成一個(gè)整體。a.DNA的粘性末端;b.DNA的平末端;c.化學(xué)合成的具有EcoRI粘性末端的DNA片段。（2）DNA連接酶第十五頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

僅僅能在體外利用限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶進(jìn)行DNA的切割和重組，還不能滿足基因工程的要求，只有將它們連接到具備自主復(fù)制能力的DNA分子上，才能在寄主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖。具備自主復(fù)制能力的DNA分子就是分子克隆的載體（vector）。病毒、噬菌體和質(zhì)粒等小分子量復(fù)制子都可以作為基因?qū)氲妮d體。（3）分子克隆的載體第十六頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

重組DNA操作過(guò)程示意圖第十七頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一目的基因的表達(dá)第十八頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一第十九頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二十頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二十一頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一第二十二頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一DNA基本操作技術(shù)核酸凝膠電泳技術(shù)自從瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝膠被引入核酸研究以來(lái)，按分子量大小分離DNA的凝膠電泳技術(shù)，已經(jīng)發(fā)展成為一種分析鑒定重組DNA分子及蛋白質(zhì)與核酸相互作用的重要實(shí)驗(yàn)手段。

第二十三頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

一種分子被放置到電場(chǎng)中，它就會(huì)以一定的速度移向適當(dāng)?shù)碾姌O。我們把這種電泳分子在電場(chǎng)作用下的遷移速度，叫做電泳的遷移率，它與電場(chǎng)強(qiáng)度和電泳分子本身所攜帶的凈電荷數(shù)成正比，與片段大小成反比。第二十四頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

生理?xiàng)l件下，核酸分子中的磷酸基團(tuán)呈離子化狀態(tài)，所以，DNA和RNA又被稱為多聚陰離子（polyanions），在電場(chǎng)中向正電極的方向遷移。由于糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速度向正電極方向遷移。第二十五頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一瓊脂糖凝膠分辨DNA片段的范圍為0.2~50kb之間。聚丙烯酰胺凝膠的分辨范圍為1到1000個(gè)堿基對(duì)之間。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力就越強(qiáng)。第二十六頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一瓊脂糖及聚丙烯酰胺凝膠分辨DNA片段的能力

凝膠類型及濃度分離DNA的大小范圍（bp）

0.3%瓊脂糖50000~10000.7%瓊脂糖20000~10001.4%瓊脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1第二十七頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

在凝膠電泳中，加入溴化乙錠（ethidiumbromide，EtBr）染料對(duì)核酸分子進(jìn)行染色，然后放置在紫外光下觀察，可靈敏而快捷地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA的譜帶部位，即使每條DNA帶中僅含有0.05g的微量DNA，也可以被清晰地檢測(cè)出來(lái)。第二十八頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一溴化乙錠是一種具扁平分子的核酸染料，能插入到DNA或RNA分子的相鄰堿基之間，并在300nm波長(zhǎng)的紫外光照射下發(fā)出熒光。第二十九頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一溴化乙錠染料的化學(xué)結(jié)構(gòu)及其對(duì)DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙錠分子，在紫外光照射下，瓊脂糖凝膠電泳中DNA的條帶便呈現(xiàn)出橘黃色熒光，易于鑒定。

第三十頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三十一頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一細(xì)菌轉(zhuǎn)化與目標(biāo)DNA分子的增殖所謂細(xì)菌轉(zhuǎn)化，是指一種細(xì)菌菌株由于捕獲了來(lái)自另一種細(xì)菌菌株的DNA而導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變的生命過(guò)程。提供轉(zhuǎn)化DNA的菌株叫作供體菌株，接受轉(zhuǎn)化DNA的細(xì)菌菌株則被稱為受體菌株。

第三十二頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一轉(zhuǎn)化(transformation)

特指以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。轉(zhuǎn)染(transfection)

是指噬菌體、病毒或以它作為載體構(gòu)成的重組子導(dǎo)入細(xì)胞的過(guò)程。轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)

以噬菌體為媒介，將外源DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程。上述概念往往容易混淆。第三十三頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

轉(zhuǎn)化是一個(gè)自然存在的過(guò)程。細(xì)菌處于容易吸收外源DNA狀態(tài)叫感受態(tài)，用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作叫致敏過(guò)程。重組DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌的技術(shù)操作關(guān)鍵就是通過(guò)化學(xué)方法，人工誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)入一個(gè)敏感的感受態(tài)，以便外源DNA進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)。這項(xiàng)技術(shù)始于Mandel和Higa1970年的觀察，他們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌經(jīng)過(guò)冰冷的CaCl2溶液處理及短暫熱休克后，容易被λ噬菌體DNA感染，隨后Cohn于1972年進(jìn)一步證明質(zhì)粒DNA用同樣的方法也可進(jìn)入細(xì)菌。第三十四頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一轉(zhuǎn)化原理：將快速生長(zhǎng)中的大腸桿菌置于經(jīng)0℃預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，使細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面的復(fù)合物。

42℃下做短暫熱刺激，復(fù)合物便會(huì)被細(xì)胞所吸收。在全培養(yǎng)基中生長(zhǎng)一段時(shí)間使轉(zhuǎn)化基因?qū)崿F(xiàn)表達(dá)，就可涂布于選擇性培養(yǎng)基中分離轉(zhuǎn)化子。第三十五頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一λ噬菌體可以作為克隆載體第三十六頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一第三十七頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（PCR）首先將雙鏈DNA分子加熱分離成兩條單鏈，DNA聚合酶以單鏈DNA為模板并利用反應(yīng)混合物中的四種dNTP合成新生的DNA互補(bǔ)鏈。因?yàn)镈NA聚合酶需要有一小段雙鏈DNA來(lái)啟動(dòng)（“引導(dǎo)”）新鏈的合成，所以，新生DNA鏈的起點(diǎn)由寡核苷酸引物在模板DNA鏈兩端的退火位點(diǎn)所決定。第三十八頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

整個(gè)PCR反應(yīng)的全過(guò)程，即DNA解鏈（變性）、引物與模板DNA相結(jié)合（退火）、DNA合成（鏈的延伸）三步，可以被不斷重復(fù)。經(jīng)多次循環(huán)之后，反應(yīng)混合物中所含有的雙鏈DNA分子數(shù)，即兩條引物結(jié)合位點(diǎn)之間的DNA區(qū)段的拷貝數(shù)，理論上的最高值應(yīng)是2n。第三十九頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一PCR指數(shù)擴(kuò)增時(shí)循環(huán)次數(shù)與DNA產(chǎn)物數(shù)量的比較。第四十頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一主要步驟：將含有待擴(kuò)增DNA樣品的反應(yīng)混合物放置在高溫（>94℃）環(huán)境下加熱1分鐘，使雙鏈DNA變性，形成單鏈模板DNA。第四十一頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一

然后降低反應(yīng)溫度（約50℃），致冷1分鐘，使寡核苷酸引物與兩條單鏈模板DNA發(fā)生退火作用并結(jié)合在靶DNA區(qū)段兩端的互補(bǔ)序列位置上。第四十二頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一最后，將反應(yīng)混合物的溫度上升到72℃左右保溫1-數(shù)分鐘，在DNA聚合酶的作用下，從引物的3'-端加入脫氧核苷三磷酸，并沿著模板分子按5'→3'方向延伸，合成新生DNA互補(bǔ)鏈。第四十三頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一第四十四頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一實(shí)時(shí)定量PCR（Realtime-PCR）普通PCR擴(kuò)增產(chǎn)物總量變化大。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用帶熒光檢測(cè)的PCR儀對(duì)PCR過(guò)程DNA累積作出動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。熒光染料：SYBRGreenITaqMan探針第四十五頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一實(shí)時(shí)定量PCR（Realtime-PCR）第四十六頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建基因組DNA文庫(kù)構(gòu)建：把某種生物基因組DNA切成適當(dāng)大小，分別與載體組合，導(dǎo)入微生物細(xì)胞，形成克隆。匯集包含基因組中所有DNA序列的克隆，稱為基因組DNA文庫(kù)。常用載體：噬菌體；柯斯質(zhì)粒；BAC；PAC；YAC第四十七頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一RNA基本操作技術(shù)在DNA水平上分離真核生物的靶基因難度大：基因組DNA龐大；大量重復(fù)序列；有內(nèi)含子。而分離mRNAcDNA目的基因工作簡(jiǎn)單，速度快。但是，RNA分子：敏感，穩(wěn)定性差，某些基因的mRNA具有時(shí)相和轉(zhuǎn)錄的特殊性。第四十八頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一總RNA的提取1、操作要求高：選擇合適的時(shí)相、采用適當(dāng)?shù)臈l件與材料，避免降解。2、方法：Trizol法。由苯酚和異硫氰酸胍組成，可迅速破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使RNA釋放，并保持RNA完整。3、濃度和純度鑒定：通過(guò)OD260/OD280的比值來(lái)鑒定第四十九頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一mRNA的純化根據(jù)mRNA3’端具有polyA尾巴的特點(diǎn)，利用寡聚（dT）-纖維素柱色譜法純化獲得高純度的mRNA。第五十頁(yè)，共六十頁(yè)，編輯于2023年，星期一PolyATtractmRNA的分離純化過(guò)程簡(jiǎn)圖第五十一頁(yè)，共六十頁(yè)