高中生物競賽課件核酸的性質、研究方法和序列測定

核酸的性質和研究方法一般理化性質紫外吸收性質核酸結構的穩(wěn)定性核酸的變性核酸的復性核酸分子雜交和DNA芯片DNA的化學合成1、一般理化性質一、酸堿性：核酸的酸堿解離性質與核苷酸相似，但由于核酸為多聚核苷酸，含有大量的磷酸基團，pI較低，DNA的pI為4~4.5，RNA的pI為2~2.5二、溶解性：DNA純品為白色纖維狀固體，RNA純品為白色粉末。二者均微溶于水，不溶于一般有機溶劑，故常用乙醇從溶液中沉淀核酸三、黏度：DNA溶液的黏度極高，RNA溶液的黏度要小得多核酸的性質和研究方法大分子量的DNA很容易用棒挑起四、水解：核酸可被酸、堿或酶作用(糖苷鍵和磷酸酯鍵)，水解程度因水解條件而異酸水解首先生成無嘌呤酸（1）酸水解糖苷鍵和磷酸二酯鍵對酸的敏感性不同：嘌呤糖苷鍵

>

嘧啶糖苷鍵

>

磷酸酯鍵pH

1.6和室溫下對水透析，或100℃、pH

2.81

h，多數(shù)嘌呤堿基可脫落98%~100%甲酸(U的回收率低)，在175℃2

h，或三氟乙酸在155℃60~80

min，多數(shù)嘧啶堿基可脫落利用酸水解可以研究核酸的堿基組成1、一般理化性質核酸的性質和研究方法（2）堿水解RNA比DNA更容易被堿水解水解先生成2',3'-環(huán)核苷酸，后生成2'-和3'-核苷酸混合物NaOH、KOH,KOH最優(yōu)，0.3~1mol/L，室溫37℃18～24

h(RNA)1、一般理化性質核酸的性質和研究方法DNA對堿水解有一定的抗性，1mol/LNaOH，100℃，4

h,可得到寡聚脫氧核苷酸（2）堿水解RNA比DNA更容易被堿水解水解先生成2',3'-環(huán)核苷酸，后生成2'-和3'-核苷酸混合物NaOH、KOH,KOH最優(yōu)，0.3~1mol/L，室溫37℃18～24

h(RNA)1、一般理化性質核酸的性質和研究方法DNA對堿水解有一定的抗性，1mol/LNaOH，100℃，4

h,可得到寡聚脫氧核苷酸生理意義:DNA更穩(wěn)定，遺傳信息RNA是DNA的信使，完成任務后迅速降解。1、一般理化性質核酸的性質和研究方法（3）酶水解核糖核酸酶(RNase)、脫氧核糖核酸酶(DNase)、內切核酸酶、外切核酸酶（3'→5';5'→3')常用RNase:牛胰核糖核酸酶(RNaseI)，內切酶，水解產物為3'-嘧啶核苷酸和以3'-嘧啶核苷酸結尾的寡核苷酸核糖核酸酶T1，水解產物為3'-鳥嘌呤核苷酸和以3'-鳥嘌呤核苷酸結尾的寡核苷酸核糖核酸酶T2，作用于Ap殘基，將tRNA降解成以3'-腺苷酸為末端的寡核苷酸限制性內切核酸酶EcoRIEco(E.coli)、R(菌株)I

(該類酶編號)1、一般理化性質核酸的性質和研究方法（3）酶水解常用DNase:牛胰脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)，將單鏈或雙鏈DNA水解為平均長度為4

nt，以5'-磷酸為末端的寡聚核苷酸牛脾脫氧核糖核酸酶(DNaseII)，將單鏈或雙鏈DNA水解為平均長度為6

nt，以3'-磷酸為末端的寡聚核苷酸非特異性核酸酶，水解DNA和RNA蛇毒磷酸二酯酶，產物為5'-單核苷酸牛脾磷酸二酯酶，產物為3'-單核苷酸RNaseH水解與DNA形成雜交雙鏈的RNA核酸酶S1可水解DNA和RNA（單鏈）如何得到雙鏈cDNA??

mRNAmRNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNAcDNA逆轉錄酶RNaseH核酸酶S12、紫外吸收性質核酸的性質和研究方法核酸的嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)的共軛體系強烈吸收250~290

nm波段的紫外光，最高吸收峰接近260

nm，RNA與DNA的吸收光譜差別不大1、核酸樣品純度鑒定：260nm和280nm處吸光度(A)純DNA：A260nm/A280nm=1.8純RNA：A260nm/A280nm=2.0A260nm/A280nm比值降低(含蛋白質及苯酚)OD260的應用2、核酸定量：A260nm=1相當于50μg/mL雙鏈DNA40μg/mL單鏈DNA或RNA寡核苷酸20μg/mL3、判斷DNA是否變性2、紫外吸收性質核酸的性質和研究方法DNA的紫外吸收光譜2202402602800.10.20.30.4波長（nm）光吸收123增色效應(hyperchromiceffect)：核酸水解為核苷酸，或者變性后紫外吸收值增加的現(xiàn)象(2、3)1、天然DNA2、變性DNA3、核苷酸總光吸收原因：雙螺旋結構中，堿基有規(guī)律的緊密堆積降低了對紫外光的吸收減色效應：變性的核酸復性后紫外吸收減少氫

鍵3、核酸結構的穩(wěn)定性核酸的性質和研究方法螺旋內部的氫鍵：堿基對之間的氫鍵(堿基對的幾何構象和大小使其在螺旋內的距離適合形成氫鍵)，GC含量越多，越穩(wěn)定螺旋外部的氫鍵：戊糖-磷酸骨架上的親水基團與周圍的水分子之間形成RNA三級結構中的突環(huán)間堿基對之間的氫鍵3、核酸結構的穩(wěn)定性核酸的性質和研究方法堿基堆積力(主要)螺旋區(qū)：嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)上原子的范德華作用力環(huán)境中：水與雙螺旋的磷酸-戊糖骨架相互作用，內部堿基對高度疏水，使環(huán)境中的水在螺旋外圍形成水殼，有助于螺旋的穩(wěn)定堿基平面間的范德華作用力和疏水作用力統(tǒng)稱為堿基堆積力RNA單鏈區(qū)的堿基平面在距離合適時，也能形成堆積力堿基間相互作用的強度與相鄰堿基環(huán)之間重疊的面積成正比總趨勢：嘌呤之間>嘌呤與嘧啶之間>嘧啶之間堿基的甲基化也能提高堿基堆積力3、核酸結構的穩(wěn)定性核酸的性質和研究方法環(huán)境中的正離子螺旋區(qū)外側帶負電荷的磷酸基，在不與正離子結合的狀態(tài)下有靜電斥力，環(huán)境中帶正電荷的Na+，K+，Mg2+，Mn2+等離子，原核生物細胞內帶正電荷的多胺類，真核細胞中帶正電荷的組蛋白等，均可與磷酸基團結合，消除靜電斥力，對核酸結構的穩(wěn)定有重要作用4、核酸的變性(denaturation)核酸的性質和研究方法變性只涉及次級鍵的變化，磷酸二酯鍵的斷裂稱核酸降解雙鏈核酸的變性(denaturationofdouble-strandednucleicacid)指雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，空間結構破壞，形成單鏈無規(guī)線團狀態(tài)，從而引起核酸的物理化學性質和生物學功能的改變??的現(xiàn)象電鏡下的DNA部分變性核酸的性質和研究方法導致核酸變性的因素常用：熱變性和堿變性加熱、堿性pH、低離子強度、有機試劑(甲醛、甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺)等，均可破壞雙螺旋結構，引起核酸分子變性4、核酸的變性(denaturation)核酸的性質和研究方法變性引起的核酸理化性質的改變紫外吸收增加(檢測核酸變性的指標之一)4、核酸的變性(denaturation)核酸的性質和研究方法變性引起的核酸理化性質的改變紫外吸收增加(檢測核酸變性的指標之一)4、核酸的變性(denaturation)核酸的性質和研究方法變性引起的核酸理化性質的改變紫外吸收增加(檢測核酸變性的指標之一)DNA的浮力密度增加(變性后的DNA會像單鏈的RNA一樣，通過鏈內的互補堿基配對形成更加致密的結構)DNA溶液的黏度降低(雙螺旋是緊密的“剛性”結構，變性后代之以“柔軟”而松散的無規(guī)則單股線性結構，DNA黏度因此而明顯下降)離心時的沉降速度增加DNA分子的對稱性及分子局部的構象改變→DNA溶液的旋光性改變4、核酸的變性(denaturation)核酸是DNA：變性并不會使生物學功能喪失，反而利于生物學功能的發(fā)揮DNA的生物學功能是貯存、復制及轉錄遺傳信息，而遺傳信息是貯存在一級結構之中的，DNA在變性的時候，一級結構并沒有發(fā)生任何破壞無論是DNA復制，還是轉錄，第一步都需要DNA發(fā)生解鏈，這實際上就是DNA的變性(PCR的第一步反應就是熱變性)核酸的性質和研究方法變性引起的核酸理化性質的改變生物學功能？？（vs.

蛋白質）核酸的變性是雙螺旋結構的破壞，與核酸的生物學功能是否喪失沒有必然的聯(lián)系4、核酸的變性(denaturation)核酸是RNA，生物學功能直接由高級結構決定的RNA(tRNA、rRNA、snRNA、snoRNA和核酶)，一旦發(fā)生變性，就會像蛋白質一樣，生物學功能立刻喪失；核酸的性質和研究方法變性引起的核酸理化性質的改變生物學功能？？（vs.

蛋白質）核酸的變性是雙螺旋結構的破壞，與核酸的生物學功能是否喪失沒有必然的聯(lián)系4、核酸的變性(denaturation)核酸的性質和研究方法熔解溫度(meltingtemperature,Tm)DNA熱變性是個突變過程，將紫外吸收的增加量達最大增量一半時的溫度值稱熔解溫度(Tm)DNA稀鹽溶液加熱到一定溫度后，A260

nm驟然增加，兩條鏈開始分開；吸光度增加約40%，變化趨于平坦，兩條鏈完全分開Biochemistry.ConceptsandConnections.Pearson.2nd(2019)4、核酸的變性(denaturation)核酸的性質和研究方法影響熔解溫度(Tm)的因素1、DNA的均一性(兩種不同的含義)：均一性越高，Tm值范圍越窄序列的均一性：人工合成的poly[d(A-T)]或poly[d(G-C)]具有高度的均一性，Tm值范圍窄(變性時的氫鍵斷裂幾乎同時進行)待測樣品DNA的組成是否均一(否含有其他雜DNA的污染)：所測樣品中只含有一種DNA，Tm值范圍窄；混有其他來源的DNA，Tm值范圍變寬4、核酸的變性(denaturation)核酸的性質和研究方法影響熔解溫度(Tm)的因素Biochemistry.Jones&BartlettLearning(2014)2、G-C含量越高，Tm越大Tm=69.3+0.41(G+C)%(G+C)%=(Tm-69.3)×2.44

或馬默多蒂公式4、核酸的變性(denaturation)核酸的性質和研究方法影響熔解溫度(Tm)的因素3、離子強度低的介質中，Tm低溶液中的陽離子能夠中和或屏蔽DNA主鏈上磷酸基團的負電荷，減弱兩條鏈之間的排斥而增強DNA雙螺旋結構的穩(wěn)定性4、核酸的變性(denaturation)DNA的Tm值不是固定的核酸的性質和研究方法影響熔解溫度(Tm)的因素4、高pH，低Tm堿基失去質子而喪失形成氫鍵的能力5、甲酰胺、尿素、甲醛等變性劑可破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降4、核酸的變性(denaturation)核酸的性質和研究方法RNA的變性雙鏈RNA比雙鏈DNA穩(wěn)定，同樣序列的雙鏈RNA比雙鏈DNA的Tm高約20℃RNA-DNA雜合雙鏈的Tm介于雙鏈RNA和雙鏈DNA之間單鏈RNA通過回折形成局部雙螺旋，變性過程各區(qū)段逐漸解開雙螺旋，Tm較低4、核酸的變性(denaturation)5、核酸的復性(renaturation)核酸的性質和研究方法當各種變性因素不復存在的時候，變性時解開的互補單鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現(xiàn)象稱為復性(renaturation)5、核酸的復性(renaturation)核酸的性質和研究方法熱變性DNA一般經緩慢冷卻后即可復性，此過程稱為退火(annealing)當各種變性因素不復存在的時候，變性時解開的互補單鏈全部或部分恢復到天然雙螺旋結構的現(xiàn)象稱為復性(renaturation)復性后，核酸的紫外吸收降低，這種現(xiàn)象被稱作減色效應(hypochromiceffect)“成核”作用二級反應慢拉鏈式作用一級反應快DNA復性的第一步是兩個互補的單鏈分子間的接觸以啟動部分互補堿基的配對，稱為“成核”作用成核的堿基對經歷小范圍重排以后，單鏈的其他區(qū)域像“拉鏈”一樣迅速復性核酸的性質和研究方法影響復性速度的因素5、核酸的復性(renaturation)1、復性溫度不宜過低(碰撞機會小)，Tm-25℃為較適合的復性溫度2、單鏈片段濃度(越高，速度越快)3、單鏈片段長度(越短，速度越快)4、單鏈片段復雜度(越低，速度越快)5、溶液離子強度(維持溶液一定的離子強度，消除磷酸基負電荷造成的斥力，可加快復性速度)核酸的性質和研究方法影響復性速度的因素5、核酸的復性(renaturation)C0：單鏈的初始濃度t：復性的時間C0t1/2

：復性達一半時對應的C0t值，越小，復性速度越快單鏈片段濃度、長度、復雜度核酸的性質和研究方法核酸分子雜交(molecularhybridization)6、核酸分子雜交和DNA芯片在退火條件下，不同來源的DNA互補區(qū)形成雙鏈，或DNA單鏈和RNA單鏈的互補區(qū)形成DNA-RNA雜合雙鏈的過程稱分子雜交LehningerPrinciplesofBiochemistry.W.H.Freeman.6th(2013)核酸的性質和研究方法核酸分子雜交(molecularhybridization)6、核酸分子雜交和DNA芯片對天然或人工合成的DNA或RNA片段進行放射性同位素或熒光標記，或用特定的基團(生物素，地高辛)標記，做成探針，與待測物雜交后，檢測放射性同位素或熒光物質的位置，尋找與探針有互補關系的DNA或RNA常規(guī)操作探針種類：基因組探針cDNA探針RNA探針寡核苷酸探針生物素標記的底物加入磷酸化底物降解底物生成熒光物質變性雜交生物素標記的底物抗生物素抗體(偶聯(lián)有堿性磷酸酯酶)變性雜交生物素標記探針檢測核酸過程示意圖核酸的性質和研究方法核酸分子雜交(molecularhybridization)6、核酸分子雜交和DNA芯片帶有標記物而不影響其堿基配對特異性，便于分析雜交體為單鏈核酸，雙鏈核酸探針使用前需變性具有高度特異性，只與待測核酸雜交探針序列通常是基因編碼序列(非編碼序列特異性低)靈敏度高而穩(wěn)定，標記方法簡便而安全核酸探針需具備以下基本條件核酸的性質和研究方法核酸分子雜交(molecularhybridization)6、核酸分子雜交和DNA芯片原位雜交：直接用探針與菌落或組織細胞中的核酸雜交，不改變核酸所在的位置點雜交：將核酸直接點在膜上(點膜器、真空抽氣裝置)狹縫印跡雜交：使用狹縫點樣器點樣電泳分離后再雜交：Southern印跡雜交(檢測DNA)Northern印跡雜交(檢測RNA)雜交類型Southern印跡雜交(檢測DNA)Southern印跡雜交(檢測DNA)Northern印跡雜交(檢測RNA)區(qū)別：電泳后常用堿溶液處理凝膠使DNA變性，RNA容易被堿水解，常用甲醛、羥甲基汞或戊二醛作為變性劑應用：Southern雜交常用于測定基因拷貝數(shù)，基因定位，研究基因變異，基因重排，DNA多態(tài)性分析和疾病診斷Northern雜交常用于檢測組織或細胞的基因表達水平核酸的性質和研究方法DNA芯片(DNAchip)6、核酸分子雜交和DNA芯片以核酸的分子雜交為基礎要點：預先將成千上萬種相關基因(如多種與癌癥相關的基因)的探針整齊地排列在特定的基片上，形成陣列，將待測樣品的DNA切割成碎片，用熒光基團標記，與芯片進行分子雜交，激光掃描儀對基片上的每個點進行檢測，若某個探針所對應的位置出現(xiàn)熒光，說明樣品中存在相應的基因一個芯片上可容納成千上萬個探針，可對樣本進行高通量的檢測應用：測定基因的表達譜，測定基因型、基因突變和多態(tài)性LehningerPrinciplesofBiochemistry.W.H.Freeman.6th(2013)目標序列貼于硅玻片表面的反應基團最初無反應活性，經光處理，具有活性遮光板加入具有反應活性的核苷酸A(5'-OH被封閉)光處理解除封閉的5'-OHDNA芯片的制備LehningerPrinciplesofBiochemistry.W.H.Freeman.6th(2013)青蛙發(fā)育的兩個不同階段的細胞中收集mRNA樣本逆轉錄制備cDNA探針，每個樣本的cDNA探針帶有不同顏色的熒光標記混合的cDNA探針與微陣列雜交綠點表示在單細胞階段mRNA表達(更多)；紅點在發(fā)育后期表達(更多)；黃點表示在發(fā)育過程中變化不大的mRNA核酸的性質和研究方法固相磷酰亞胺法7、DNA的化學合成固相載體：可控孔徑玻璃微球(CPG)基團保護劑:苯甲?；?bz)：腺嘌呤和胞嘧啶堿基上的氨基異丁?；?Ib)：鳥嘌呤堿基的氨基二甲氧三苯甲基(DMT)：5'-羥基活化劑和縮合劑：二異丙基亞磷酰胺衍生物基團保護①第一個核苷酸5'-OH用二甲氧三苯甲基(DMT)保護，通過3'-OH固定于可控孔徑玻璃微球②脫保護基：用二氯乙酸或三氯乙酸水解脫去5'-OH上的保護基(DMT)③偶聯(lián)：二異丙基亞磷酰胺衍生物作為活化劑(活化下一核苷酸的3'-OH)和縮合劑，在弱堿性化合物四唑催化下與前一核苷酸5'-OH偶聯(lián)形成亞磷酸三酯(連有氰乙基)注意：下一個核苷酸事先進行基團保護(氨基，羥基)終止反應：加入乙酸酐使未參與偶聯(lián)反應的5'-OH均被乙?；?，以免與以后加入的核苷酸反應，出現(xiàn)錯誤序列DNA鏈允許中途終止，但不能有序列錯誤氰乙基④氧化作用：合成的亞磷酸三酯用碘溶液氧化，使之成為較穩(wěn)定的磷酸三酯重復②→④按事先設計的程序合成DNA鏈，待合成結束后硫酚和三乙胺脫掉保護基，氰乙基，并用氨水將合成的全長寡核苷酸水解下來，高效液相色譜(HPLC)和凝膠電泳純化并鑒定方向：3'→5'核酸的序列測定鏈終止法測序技術新一代高通量測序技術核酸的序列測定1、鏈終止法測序技術Sanger測序技術基礎：(電泳技術)①凝膠電泳分離DNA片段時，小片段移動快，大片段移動慢，用適當?shù)姆椒煞蛛x大小僅差1個核苷酸的DNA片段核酸的序列測定1、鏈終止法測序技術Sanger測序技術基礎：(電泳技術)①凝膠電泳分