食品化學(xué)實驗報告

Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量

一、目的掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法，熟悉分光光度計的操作。二、原理Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin試劑）還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物），顏色深一、目的

掌握Folin-酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法，熟悉分光光度計的操作。

二、原理

Folin-酚試劑法包括兩步反應(yīng)：第一步是在堿性條件下，蛋白質(zhì)與銅作用生成蛋白質(zhì)-銅絡(luò)合物；第二步是此絡(luò)合物將磷鉬酸-磷鎢酸試劑（Folin試劑）還原，產(chǎn)生深藍(lán)色（磷鉬藍(lán)和磷鎢藍(lán)混合物），顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法操作簡便，靈敏度比雙縮脲法高100倍，定量范圍為5～100μg蛋白質(zhì)。Folin試劑顯色反應(yīng)由酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸引起，因此樣品中若含有酚類、檸檬酸和巰基化合物均有干擾作用。此外，不同蛋白質(zhì)因酪氨酸、色氨酸含量不同而使顯色強(qiáng)度稍有不同。

三、實驗材料、主要儀器和試劑

1．實驗材料

綠豆芽下胚軸（也可用其它材料如面粉）

2．儀器

（1）722型（或721型）分光光度計

（2）4000r/min的離心機(jī)

（3）分析天平

（4）容量瓶（50mL）

（5）量筒

（6）移液管（0.5mL、1mL、5mL）

3．試劑（純度均為分析純）

（1）0.5mol/LNaOH

(2)試劑甲：

（A）稱取10gNa2CO3，2gNaOH和0.25g酒石酸鉀鈉，溶解后用蒸餾水定容至500mL。

（B）稱取0.5gCuSO4·5H2O，溶解后用蒸餾水定容至100mL。每次使用前將（A）液50份與（B）液1份，即為試劑甲，其有效期為1d，過期失效。

（3）試劑乙：

在1.5L容積的磨口回流器中加入100g鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）和700mL蒸餾水，再加50mL85％磷酸和100mL濃鹽酸充分混勻，接上回流冷凝管，以小火回流10h。回流結(jié)束后，加入150g硫酸鋰和50mL蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開口繼續(xù)沸騰15min，驅(qū)除過量的溴，冷卻后溶液呈黃色（倘若仍呈綠色，再滴加數(shù)滴液體溴，繼續(xù)沸騰15min）。然后稀釋至1L，過濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存，使用前大約加水1倍，使最終濃度相當(dāng)于1mol/L。

四、操作步驟

1．標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

（1）配制標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液：在分析天平上精確稱取0.0250g結(jié)晶牛血清白蛋白，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，燒杯內(nèi)的殘液用少量蒸餾水沖洗數(shù)次，沖洗液一并倒入容量瓶中，用蒸餾水定容至100mL，則配成250μg/mL的牛血清白蛋白溶液。

（2）系列標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白溶液的配制：取6支普通試管，按表1加入標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛血清白蛋白溶液和蒸餾水，配成一系列不同濃度的牛血清白蛋白溶液。然后各加試劑甲5mL，混合后在室溫下放置10min，再各加0.5試劑乙，立即混合均勻（這一步速度要快，否則會使顯色程度減弱）。30min后，以不含蛋白質(zhì)的1號試管為對照，用722型分光光度計于650nm波長下測定各試管中溶液的光密度并記錄結(jié)果。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：以牛血清白蛋白含量（μg）為橫坐標(biāo)，以光密度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2．樣品的提取及測定

（1）準(zhǔn)確稱取綠豆芽下胚軸1g，放入研缽中，加蒸餾水2mL，研磨勻漿。將勻漿轉(zhuǎn)入離心管，并用6mL蒸餾水分次將研缽中的殘渣洗入離心管，離心4000r/min、20min。將上清液轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，作為待測液備用。

（2）取普通試管2支，各加入待測溶液1mL，分別加入試劑甲5mL，混勻后放置10min，再各加試劑乙0.5mL，迅速混勻，室溫放置30min，于650nm波長下測定光密度，并記錄結(jié)果。

五、結(jié)果計算

計算出兩重復(fù)樣品光密度的平均值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出相對應(yīng)的蛋白質(zhì)含量X（μg），再按下列公式計算樣品中蛋白質(zhì)的百分含量。

六、附注

（1）進(jìn)行測定時，加Folin試劑要特別小心，因為Folin試劑僅在酸性pH條件下穩(wěn)定，但此實驗的反應(yīng)只是在pH10的情況下發(fā)生，所以當(dāng)加試劑乙（Folin試劑）時，必須立即混勻，以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞之前即能發(fā)生還原反應(yīng)，否則會使顯色程度減弱。

（2）本法也可用于游離酪氨酸和色氨酸含量測定。

七、思考題

1．含有什么氨基酸的蛋白質(zhì)能與Folin-酚試劑呈藍(lán)色反應(yīng)？

2．測定蛋白質(zhì)含量除Folin-酚試劑顯色法以外，還可以用什么方法？

參考答案

1．含有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸）能與Folin-酚試劑反應(yīng)呈藍(lán)色，因為Folin-酚試劑在堿性溶液中極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原為藍(lán)色化合物（鉬蘭和鎢蘭混合物）。磷酸鹽緩沖液定容至2.00ml。在A0和B0試管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液，上述四支試管都置于37℃水浴中保溫。3、在各試管中吸入2.00ml1%酪蛋白溶液，在37℃下保溫10min(準(zhǔn)確計時)后，再向A1和B1試管中吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液。4、獎試管從水浴中取出，在室溫下放置1h，用少量上清液潤濕濾紙后過濾，保留濾出液。5、在280nm波長下，分別以A0和B0濾液為空白，測定A1和B1濾液的吸光度。三、實驗試劑①微生物蛋白酶萃取液（0.01g/ml）:稱取1.0g酶制劑，加100ml蒸餾水?dāng)嚢?0min，在4℃下離心分離后，將上層清夜置于冰箱中保存，使用前稀釋一定倍數(shù)；②0.02mol/L磷酸鹽緩沖液（PH7.5）；③1%酪蛋白溶液：取1.0g酪蛋白，加100ml0.2mol/L磷酸鹽緩沖液（PH7.5），加熱并攪拌使它完全分散，然后置于冰箱中保存；④5%三氯醋酸（TCA）溶液。四、計算1、在規(guī)定的實驗條件下，以每分鐘增加0.001吸光度定義為一個酶單位。2、每克酶制劑中沒活力的計算：?A×1000/(t×w)酶活力單位/克酶制劑式中，?A——樣品與空白吸光度差值（即A1和B1的吸光值）；t——酶作用時間（本實驗為10min）;w——反應(yīng)中酶的用量，g五、說明1、微生物蛋白酶粗提取液在較寬廣的PH范圍表現(xiàn)出活力，但是在接近中性條件下最有最高活力。2、微生物蛋白酶在45℃以下可保持較長時間的穩(wěn)定性。六、數(shù)據(jù)記錄與處理A1=0.279B1=0.573酶含量為0.001g/ml酶活力1=?A×1000/(t×w)=0.279×1000/10/0.001/0.20=1.395×105酶活力單位/克酶制劑酶活力2=?A×1000/(t×w)=0.573×1000/10/0.001/0.40=1.4325×105酶活力單位/克酶制劑平均值=（1.395×105+1.4325×105）=141375酶活力單位/克酶制劑平均相對相差=（143250-139500）/141375×100%=2.65%七、思考題1、蛋白酶有哪幾類？答：①按蛋白酶水解蛋白質(zhì)的方式：A內(nèi)肽酶：切開蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵，生成相對分子質(zhì)量較小的多肽類；B外肽酶：切開蛋白質(zhì)或多肽分子氨基或羧基末端的肽鍵，而游離出氨基酸的酶類；C水解蛋白質(zhì)或多肽的酯鍵；D水解蛋白質(zhì)或多肽的酰胺鍵。②按酶的來源可分為：動物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物蛋白酶③微生物蛋白酶又可分為：細(xì)菌蛋白酶、霉菌蛋白酶、酵母蛋白酶和放線菌蛋白酶④按蛋白酶作用的最適PH可以分為（A）PH2.5~5.0的酸性蛋白酶，（B）PH9.5~10.5的堿性蛋白酶，（C）PH7~8的中性蛋白酶2、影響酶活力的因素有哪些？答：酶活力是酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的速率來表示的。酶活力的大小即酶含量的多少，可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來表示，酶活力的測定也就是測定酶促反應(yīng)的速率。①酶濃度對酶活力的影響：酶促反應(yīng)速率與酶分子的濃度呈正比，在一定范圍內(nèi)，當(dāng)?shù)孜锓肿訚舛茸銐驎r，酶分子越多，底物轉(zhuǎn)化的速度越快。②底物濃度對酶活力的影響：若酶的濃度為定值，底物的起始濃度越低時，酶促反應(yīng)速度與底物濃度呈正比，即隨地物濃度的增加而增加。當(dāng)所有的酶與底物結(jié)合生成中間產(chǎn)物后，即使再增加底物濃度，中間產(chǎn)物濃度也不會增加，酶促反應(yīng)速度也不會增加。③溫度對酶活力的影響：在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)速度隨溫度升高而增加，超過最適反應(yīng)溫度，酶活力將會下降。④PH對酶活力的影響：酶在最適PH范圍內(nèi)表現(xiàn)出活性，大于或小于最適PH，都會降低酶活性。⑤激活劑對酶活力的影響：某些無機(jī)陽離子、陰離子、有機(jī)化合物可作為激活劑，能夠激活酶，使其表現(xiàn)出催化活性或強(qiáng)化其催化活性。⑥抑制劑對酶活力的影響：酶的抑制劑能夠減弱、抑制甚至破壞