實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)一蛋白質(zhì)含量測(cè)定第1頁/共27頁1掌握紫外吸收法、Folin－酚試劑法（Lowry法）和考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法

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掌握分光光度計(jì)的原理和使用方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡?頁/共27頁①有多少樣品可供分析;②蛋白質(zhì)樣品濃度大約是多少;③樣品中含有哪些可能影響定量的化學(xué)物質(zhì)；④所選方法是否簡(jiǎn)單、可靠；⑤含量測(cè)定的專一性要求是否很高。選擇合適的蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法主要基于幾點(diǎn)考慮：第3頁/共27頁常用的方法物理性質(zhì)：紫外吸收法化學(xué)性質(zhì)：Folin－酚試劑法（Lowry法），BCA法（Bicinchoninicacid法），凱氏定氮法，雙縮脲法（Biuret法），膠體金測(cè)定法，等等染色性質(zhì)：考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）、銀染法測(cè)定絕對(duì)含量應(yīng)用凱氏定氮法（蛋白質(zhì)的含氮量為16％）。第4頁/共27頁蛋白質(zhì)在紫外光區(qū)（190nm-360nm）有兩個(gè)強(qiáng)烈吸收峰：280nm和190nm。280nm有吸收的電子所需能量較少，因?yàn)檫@些光子存在于芳香環(huán)的共軛雙鍵中，色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香環(huán)，可吸收280nm波長(zhǎng)的光子，苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）也有微弱吸收。蛋白質(zhì)的吸收強(qiáng)度與上述幾種氨基酸的含量有關(guān)，因此相同濃度的不同種類蛋白質(zhì)，其280nm的吸收值差別很大(圖1)。紫外吸收法第5頁/共27頁圖1.蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收光譜圖A是15μg/ml蛋白的吸收光譜。圖A中插圖是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明膠(G)的吸收光譜，緩沖液為：0.01%Brij35,0.1MK2SO4,5mMKH2PO4,pH7。圖B是10μg/mlRNA和DNA的吸收光譜。第6頁/共27頁肽鍵在190nm有強(qiáng)吸收峰。一般分光光度計(jì)在190nm的光強(qiáng)較弱，且O2在此波長(zhǎng)有吸收，因此通常使用205nm或210nm波長(zhǎng)，Trp,Phe,Tyr,His,Cys,Met,andArg的側(cè)鏈在此波長(zhǎng)有吸收。優(yōu)點(diǎn)：靈敏，較穩(wěn)定。缺點(diǎn):干擾因素多。許多化學(xué)物質(zhì)特別是含C＝C雙鍵和C＝O雙鍵的物質(zhì)在此波長(zhǎng)范圍有吸收，所以必須嚴(yán)格控制反應(yīng)條件。紫外吸收法第7頁/共27頁優(yōu)點(diǎn)：不需添加任何試劑，因而對(duì)樣品沒有任何破壞；測(cè)量極其簡(jiǎn)單迅速；蛋白濃度和吸光度是線性關(guān)系，容易計(jì)算。適合測(cè)試純度較高、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。

紫外吸收法第8頁/共27頁缺點(diǎn)：干擾測(cè)定的影響因素多，尤其是RNA和DNA在此波長(zhǎng)均有強(qiáng)吸收,所以一定要考慮樣品中是否有核酸.要得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，必須嚴(yán)格控制樣品溶液的pH和化學(xué)組成，使待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)驗(yàn)條件一致。敏感度低，要求樣品的濃度較高，量較大。用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白質(zhì)含量時(shí)，對(duì)于那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，誤差較大。

紫外吸收法第9頁/共27頁管號(hào)01234567標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液（ml）01.01.52.02.53.04.00雙蒸水（ml）4.03.02.52.01.51.000蛋白質(zhì)含量(mg/ml)00.250.3750.50.6250.751.0

未知蛋白溶液（ml）-------4.0A280

操作步驟紫外吸收法第10頁/共27頁考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）原理：該方法由Bradford于1976年建立。在酸性條件下，考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合后最大光吸收波長(zhǎng)由465nm（紅色）轉(zhuǎn)移為595nm（藍(lán)色），起作用的主要氨基酸是Arg，另外，His,Lys,Tyr,Trp和Phe也有作用。2－5min呈最大光吸收，至少可穩(wěn)定1小時(shí)第11頁/共27頁簡(jiǎn)便,迅速，靈敏度較高。只需要一種反應(yīng)試劑影響因素較少。去污劑和兩性物質(zhì)對(duì)測(cè)定有干擾小于3000Da

的多肽無法測(cè)定蛋白濃度高時(shí)非線性配制的染色液需過濾除去未溶解的考馬斯亮藍(lán)G250考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）第12頁/共27頁實(shí)驗(yàn)操作步驟

室溫放置5分鐘后測(cè)595nm的光吸。考馬斯亮藍(lán)染料極易吸附于比色皿壁，每次測(cè)量后應(yīng)用乙醇洗滌后，用雙蒸水清洗。注意混勻，但不要?jiǎng)×艺鹗帯?/p>

考馬斯亮藍(lán)染色法（Bradford法）第13頁/共27頁原理：Folin-酚試劑法的顯色試劑由試劑甲和試劑乙組成。試劑甲中的Cu2+堿性條件下與肽鍵形成絡(luò)合物并被還原成Cu+。Cu+以及蛋白質(zhì)中的Tyr等的側(cè)鏈基團(tuán)與試劑乙反應(yīng)，試劑乙中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的Tyr和Phe殘基還原，產(chǎn)生藍(lán)色化合物（鉬蘭和鎢蘭的混合物），顯色反應(yīng)在30分鐘內(nèi)接近極限。顏色深淺與蛋白含量成正比，可在640nm下測(cè)光吸收。

Folin-酚試劑法（Lowry法）第14頁/共27頁酸、銅離子螯合劑（如EDTA、檸檬酸等）、還原劑（如巰基乙醇、DTT、苯酚等）干擾本反應(yīng)。不同蛋白質(zhì)主要因其所含的Tyr含量不同而呈現(xiàn)不同的吸收強(qiáng)度。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加試劑乙時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)試劑乙加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，試劑配制較繁瑣。Folin-酚試劑法（Lowry法）第15頁/共27頁實(shí)驗(yàn)步驟

01234567標(biāo)準(zhǔn)蛋白（1mg/ml）ul02040801201602000待測(cè)樣品ul-------200蒸餾水ul1000980960920880840800800Folin-酚試劑甲ml44444444混勻，于室溫放置10分鐘Folin-酚試劑乙ul250250250250250250250250迅速混勻，30℃水浴保溫30分鐘A640Folin-酚試劑法（Lowry法）第16頁/共27頁試劑、實(shí)驗(yàn)材料：

（已放在每個(gè)試驗(yàn)臺(tái)的架子上）

標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：1mg/mlBSA未知蛋白溶液考馬斯亮藍(lán)染色液Folin-酚試劑甲Folin-酚試劑乙第17頁/共27頁Lowry法的改進(jìn)法。堿性條件下，蛋白分子中的肽鍵與Cu2+形成絡(luò)合物，并將Cu2+還原成Cu+；Cu+與BCA結(jié)合成紫色復(fù)合物，在562nm處吸收值與濃度呈正比BCA法第18頁/共27頁與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡(jiǎn)單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測(cè)可達(dá)到0.5μg/ml），應(yīng)用更加靈活?？赡褪芨哌_(dá)5%的表面活性劑測(cè)定不同蛋白樣品時(shí)比bradford測(cè)定法結(jié)果均一BCA法第19頁/共27頁常用的測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的比較方法測(cè)定范圍（μg/ml）不同種類蛋白的差異最大吸收波長(zhǎng)(nm)特點(diǎn)凱氏定氮法小標(biāo)準(zhǔn)方法，準(zhǔn)確，操作麻煩，費(fèi)時(shí)，靈敏度低，適用于標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定紫外吸收法100—1000大280205靈敏度稍低，快速，不消耗樣品，核酸類物質(zhì)有影響雙縮脲法1000—10000小540重復(fù)性、線性關(guān)系好，靈敏度低，測(cè)定范圍窄，樣品需要量大Folin-酚試劑法20—500大500-750靈敏，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)，干擾物質(zhì)多考馬氏亮藍(lán)G-25050—500大595靈敏度高，穩(wěn)定，誤差較大，顏色會(huì)轉(zhuǎn)移BCA20—2000大562靈敏度高，穩(wěn)定，干擾因素少，費(fèi)時(shí)較長(zhǎng)第20頁/共27頁1、由于各種方法測(cè)定原理不同，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度可能會(huì)有較大差異。2、即使是用同一種比色法測(cè)定同一樣品，選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。3、所有的樣品（包括標(biāo)準(zhǔn)樣品），都必須在規(guī)定時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過長(zhǎng)，得到的吸光值會(huì)有變化，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度不符。注意第21頁/共27頁722型光柵分光光度計(jì)光源單色器樣品池光電源件讀數(shù)單元測(cè)量完畢，請(qǐng)把光度計(jì)的蓋打開！講解完畢后，每個(gè)組出一個(gè)同學(xué)去127聽老師講解儀器使用。第22頁/共27頁TU1800紫外可見分光光度計(jì)波長(zhǎng)范圍：200－1100nm測(cè)光系統(tǒng)：?jiǎn)喂馐δ苤笜?biāo)：光度測(cè)量光譜掃描定量測(cè)量鎢燈：340－1100nm氘燈：200－340nm第23頁/共27頁1測(cè)紫外吸收要用石英比色皿！2定量實(shí)驗(yàn)取液要準(zhǔn)確。3從低濃度到高濃度依次測(cè)量，比色皿不要潤(rùn)洗。因此3ml溶液足夠測(cè)定。4測(cè)量完畢，請(qǐng)把光度計(jì)的蓋打開！5每次實(shí)驗(yàn)時(shí)提交上一次的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。注意事項(xiàng)第24頁/共27頁實(shí)驗(yàn)報(bào)告原始數(shù)據(jù)需老師簽字，附在實(shí)驗(yàn)報(bào)告上。真實(shí)記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并標(biāo)出未知溶液的蛋白含量。可以進(jìn)行各種軟件繪圖。單位、標(biāo)示要清楚第25頁/共27頁