實驗二補骨脂黃酮體的提取分離及鑒定

實驗二補骨脂黃酮體的提取分離及鑒定第1頁/共27頁實驗二、補骨脂黃酮體的提取、分離及鑒定第2頁/共27頁實驗目的和要求掌握補骨脂黃酮體的提取分離原理及操作：

溶劑法提取、聚酰胺柱色譜分離熟悉黃酮類化合物在聚酰胺上的吸附規(guī)律與結構的相互關系。第3頁/共27頁不同層析系統(tǒng)原理硅膠：是根據(jù)物質(zhì)在硅膠上的吸附力不同而得到分離，硅膠為極性吸附劑，化合物的極性越強，吸附劑對其吸附能力就越強；洗脫劑的極性越大，其洗脫能力就越強。聚酰胺：由酰胺鍵聚合形成的高分子化合物。當所分離化合物的結構與聚酰胺形成氫鍵的能力越強，其吸附越強，越難洗脫。其用途比較廣，基本上各種類型化合物都能使用。第4頁/共27頁聚酰胺具有“雙重色譜”性能之故，即其分子中既有非極性的脂肪鏈，又有極性的酰胺基團，當用極性移動相（如含水溶劑系統(tǒng)）洗脫時，聚酰胺作為非極性固定相，其色譜行為類似反相分配色譜，因黃酮苷比游離黃酮極性大，所以苷比游離黃酮容易洗脫。當用有機溶劑（如氯仿-甲醇）洗脫時，聚酰胺作為極性固定相，其色譜行為類似正相分配色譜，因游離黃酮的極性比黃酮苷小，所以游離黃酮比黃酮苷容易洗脫。第5頁/共27頁

聚酰胺“雙重色譜”原理

正相色譜反相色譜聚酰胺：極性固定相（極性酰胺基團）非極性固定相（非極性脂肪鏈）洗脫劑：有機溶劑（氯仿-甲醇，極性?。┖軇状?水，極性大）先洗脫：游離黃酮（苷元，極性小）苷（極性大）（柱色譜分離）

Rf值：苷元>苷苷元<苷（TLC色譜鑒別）***上述規(guī)律也適用于黃酮類化合物在聚酰胺薄層上的行為。苷與苷元聚酰胺色譜第6頁/共27頁聚酰胺層析系統(tǒng)原理

其酰胺基可與酚羥基、羧基、羰基、硝基等形成氫鍵吸附。第7頁/共27頁聚酰胺是分離黃酮類化合物的比較理想的吸附劑，其吸附強度主要取決于黃酮類化合物分子中酚羥基的數(shù)目、位置以及溶劑與黃酮類化合物或與聚酰胺之間形成氫鍵締合能力的大小。黃酮類化合物從聚酰胺色譜柱上洗脫大致遵循下列規(guī)律：第8頁/共27頁A.化合物中酚羥基數(shù)目越多，被聚酰胺吸附越牢，越難洗脫。酚羥基數(shù)目相同時，聚酰胺對鄰位羥基吸附弱于間、對位，容易洗脫。B.共軛系統(tǒng)多的形成氫鍵能力強，因此黃酮類化合物骨架不同，聚酰胺的吸附能力也不同，吸附能力從小到大依次為：異黃酮<二氫黃酮<黃酮<黃酮醇第9頁/共27頁C.有分子內(nèi)氫鍵的羥基吸附弱.D.苷元相同，洗脫順序一般是：叁糖苷，雙糖苷，單糖苷，苷元第10頁/共27頁黃酮定義：兩個苯環(huán)（A與B環(huán)）通過三個碳原子相互聯(lián)結而成的一系列化合物。（C6-C3-C6）母核：2—苯基色原酮分布：多存在于高等植物中，是數(shù)量最多的天然酚性化合物。OO123645781'2'3'4'5'6'第11頁/共27頁性質(zhì)1．酸性（1）來源：酚羥基（數(shù)目、位置）（2）酸性規(guī)律

a、7，4‘-OH酸性強于其他位置羥基的酸性（處于羰基對位，羰基的共軛誘導）。

b、5-OH酸性最弱（處于羰基鄰位，形成分子內(nèi)氫鍵）。

c、酚羥基數(shù)目越多，酸性越強。第12頁/共27頁應用：pH梯度法分離

7，4′-OH>7或4′-OH>其他位-OH>5-OHNaHCO3

+---Na2CO3++--NaOH++++第13頁/共27頁2.堿性：

γ-吡喃酮環(huán)1-氧原子

微弱堿性（孤對電子，接受質(zhì)子）

僅溶于強的、濃酸+水（濃硫酸）

烊鹽（呈色） 應用 初步鑒別黃酮母核類型：黃酮、黃酮醇——黃~橙色，并有熒光二氫黃酮——橙紅（冷）、紫紅（熱）查耳酮——橙紅~洋紅異黃酮（二氫）——黃色橙酮——紅~洋紅第14頁/共27頁顯色反應

1．還原顯色反應反應類型鑒別特征鑒別意義備注

鹽酸-鎂粉黃酮、二氫黃酮、紅~紫紅黃酮類特征性假陽性反應黃酮醇、二氫黃酮醇紅~紫紅鑒別反應（花色素）（最常用）查耳酮、橙酮、（-）兒茶素類、異黃酮（-）

四氫硼鈉二氫黃酮、二氫黃酮醇紅~紫紅二氫黃酮類特有還原反應其它黃酮類（-）

鈉汞齊反應黃酮、二氫黃酮紅異黃酮、二氫異黃酮紅黃酮醇類黃~淡紅色二氫黃酮醇類棕黃色第15頁/共27頁2.與金屬鹽類試劑的絡合反應：

三氯化鋁反應：4′或7，4′-OH黃酮顯天藍色熒光。第16頁/共27頁補骨脂-化學成份補骨脂是一些高等生物中發(fā)現(xiàn)的雜多環(huán)式化合物，補骨脂主要含黃酮類、香豆素類、單萜酚類等成分。1.黃酮類包括補骨脂二氫黃酮(補骨脂甲素、補骨脂乙素)、補骨脂雙氫黃酮甲醚、異補骨脂雙氫黃酮、補骨脂查耳酮、異補骨脂查耳酮、新補骨脂查耳酮、補骨脂異黃酮、新補骨脂異黃酮、補骨脂異黃酮醛等。2.香豆素類包括補骨脂內(nèi)酯、異補骨脂內(nèi)酯(異補骨脂素白芷素)、補骨脂定、異補骨脂定、雙羥異補骨脂定。3.單萜酚類如補骨脂酚。4.其他尚含補骨脂醛、豆甾醇、β-谷甾醇葡萄糖苷、脂肪油、葡萄糖、揮發(fā)油、生物堿等。第17頁/共27頁補骨脂甲素(coryfolin)：分子量324.36。無色針狀結晶，mp.191～192℃。補骨脂乙素(isobavachalcone)：分子量324.36。黃色片狀結晶，mp.166～167℃。第18頁/共27頁二氫黃酮類：2、3位雙鍵被氫化而成。第19頁/共27頁補骨脂甲素、乙素結構差異補骨脂甲素補骨脂乙素二氫黃酮和查爾酮，異戊烯基取代位置不同使得兩者的極性差異第20頁/共27頁補骨脂乙素次生代謝產(chǎn)物轉換查爾酮二氫黃酮雙鍵斷裂與-OH形成環(huán)合第21頁/共27頁提取分離流程圖第22頁/共27頁新購聚酰胺通常有兩種雜質(zhì)：一種是蠟質(zhì)（錦綸絲在制成以后，表面涂有一層蠟）。另一種是原料單體及其小分子聚合物。這些雜質(zhì)必須除去，否則原料單體及其小分子聚合物可與酚類物質(zhì)形成復合物。第23頁/共27頁聚酰胺前處理方法聚酰胺以90-95%乙醇浸泡，不斷攪拌，除去氣泡后裝入柱中。用3-4倍體積的90-95%乙醇洗脫。再依次用2-2.5倍體積5%NaOH水溶液、1倍體積的蒸餾水、2-2.5倍體積的10%醋酸水溶液洗脫，最后用蒸餾水洗脫至pH中性第24頁/共27頁堿提酸沉法

黃酮類化合物易溶于堿水，難溶于酸水，因而可用稀堿水溶液提取，酸化使黃酮類化合物沉淀析出，達到純化的目