基因工程操作程序

(3)DNA末端:限制酶切割DNA產(chǎn)生的DNA末端有兩種形式:______和_______.2.DNA連接酶----”分子縫合針”(1)作用:將雙鏈DNA____,恢復(fù)被限制酶切開的兩個核苷酸之間的______.(2)種類:①E.coliDNA連接酶:只能縫合DNA的_____②T4DNA連接酶:既可縫合DNA的

,又可縫合雙鏈DNA的_______.平末端粘性末端片段磷酸二酯鍵粘性末端粘性末端平末端第一頁，共89頁。3.基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體----”分子運輸車”(1)載體的種類①質(zhì)粒:是一種裸露的,結(jié)構(gòu)簡單,獨立于細(xì)菌染色體之外,并能夠自我_____能力的雙鏈______DNA分子;②______的衍生物;③________.(2)載體的特點①能夠在細(xì)胞內(nèi)_______;②有一個或多個____切割位點,便于供源DNA的插入.③具有_____基因,供重組DNA的鑒定和選擇.復(fù)制環(huán)狀噬菌體動植物病毒穩(wěn)定復(fù)制限制酶標(biāo)記第二頁，共89頁?！?.2

基因工程的基本操作程序第三頁，共89頁?；蚬こ膛嘤瓜x棉的簡要過程：普通棉花(無抗蟲特性)蘇云金芽孢桿菌提取抗蟲基因與運載體DNA拼接導(dǎo)入棉花細(xì)胞(含抗蟲基因)棉花植株(有抗蟲特性)思考:轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的大致培育過程?第四頁，共89頁。第五頁，共89頁。一、目的基因的獲取目的基因主要是編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因現(xiàn)代獲取方法：1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因3、化學(xué)方法人工合成初始目的基因的來源從自然界中已有的物種中分離出來用人工方法合成例如：與生物抗逆性相關(guān)的基因、與優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因、與生物藥物和保健品相關(guān)的基因、與毒物降解相關(guān)的基因、以及與工業(yè)所需用酶相關(guān)的基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子。第六頁，共89頁。1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子啟動子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷，它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位，有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA，最終獲得蛋白質(zhì)終止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷，能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄第七頁，共89頁。1、原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子RNA聚合酶:能夠識別啟動子上結(jié)合位點的一種蛋白質(zhì).第八頁，共89頁。RNA聚合酶能夠識別調(diào)控序列中的結(jié)合位點，并與其結(jié)合。轉(zhuǎn)錄開始后，RNA聚合酶沿DNA分子移動，并以DNA分子的一條鏈為模板合成RNA。轉(zhuǎn)錄完畢后，RNA鏈釋放出來，緊接著RNA聚合酶也從DNA模板鏈上脫落下來。第九頁，共89頁。①不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA，不能編碼蛋白質(zhì)。：能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA，能編碼蛋白質(zhì)編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)②有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列.包括啟動子和終止子非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游啟動子終止子第十頁，共89頁。2、真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子外顯子能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子不能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做內(nèi)含子啟動子終止子編碼區(qū)上游編碼區(qū)下游內(nèi)含子：外顯子：真核細(xì)胞的一個基因的編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄出mRNA前體，需把其中的內(nèi)含子切除，外顯子拼接成成熟mRNA。第十一頁，共89頁。真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用的核苷酸序列，包括位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點（啟動子）。非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子第十二頁，共89頁。原核細(xì)胞真核細(xì)胞不同點編碼區(qū)是_____的編碼區(qū)是間隔的、_____的相同點都由能夠編碼蛋白質(zhì)的______和具有調(diào)控作用的______區(qū)組成的3、原核細(xì)胞與真核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu)比較思考編碼相同數(shù)目氨基酸的蛋白質(zhì)，原核細(xì)胞與真核細(xì)胞編碼區(qū)結(jié)構(gòu)一樣長嗎？連續(xù)不連續(xù)編碼區(qū)非編碼第十三頁，共89頁。啟動子起始密碼/終止子/終止密碼存在分子：作用：DNA(基因)啟動/終止轉(zhuǎn)錄mRNA起始/終止翻譯mRNA中存在啟動子/終止子的序列嗎？第十四頁，共89頁。外顯子內(nèi)含子與RNA聚合酶結(jié)合位點編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點編碼區(qū)原核生物基因真核生物基因第十五頁，共89頁。1、從基因文庫中獲取目的基因

將含有某種生物不同基因的許多DNA片斷，導(dǎo)入到受體菌的群體中，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。

基因文庫

基因組文庫部分基因文庫(CDNA文庫)第十六頁，共89頁。基因文庫的類型基因組文庫和部分基因文庫第十七頁，共89頁?；蛭膸斓臉?gòu)建第十八頁，共89頁。反轉(zhuǎn)錄法mRNAcDNA(互補DNA)雙鏈DNA反轉(zhuǎn)錄酶DNA聚合酶第十九頁，共89頁。依據(jù)：目的基因已知的部分核苷酸序列①將目的基因已知的核苷酸序列用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，作為探針，配制成探針液.是一段帶有檢測標(biāo)記且序列已知的與目的基因互補的單鏈DNA序列。第二十頁，共89頁。②將硝酸纖維膜蓋在培養(yǎng)有該種基因文庫菌落的培養(yǎng)基上，將菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后使DNA暴露、變性成單鏈固定在膜上。硝酸纖維膜經(jīng)過處理使DNA暴露變性成單鏈固定在膜上第二十一頁，共89頁。③將第一步準(zhǔn)備好的探針和其混合，讓兩種DNA鏈雜交。④將x光片放在膜上，讓其放射自顯影，經(jīng)過沖洗這時有放射性的部位X光片上會出現(xiàn)的黑斑。第二十二頁，共89頁。③將第一步準(zhǔn)備好的探針和其混合，讓兩種DNA鏈雜交。④將x光片放在膜上，讓其放射自顯影，經(jīng)過沖洗這時有放射性的部位X光片上會出現(xiàn)的黑斑。第二十三頁，共89頁。③將第一步準(zhǔn)備好的探針和其混合，讓兩種DNA鏈雜交。④將x光片放在膜上，讓其放射自顯影，經(jīng)過沖洗這時有放射性的部位X光片上會出現(xiàn)的黑斑。⑤根據(jù)這個黑斑對應(yīng)的位置就可以找到培養(yǎng)基中的菌落，然后從該菌落中提取目的基因就可以。第二十四頁，共89頁。①將目的基因已知的部分核苷酸序列用放射性同位素進(jìn)行標(biāo)記，作為探針。②將硝酸纖維膜蓋在培養(yǎng)有該種基因文庫菌落的培養(yǎng)基上，將菌落轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，然后使DNA暴露、變性成單鏈固定在膜上。③將第一步準(zhǔn)備好的探針和其混合，讓兩種DNA鏈雜交。④將x光片放在膜上，讓其放射自顯影，經(jīng)過沖洗這時有放射性的部位X光片上會出現(xiàn)的黑斑。⑤根據(jù)這個黑斑對應(yīng)的位置就可以找到培養(yǎng)基中的菌落，然后從該菌落中提取目的基因就可以。如何從基因文庫中獲取目的基因？

第二十五頁，共89頁。某生物體內(nèi)全部DNA許多DNA片段受體菌群體限制酶與運載體連接導(dǎo)入基因組文庫某種生物某個時期的mRNAcDNA反轉(zhuǎn)錄受體菌群體與運載體連接導(dǎo)入部分基因文庫（cDNA文庫）第二十六頁，共89頁?；蚪M文庫和部分基因組文庫(cDNA文庫)比較第二十七頁，共89頁。依據(jù)：目的基因的有關(guān)信息。如：根據(jù)基因的核苷酸序列基因的功能基因在染色體上的位置基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA基因翻譯產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性從基因文庫中得到目的基因的方法第二十八頁，共89頁。2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，在生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)?？梢栽诙虝r間大量擴增目的基因。第二十九頁，共89頁。①概念：PCR全稱為_______________，是一項在生物____復(fù)制___________的核酸合成技術(shù)③條件：___________、_______________、___________、___________

.

②原理：__________聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體外特定DNA片段DNA雙鏈復(fù)制模板DNA四種脫氧核苷酸DNA引物熱穩(wěn)定DNA聚合酶利用PCR擴增目的基因第三十頁，共89頁。循環(huán)變性退火延伸第三十一頁，共89頁。④過程：a、DNA變性（90℃-95℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，_____斷裂，形成___________b、退火（復(fù)性55℃-60℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，合成與模板互補的________。氫鍵單鏈DNA雙鏈DNA鏈第三十二頁，共89頁。IMN(1)PCR——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一項生物體外復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)。通過此技術(shù)，可在短時間內(nèi)獲取大量的目的基因。利用PCR技術(shù)擴增目的基因模板DNA；合成引物；四種脫氧核苷酸；DNA聚合酶等。(2)原理：DNA雙鏈復(fù)制(3)前提：一段已知目的基因的核苷酸序列(4)條件：(5)過程：變性、退火、延伸三步曲(6)結(jié)果：以指數(shù)形式擴增第三十三頁，共89頁。細(xì)胞內(nèi)復(fù)制

PCR擴增DNA母鏈4種dNTPTaqDNA聚合酶引物（2個snDNA）溫度控制1）模板：2）原料：3）酶：DNA母鏈4種dNTP解旋酶DNA聚合酶引物酶DNA連接酶DNA增殖4）特點:半保留復(fù)制邊解旋邊復(fù)制(不用DNA連接酶)半保留復(fù)制全解旋再復(fù)制第三十四頁，共89頁。3.人工合成：——根據(jù)已知的核苷酸序列合成DNA第三十五頁，共89頁。二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建——核心第三十六頁，共89頁。質(zhì)粒目的基因限制酶處理一個切口兩個黏性末端兩個切口獲得目的基因DNA連接酶表達(dá)載體同一種1.過程:第三十七頁，共89頁。a、使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在并遺傳給子代b、同時使目的基因能表達(dá)和發(fā)揮作用思考：作為基因工程表達(dá)載體，只需含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？2、基因表達(dá)載體的作用第三十八頁，共89頁。3.基因表達(dá)載體的組成：它們有什么作用？a、目的基因b、啟動子c、終止子d、標(biāo)記基因是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段，位于基因的首端,是RNA聚合酶識別和結(jié)合部位，驅(qū)動基因的轉(zhuǎn)錄位于基因的末端,也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的DNA片段終止轉(zhuǎn)錄鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有含有目的基因的細(xì)胞篩選出來第三十九頁，共89頁。常用的受體細(xì)胞：

有大腸桿菌、枯草桿菌、土壤農(nóng)桿菌、酵母菌和動植物細(xì)胞等。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的原理借鑒細(xì)菌或病毒侵染細(xì)胞的途徑。三、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞第四十頁，共89頁。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞----農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞，并在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)第四十一頁，共89頁。農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法適用于雙子葉植物裸子植物第四十二頁，共89頁。適用于單子葉植物基因槍法第四十三頁，共89頁?；ǚ酃芡ǖ婪ㄟm用于被子植物第四十四頁，共89頁。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射技術(shù)提純基因表達(dá)載體體外顯微注射入受精卵受精卵移植第四十五頁，共89頁。顯微注射技術(shù)第四十六頁，共89頁。將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞1.將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法2.將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞顯微注射技術(shù)3.將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞Ca2+處理：用Ca2+處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子第四十七頁，共89頁。四、目的基因的檢測與鑒定檢測—鑒定——①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA

上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定等DNA分子雜交分子雜交（注意與上不同之處）抗原—抗體雜交分子檢測法個體生物學(xué)水平的鑒定第四十八頁，共89頁。14N14N變性變性DNA分子雜交技術(shù)放射性同位素等標(biāo)記的DNA分子探針15N15N基因探針：轉(zhuǎn)基因生物的DNA第四十九頁，共89頁。DNA分子雜交示意圖采用一定的技術(shù)手段，將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起，如果這兩個單鏈具有互補的堿基序列，那么，互補的堿基序列就會結(jié)合在一起，形成雜合雙鏈區(qū)；在沒有互補堿基序列的部位，仍然是兩條游離的單鏈。第五十頁，共89頁?；蛱结槪且欢螏в袡z測標(biāo)記，且序列已知的，與目的基因互補的核酸序列。基因探針通過分子雜交與目的基因結(jié)合，產(chǎn)生雜交信號，能從浩翰的基因組中把目的基因顯示出來。1、制備探針有哪些方法？2、探針需帶有一定的標(biāo)記，可以用什么方法？3、基因探針有哪些用途？第五十一頁，共89頁。第五十二頁，共89頁。14N轉(zhuǎn)基因生物的mRNA探針分子雜交技術(shù)變性15N15N第五十三頁，共89頁?；蚬こ痰幕静僮鞒绦蚰康幕虻墨@取基因表達(dá)載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞目的基因的檢測與鑒定1、從基因文庫中獲取目的基因2、利用PCR技術(shù)擴增目的基因3、化學(xué)方法人工合成復(fù)制原點+目的基因+啟動子+終止子+標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍法、花粉管通道法、顯微注射法、Ca2+處理法DNA分子雜交技術(shù)、分子雜交技術(shù)、抗原—抗體雜交技術(shù)分子檢測外的個體水平鑒定第五十四頁，共89頁。鞏固練習(xí):1.人們常選用的細(xì)菌質(zhì)粒分子往往帶有一個抗生素抗性基因,該抗性基因的主要作用是()A.提高受體細(xì)胞在自然環(huán)境中的耐藥性B.有利于對目的基因是否導(dǎo)入進(jìn)行檢測C.增加質(zhì)粒分子的分子量D.便于與外源基因連接2.在遺傳工程技術(shù)中,限制性內(nèi)切酶主要用于()A.目的基因的提取和導(dǎo)入B.目的基因的提取和檢測C.目的基因與載體的結(jié)合和導(dǎo)入D.目的基因的提取與載體結(jié)合BD第五十五頁，共89頁。3.在遺傳工程技術(shù)中,下列何種目的基因一般以直接分離的方法獲得A.人的胰島素基因B.蠶的蠶絲蛋白基因C.芽孢桿菌的抗蟲基因D.菜豆儲藏蛋白基因4.1976年,美國的科學(xué)家首次將人的生長抑制素釋放因子的基因轉(zhuǎn)移到大腸桿菌,并獲得了表達(dá),此文中的表達(dá)是指該基因在大腸桿菌A.能進(jìn)行DNA復(fù)制B.能傳遞給細(xì)菌后代C.能合成生長抑制素釋放因子D.能合成人的生長素CC第五十六頁，共89頁。5．下列有關(guān)基因工程技術(shù)的正確敘述是（）A．重組DNA技術(shù)所用的工具酶是限制酶、連接酶和載體B．所有的限制酶都只能識別同一種特定的核苷酸序列C．選用細(xì)菌作為重組質(zhì)粒的受體細(xì)胞是因為細(xì)菌繁殖快D．只要目的基因進(jìn)入了受體細(xì)胞就能成功實現(xiàn)表達(dá)C

6.在基因工程中，把選出的目的基因（共1000個脫氧核苷酸對，其中腺嘌呤脫氧核苷酸460個），放入DNA擴增儀中擴增4代，那么，在擴增儀中應(yīng)放入胞嘧啶脫氧核苷酸的個數(shù)是A．540個B．7560個C．8100個D．17280個C第五十七頁，共89頁。7．多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種體外迅速擴增DNA片段的技術(shù)。PCR過程一般經(jīng)歷下述三十多次循環(huán)：95℃下使模板DNA變性、解鏈→55℃下復(fù)性（引物與DNA模板鏈結(jié)合）→72℃下引物鏈延伸（形成新的脫氧核苷酸鏈）。下列有關(guān)PCR過程的敘述中不正確的是（）A．變性過程中破壞的是DNA分子內(nèi)堿基對之間的氫鍵，也可利用解旋酶實現(xiàn)B．復(fù)性過程中引物與DNA模板鏈的結(jié)合是依靠堿基互補配對原則完成C．延伸過程中需要DNA聚合酶、ATP、四種核糖核苷酸D．PCR與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相比所需要酶的最適溫度較高C

第五十八頁，共89頁。8.2003年在中國大地上最慘烈的事件就是“非典”侵襲、肆虐著人體的健康，奪取了許多人寶貴的生命。醫(yī)院人滿為患，“非典”與“發(fā)熱”、“疑似”混雜在一起，讓醫(yī)生難以區(qū)分。我國科學(xué)工作者日夜奮戰(zhàn)，利用基因工程迅速研制出“非典”診斷盒。其作用機理是

（

）A．治療“非典”利用的是抗原—抗體反應(yīng)B．診斷“非典”利用的是DNA分子雜交原理C．診斷“非典”利用的是抗原—抗體反應(yīng)D．治療“非典”利用的是DNA分子雜交原理B第五十九頁，共89頁。9.有關(guān)基因工程的敘述正確的是（）A.限制性內(nèi)切酶只在獲得目的基因時才用B.重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C.質(zhì)粒都可作運載體D.蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料

D第六十頁，共89頁。10.關(guān)于內(nèi)含子和外顯子的說法正確的是（）A.內(nèi)含子和外顯子在轉(zhuǎn)錄的過程中都能夠轉(zhuǎn)錄成成熟的mRNA

B.只有外顯子能夠轉(zhuǎn)錄成mRNA，tRNA，rRNA

C.原核細(xì)胞基因中也有內(nèi)含子和外顯子

D.由于內(nèi)含子不能編碼蛋白質(zhì)，故它屬于非編碼區(qū)B第六十一頁，共89頁。11.天然釀酒酵母菌通常缺乏分解淀粉的酶類，用作發(fā)酵原料的淀粉需經(jīng)一系列復(fù)雜的轉(zhuǎn)化過程才能被利用。研究者從某絲狀真菌中獲取淀粉酶基因并轉(zhuǎn)入釀酒酵母菌，獲得的釀酒酵母工程菌可直接利用淀粉產(chǎn)生酒精。請回答下列問題：⑴將淀粉酶基因切割下來所用的工具是____________，用___________將淀粉酶基因與載體拼接成新的DNA分子，下一步將該DNA分子___________，以完成工程菌的構(gòu)建。⑵若要鑒定淀粉酶基因是否插入釀酒酵母菌，可采用的檢測方法是____________；若要鑒定淀粉酶基因是否翻譯成淀粉酶，可采用___________________檢測。限制酶

DNA連接酶

導(dǎo)入酵母菌DNA分子雜交

抗原一抗體雜交

第六十二頁，共89頁。12.利用動物乳腺生產(chǎn)產(chǎn)品的技術(shù)稱為動物乳腺反應(yīng)器技術(shù)2005年我省青島“嶗山奶山羊乳腺生物反應(yīng)器的研制”項目通過鑒定，該項目生產(chǎn)的藥用蛋白具有表達(dá)效率高、成本低、安全性高、易于分離純化的優(yōu)點，可產(chǎn)生乙肝表面抗原及抗凝血酶Ⅲ等醫(yī)藥產(chǎn)品，造福人類健康。下圖為利用生物技術(shù)獲得生物這一新品種和抗蟲棉的過程，據(jù)圖回答：⑴在基因工程中，A表示

，如果直接從蘇云金桿菌中獲得抗蟲基因，①過程使用的酶區(qū)別于其他酶的特點是

，B表示

。目的基因

重組DNA

一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，并且在特定的位點上切割DNA分子

第六十三頁，共89頁。⑵在研究過程中，研究人員首先從相關(guān)基因組中獲取了目的基因，并采用____

技術(shù)對目的基因進(jìn)行了擴增，然后將目的基因與質(zhì)粒等載體組合形成了重組載體。在重組載體的構(gòu)建過程中需要的工具酶有___________________⑶基因表達(dá)載體的構(gòu)建是基因工程的核心，一個完整的基因表達(dá)載體至少包括哪些部分?

。⑷將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過程中，在③過程中一般是采用

，在②過程中一般采用

，受體細(xì)胞一般是

。PCR限制酶、DNA連接酶

目的基因、啟動子、終止子、標(biāo)記基因農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法

顯微注射技術(shù)

受精卵第六十四頁，共89頁。⑸由于轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)物存在于山羊的乳汁中，檢測其體內(nèi)是否出現(xiàn)藥用蛋白，在分子水平上的檢測方法及結(jié)果是什么?⑹要確定目的的基因（抗蟲基因）導(dǎo)入棉花細(xì)胞后，是否能穩(wěn)定遺傳并表達(dá)，需進(jìn)行檢測和鑒定工作，請寫出在個體水平上的鑒定過程：從轉(zhuǎn)基因羊的乳汁中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進(jìn)行抗原—抗體雜交

如果出現(xiàn)雜交帶，表明奶牛中出現(xiàn)了抗原蛋白；如果不出現(xiàn)雜交帶，表明奶牛中未出現(xiàn)抗原蛋白.

讓害蟲吞食轉(zhuǎn)基因棉花的葉子，觀察害蟲的存活情況，以確定其是否具有抗蟲性狀

第六十五頁，共89頁。13.已知SARS是由一種RNA病毒感染所引起的疾病。SARS病毒表面的S蛋白是主要的病毒抗原，在SARS病人康復(fù)后的血清中有抗S蛋白的特異性抗體。某研究小組為了研制預(yù)防SARS病毒的疫苗，開展了前期研究工作。其簡要的操作流程如下：第六十六頁，共89頁。(1)實驗步驟①所代表的反應(yīng)過程是_______。第六十七頁，共89頁。(2)步驟②構(gòu)建重組表達(dá)載體A和重組表達(dá)載體B必須使用限制性內(nèi)切酶和______酶，后者的作用是將用限制性內(nèi)切酶切割的_______和_____連接起來。(3)如果省略步驟②而將大量擴增的S基因直接導(dǎo)入大腸桿菌，一般情況下，不能得到表達(dá)的S蛋白，其原因是S基因在大腸桿菌中不能_____，也不能__________。第六十八頁，共89頁。(4)為了檢驗步驟④所表達(dá)的S蛋白是否與病毒S蛋白有相同的免疫反應(yīng)特征，可用____與_____進(jìn)行抗原—抗體特異性反應(yīng)實驗，從而得出結(jié)論。(5)步驟④和⑥的結(jié)果相比，原核細(xì)胞表達(dá)的S蛋白與真核細(xì)胞表達(dá)的S蛋白的氨基酸序列________(相同，不同)，根本原因是________________。第六十九頁，共89頁。【答案】

(1)逆轉(zhuǎn)錄(2)DNA連接載體S基因(3)復(fù)制合成S基因的mRNA(4)大腸桿菌中表達(dá)的S蛋白SARS康復(fù)病人血清(5)相同表達(dá)蛋白質(zhì)所用的基因相同第七十頁，共89頁。

(2)動植物細(xì)胞除去內(nèi)含子第七十一頁，共89頁。體驗高考1.（09浙江卷）下列關(guān)于基因工程的敘述，錯誤的是A．目的基因和受體細(xì)胞均可來自動、植物或微生物B．限制性核酸內(nèi)切酶和DNA連接酶是兩類常用的工具酶C．人胰島素原基因在大腸桿菌中表達(dá)的胰島素原無生物活性D．載體上的抗性基因有利于篩選含重組DNA的細(xì)胞和促進(jìn)目的基因的表達(dá)D第七十二頁，共89頁。體驗高考2.（09安徽卷）將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉(zhuǎn)入真核生物細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)就會帶有綠色熒光。綠色熒光蛋白在該研究中的主要作用是A．追蹤目的基因在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程B．追蹤目的基因插入到染色體上的位置C．追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布D．追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)C第七十三頁，共89頁。3：(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（1）獲得耐鹽基因后，構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的

處，DNA連接酶作用于

處。（填“a”或“b”）第七十四頁，共89頁。(2008理綜山東卷)為擴大可耕地面積，增加糧食產(chǎn)量，黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注。我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系。（2）將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和

法。（3）由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用

技術(shù)，該技術(shù)的核心是

和

。（4）為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素標(biāo)記的

作探針進(jìn)行分子雜交檢測，又要用

方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性。第七十五頁，共89頁。答案：（1）aa（2）基因槍法（花粉管通道法）（3）植物組織培養(yǎng)（1分）脫分化（去分化）再分化（4）耐鹽基因（目的基因）一定濃度鹽水澆灌（移栽到鹽堿地中）第七十六頁，共89頁。4．(2009年安徽高考題)2008年諾貝爾化學(xué)獎授予了“發(fā)現(xiàn)和發(fā)展了水母綠色熒光蛋白”的三位科學(xué)家。將綠色熒光蛋白基因的片段與目的基因連接起來組成一個融合基因，再將該融合基因轉(zhuǎn)入真核生物細(xì)胞內(nèi)，表達(dá)出的蛋白質(zhì)就會帶有綠色熒光。綠色熒光蛋白在該研究中的主要作用是()A．追蹤目的基因在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過程B．追蹤目的基因插入到染色體上的位置C．追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布D．追蹤目的基因編碼的蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)C第七十七頁，共89頁。5．(2008年高考上海卷)以重組DNA技術(shù)為核心的基因工程正在改變著人類的生活。請回答下列問題：(1)獲得目的基因的方法通常包括________和________。(2)切割和連接DNA分子所使用的酶分別是________________和______________。第七十八頁，共89頁。(3)運送目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞的載體一般選用病毒或____________，后者的形狀呈________。(4)由于重組DNA分子成功導(dǎo)入受體細(xì)胞的頻率________，所以在轉(zhuǎn)化后通常需要進(jìn)行________操作。(5)將人胰島素基因分別導(dǎo)入大腸桿菌與酵母菌，從兩者中生產(chǎn)的胰島素在功能和________序列上是相同的。第七十九頁，共89頁?！敬鸢浮?/p>

(1)化學(xué)合成(人工合成)酶切獲取(從染色體DNA分離/從生物細(xì)胞分離)(2)限制性核酸內(nèi)切酶(限制酶)DNA連接酶(連接酶)(3)質(zhì)粒小型環(huán)狀(雙鏈環(huán)狀、環(huán)狀)(4)低篩選(5)氨基酸第八十頁，共89頁。6.(2008年海南高考)右圖為某種質(zhì)粒表達(dá)載體簡圖，小箭頭所指分別為限制