維氏氣單胞菌TH0426株fis基因的克隆及生物信息學(xué)分析

III1前言維氏氣單胞菌（Aeromonasveronii）是近年來新發(fā)現(xiàn)的革蘭氏陰性菌，在自然界中普遍存在，是感染人獸及水生動物的一種重要病原菌。該菌普遍存在于淡水、污水，土壤乃至海水中，其中一部分菌株是微生態(tài)環(huán)境中正常存在的，也有一些菌株具有致病性，主要感染變溫動物，如中華絨螯蟹、泥鰍、錦鯉，斑點叉尾鲴等，會引起大量死亡；近年來，國內(nèi)維氏氣單胞菌引發(fā)的水產(chǎn)疾病呈上升趨勢，如泥鰍[1]、烏鱧[2]及鯰[3]等因感染維氏氣單胞菌而出現(xiàn)腹水或出血等癥狀，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。此外，維氏氣單胞菌還能通過水源、傷口感染等途徑進行傳播，引起人類的腸胃炎、食物中毒等[4]。維氏氣單胞菌對恒溫動物是一種機會致病菌，但有人認為免疫功能健全者也可被感染，通?；颊甙l(fā)生急性腹瀉，也可能引起菌血癥、腦膜炎和心內(nèi)膜炎等[5-6]。近目前，A．veronii在食品安全上也表現(xiàn)出重要的意義，研究表明污染的畜禽肉類、水產(chǎn)品和蔬菜等均是A．veronii的重要傳染源，因此一些國家已把A．veronii及其同屬菌作為水體質(zhì)量和食品安全的檢疫對象[7-9]；當前，人們也逐漸認識到水產(chǎn)品質(zhì)量安全以及水體環(huán)境污染等問題的重要性，細菌的流行與暴發(fā)也同樣困擾著水產(chǎn)養(yǎng)殖人員[10]。此外，許多大型水產(chǎn)養(yǎng)殖場也被A．veronii破壞,隨著對A．veronii的了解越來越多，大量抗生素的投入使細菌的耐藥性不斷增加,尤其重要的是研究A．veronii的致病過程，可以有效幫助人們根據(jù)癥狀制定有針對性的治療方案。因此，研究細菌的毒力基因作為揭示細菌致病機制的重要手段，為開發(fā)新型疫苗并解決水產(chǎn)相關(guān)問題提供了新方向[10]。fis基因為Ⅵ型分泌系統(tǒng)AAA+家族ATP酶，其家族其他成員參與多種細胞過程。Neuwald[11]等人基于仔細的和多個序列比對，于1999年提出了包括經(jīng)典AAA家族的更廣泛的AAA+家族，之后進一步發(fā)現(xiàn)AAA+家族蛋白質(zhì)通常執(zhí)行類似伴侶的功能，有助于蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝，操作或拆卸。Teru等人探究了AAA+家族蛋白的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該家族蛋白質(zhì)特征：有結(jié)構(gòu)保守性的是約250個氨基酸的中央ATPase結(jié)構(gòu)域（稱為AAA+模塊）。Nahar等[12]人發(fā)現(xiàn)AAA家族蛋白Cdc48-Ubx2復(fù)合物通過調(diào)節(jié)底物的泛素化狀態(tài)來調(diào)節(jié)線粒體外膜蛋白Fzo1轉(zhuǎn)化。Li[13]等人發(fā)現(xiàn)AAA+ATP酶TER94可以與桿狀病毒早期蛋白LEF3和解旋酶相互作用，以轉(zhuǎn)運并進一步募集與病毒復(fù)制相關(guān)的蛋白以建立病毒復(fù)制工廠。Khong[14]等人發(fā)現(xiàn)AAA家族ATPasep97/VCP的喪失導(dǎo)致nockdown細胞的肌動蛋白動力學(xué)降低，細胞運動性受損，RhoA蛋白水平升高，參與了蛋白酶體依賴性蛋白降解途徑。而AAA+家族ATP酶fis基因在A.veronii中未見報道。相信通過了解基因在A.veronii的作用將會對我們探究其致病機制有所幫助。國內(nèi)研究A.veronii的科研人員不斷增多，但是大多數(shù)為分離鑒定菌株，藥敏試驗以及常規(guī)的理化分析，關(guān)于致病機制的報道不是很多，深入探究基因功能的報道也是更為稀少[27]。本實驗通過克隆fis基因片段及進行生物學(xué)分析，來研究其功能和特征，為進一步揭示致病機理提供幫助，從而可以實變fis基因降低維氏氣單胞菌致病性的理想，為制備維氏氣單胞菌基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。2材料2.1菌株及質(zhì)粒載體A.veroniiTH0426菌株由本實驗室保存；大腸桿菌感受態(tài)TransT1菌株均由筆者所在實驗室保存。pEASY-BluntZeroCloningKit質(zhì)粒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。2.2實驗主要試劑購自寶生物工程(大連)有限公司的T4DNA連接酶、DNAMarker、細菌DNA提取試劑盒、PBS緩沖液、DNA凝膠回收試劑盒、克隆載體pMD18-T；購自北京全式金生物技術(shù)公司的廣譜蛋白Marker、預(yù)染彩虹蛋白Marker；購自康為世紀生物科技(北京)有限公司的質(zhì)粒小提試劑盒2.3實驗主要儀器購自蘇州凈化設(shè)備的超凈工作臺；購自德國Eppendorf公司的移液器，梯度PCR儀；購自杭州博日科技公司的恒溫金屬?。毁徸陨虾＼S進醫(yī)療公司的恒溫培養(yǎng)箱；購自金壇新寶儀器公司的恒溫搖床；購自上海菁華科技儀器公司的分光光度計；購自日本Panasonic公司的-40°C冰箱與高壓滅菌器；購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的實時熒光定量PCR儀；購自美國Thermo公司的酶標儀及核酸分析儀；購自德國Sigma公司的低溫高速離心機。3.方法3.1引物的合成查閱相關(guān)文獻得知維氏氣單胞菌TH0426全基因組序列，fis基因的序列從基因庫中獲得，利用Primer5.0軟件設(shè)計一對特異性引物，上游引物P1:ATGGAGCAAGCCCTCGCAT，下游引物P2:TCAGTTCACCTCCAGTTTCTGA。由吉林省庫美生物科技有限公司合成引物，而實時熒光定量PCR引物由寶生物工程（大連）公司負責(zé)設(shè)計合成。3.2fis基因的擴增先對實驗室保藏的A.veroniiTH0426進行活化，之后通過劃線將菌株的菌液接種于RS平板上，在30℃培養(yǎng)24h，挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中接種，在28°C培養(yǎng)24h，用細菌基因組提取試劑盒提取基因組DNA，詳細步驟請參見試劑盒說明書。以提取的DNA為模板，利用PCR技術(shù)擴增fis基因。反應(yīng)條件為：首先在94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，62℃退火1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)；之后在72℃再延伸10min。用1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測PCR擴增產(chǎn)物，以保證DNA的完整性。3.3目的基因的序列分析及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建將測序結(jié)果應(yīng)用BLAST檢索工具進行序列同源性分析，與已知維氏氣單胞菌的fis基因序列進行比對。應(yīng)用MEGA5.0軟件根據(jù)比對結(jié)果構(gòu)建克隆得到的fis基因的系統(tǒng)發(fā)育樹。3.4目的基因編碼產(chǎn)物的生物信息學(xué)分析在應(yīng)用Editseq翻譯出fis基因編碼的氨基酸序列后，利用生物信息學(xué)分析軟件進行分析。用ProtParam預(yù)測該編碼產(chǎn)物的基本理化性質(zhì)，用Protscale分析Fis蛋白的疏水性，用singalPv3.0分析Fis蛋白的信號肽，用TMHMMv2.0分析Fis蛋白的跨膜區(qū)，用SMART對Fis蛋白的結(jié)構(gòu)域進行分析，用PORTER分析Fis蛋白的二級結(jié)構(gòu)，用SWISSMODEL預(yù)測Fis蛋白的三級結(jié)構(gòu)，Protean預(yù)測Fis蛋白的B淋巴細胞抗原表位，SYFPEITHI預(yù)測Fis蛋白的T淋巴細胞抗原表位。3.5重組pEASY－fis克隆質(zhì)粒的構(gòu)建將PCR擴增的目的條帶進行瓊脂糖凝膠電泳，按DNA凝膠回收試劑盒的說明書回收目的基因片段，并將其與克隆載體pEASY連接，構(gòu)建組質(zhì)粒pEASY－fis。將重組質(zhì)粒pEASY－fis轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)TransT1中。疑似菌落經(jīng)PCR和雙酶切鑒定后，由庫美生物科技有限公司測序鑒定。4.結(jié)果4.1黃顙魚源維氏氣單胞菌fis基因的提取根據(jù)基因組DNA電泳的結(jié)果，我們可以看到DNA條帶的亮度較高，這證明了本實驗提取的DNA含量較高，拖尾現(xiàn)象較輕，說明部分DNA可能被降解了，但是降解程度不大，DNA的完整性保存較好。圖4-1：維氏氣單胞菌TH0426fis基因提取結(jié)果Fig.4-1：ExtractionoffisgenefromAeromonasvickersTH04264.2維氏氣單胞菌TH0426Fis基因PCR擴增結(jié)果以黃顙魚A.veroniiTH0426菌株基因組為模板，PCR擴增fis基因，獲得約1539bp的基因片段，該片段與目的基因大小及原基因序列比對一致。圖4-1：維氏氣單胞菌TH0426fis基因PCR擴增結(jié)果Fig.4-1：fisgenesPCRproductsfromisolateTH04264.3fis基因系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建根據(jù)A.veroniiTH0426fis基因核苷酸序列與GeneBank中已報道的氣單胞菌的fis基因核苷酸序列進行同源性比對發(fā)現(xiàn)，分離株序列與GeneBank中已報道的A.veronii序列分屬同一分支。如圖所示：圖4-3：fis基因的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建Fig4-3：Phylogenetictreebasedonfisgenessequences4.4生物信息學(xué)分析4.4.1Fis蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析用ProtParam工具對Fis蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)進行分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)is蛋白的氨基酸數(shù)目為512個,原子組成為C2516H4016N752O734S21，分子量：57217.42，理論等電點為pI:6.88，親水性的平均值（GRAVY）為-0.288，不穩(wěn)定指數(shù)計算為41.74，脂肪指數(shù)為94.39，這種分類的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。在組成Fis蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例達到14.5％，是占比最高的氨基酸,占比最多的其次是丙氨酸（Ala）,所占比例為10.7%，精氨酸（Arg）占比7.8%，谷氨酰胺（Gln）和甘氨酸（Gly）均占比為7.6%，谷氨酸（Glu）占比6.8%，纈氨酸（Val）占比5.5%，天冬氨酸（Asp）占比5.1%，絲氨酸(Ser)、組氨酸（His）、賴氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)含量較少，分別為4.5%、4.1%、3.7%、3.5%、3.1%，含量最少的是天冬酰胺（Asn）、異亮氨酸（Ile）、蘇氨酸（Thr）、半胱氨酸（Cys）、甲硫氨酸（Met）、酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp），含量分別為2.9%、2.9%、2.5%、2.3%、1.8%、1.8%、1.0%。帶負電荷的殘基總數(shù)(Asp+Glu)：61，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）：59。所考慮的序列的N末端是M（Met）。哺乳動物網(wǎng)織紅細胞的半衰期在體外估計為30小時，在酵母中超過20小時，在大腸桿菌中超過10小時。4.4.2Fis蛋白的疏水性分析應(yīng)用ProtScale進行疏水性分析，分析表明，F(xiàn)is蛋白是一種典型的疏水蛋白。圖4-3：Fis蛋白的疏水性分析Fig.4-3：HydrophobicanalysisofFisproteinsequences4.4.3Fis蛋白基因編碼蛋白的信號肽與跨膜區(qū)分析信號肽分析采用Singalp3.0，結(jié)果表明?；谏窠?jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，s平均值(means—score)小于0.5，不存在信號肽，整個編碼序列可完全用于原核表達；基于HMM算法的預(yù)測結(jié)果可知，F(xiàn)is蛋白存在信號肽的可能性為0.773，最可能剪接位點在30~31的概率為0.345；利用TMHMM2.0進行跨膜區(qū)分析，預(yù)測結(jié)果顯示，F(xiàn)is蛋白的1~512位氨基酸全部位于細胞膜的表面，不存在跨膜區(qū)，這與Fis蛋白疏水區(qū)分析結(jié)果基本一致。初步推測Fis蛋白可能與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)。圖4-4-3：Fis蛋白的信號肽與跨膜區(qū)分析Fig.4-4-3：SignalpeptideandtransmembraneregionanalysisofFisproteinsequences4.4.4Fis蛋白的結(jié)構(gòu)域分析用SMART對Fis蛋白的結(jié)構(gòu)域進行分析發(fā)現(xiàn)，目的蛋白在221—359位氨基酸殘基存在一段高度保守序列。圖4:4:4Fis蛋白的結(jié)構(gòu)域分析Fig：4:4:4domainanalysisofFisprotein4.4.5Fis蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測經(jīng)PORTER對Fis蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示，在該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α—螺旋占比55.08％、β－折疊占比9.38％、β—轉(zhuǎn)角占比5.08％及無規(guī)則卷曲占比30.47％。由此可推測，α－螺旋是Fis蛋白最多的二級結(jié)構(gòu)元件。圖4:4:5長豎線，α－螺旋；中長豎線，β－折疊；中短豎線，β－轉(zhuǎn)角；短豎線，無規(guī)則卷曲Fig4:4:5Thelongverticallinerepresentsanalphahelix;Themiddleandlongverticallinesrepresentβ-folds;Themiddleandshortverticallinesrepresenttheβ-angle;Shortverticallinesrepresentrandomcurls4.4.6Fis蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SWISS-MODEL同源建模方法預(yù)測了Fis蛋白的三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，F(xiàn)is蛋白的三級結(jié)構(gòu)成分是基于6iy8.1的A鏈構(gòu)建的，其一致性達到44.37%。圖4:4:6Fis蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig4:4:6PredictionoftertiarystructureofFISprotein4.4.7Fis蛋白B淋巴細胞抗原表位的預(yù)測圖4:4:7Fis蛋白B淋巴細胞抗原表位預(yù)測Fig4:4:7PredictionofBlymphocyteepitopeofFISprotein4.4.8Fis蛋白T淋巴細胞抗原表位的預(yù)測經(jīng)SYFPEITHI對Fis蛋白T淋巴細胞抗原表位分析預(yù)測，結(jié)果顯示，4個抗原多肽為優(yōu)勢抗原，分別為GLLLGMLDV、AARPELASL、AMQAKLLRV、SLNIPKRTL。表4-4-8Fis蛋白T淋巴細胞抗原表位預(yù)測Tab.4-4-8PredictionofTlymphocyteepitopeofFISprotein5討論維氏氣單胞菌（A.veronii）是一種重要的人－獸－水生生物共患病原菌，近年來，A.veronii感染魚類的報道逐年增多，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。[30-33]夏秋兩季，該菌有爆發(fā)趨勢，尤其在我國南方地區(qū)，可導(dǎo)致人類和其他哺乳動物感染，以腹膜炎和胃腸炎為主要疾病。維氏氣單胞菌（A.veronii）作為近幾年發(fā)現(xiàn)的最常見的致病菌，常導(dǎo)致水生動物生病死亡，隨之影響魚類養(yǎng)殖業(yè)生產(chǎn)力，造成巨大的經(jīng)濟損失，已成為一個不容忽視的重要問題。A.veronii感染的早期治療以抗生素為主，這將加劇抗生素殘留和多藥耐藥菌株的產(chǎn)生，接種疫苗是預(yù)防魚類細菌性疾病的理想措施。然而，關(guān)于維氏氣單胞菌疫苗的研究很少，市場上也沒有高質(zhì)量的產(chǎn)品。因此，研發(fā)新型的氣單胞菌候選疫苗對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有重要意義。A.veronii所攜帶的毒力因子與其發(fā)病機制密切相關(guān)，如脂多糖（LPS），外膜蛋白，氣溶素，腸毒素等[40]。AAA+家族的ATP酶在所有活生物體中都存在，各種細胞過程都有它們的參與，包括膜融合，蛋白水解和DNA復(fù)制。許多AAA+蛋白質(zhì)與AAA蛋白質(zhì)參與相似的過程（促進蛋白質(zhì)折疊和展開，蛋白質(zhì)復(fù)合物的組裝或拆卸，蛋白質(zhì)運輸和降解），但其他一些蛋白質(zhì)在復(fù)制，重組，修復(fù)和轉(zhuǎn)錄中起作用[34-36]。AAA+家族的ATP酶的編碼基因為fis基因，因此該基因可能影響蛋白的編碼，進而對細菌的致病性和毒力有關(guān)[50]。試驗以黃顙魚源A.veroniiTH0426菌株的基因組為模板，成功克隆出A.veroniiTH0426菌株ATP酶的fis基因片段，通過生物信息學(xué)分析該基因，得知，F(xiàn)is蛋白是典型的疏水性蛋白，且發(fā)現(xiàn)Fis蛋白無跨膜區(qū)，所有氨基酸均位于細胞膜表面。對Fis蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，并以同源建模的方法，預(yù)測了Fis蛋白的三級結(jié)構(gòu)，其結(jié)果為進一步研究Fis蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提有重要意義。利用相應(yīng)生物信息學(xué)軟件對Fis蛋白的理化性質(zhì)進行分析，其結(jié)果對相關(guān)的實驗工作中具有重要參考價值。對Fis蛋白分子結(jié)構(gòu)分析，應(yīng)用ProtScale進行疏水性分析，結(jié)果表明Fis蛋白為一個典型的疏水性蛋白。使用singalP3.0進行信號肽分析，基于神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，s平均值(means—score)小于0.5，不存在信號肽，整個編碼序列可完全用于原核表達；基于HMM算法的預(yù)測結(jié)果可知，F(xiàn)is蛋白存在信號肽的可能性為0.773，位于30~31位最可能剪切位點的可能性為0.345；利用TMHMM2.0進行跨膜區(qū)分析，預(yù)測結(jié)果顯示，F(xiàn)is蛋白的1~512位氨基酸全部位于細胞膜的表面，不存在跨膜區(qū)與該蛋白質(zhì)的疏水性區(qū)域分析結(jié)果基本一致。對Fis蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測，在該蛋白的二級結(jié)構(gòu)中α—螺旋、β－折疊、β—轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲分別占55.08％、9.38％、5.08％和30.47％。預(yù)測了Fis白的三級結(jié)構(gòu)，其結(jié)果對進一步研究Fis蛋白的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系具有重要意義。當前，人們逐漸認識到水產(chǎn)品質(zhì)量安全以及水體環(huán)境污染等問題的重要性，細菌的流行與暴發(fā)也同樣困擾著水產(chǎn)養(yǎng)殖人員。因此，研究細菌的毒力基因是揭示細菌致病機制的重要手段。也為開發(fā)新型疫苗并解決水產(chǎn)相關(guān)問題提供了新方向。雖然本試驗對fis基因有了初步的了解，但目前對fis基因功能尚無透徹的研究，其是否可以作為基因工程疫苗的一種候選抗原仍需進一步探究，本試驗結(jié)果為深入研究fis基因的功能、免疫調(diào)節(jié)作用機制以及基因工程亞單位疫苗等奠定了基礎(chǔ)。6結(jié)論（1）成功克隆了A.veroniiTH0426的fis基因。進行同源性比對構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。（2）通過生物信息學(xué)分析，了解了Fis蛋白的相關(guān)信息。Fis蛋白的氨基酸數(shù)目為512個,原子組成為C2516H4016N752O734S21，分子量：57217.42，理論等電點為pI:6.88，親水性的平均值（GRAVY）為-0.288，不穩(wěn)定指數(shù)計算為41.74，脂肪指數(shù)為94.39，這種分類的蛋白質(zhì)不穩(wěn)定。在組成Fis蛋白的20種氨基酸中，亮氨酸(Leu)所占比例最高，達到14.5％。Fis蛋白為一個典型的疏水性蛋白，并進行了T淋巴細胞抗原表位預(yù)測分析，有4條抗原多肽得分較高可作為優(yōu)勢抗原。

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