第六章化學(xué)檢測(cè)

第六章化學(xué)檢測(cè)第一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日一糖類(lèi)的化學(xué)檢測(cè)糖類(lèi)包括多糖、雙糖、單糖單糖和某些雙糖具有游離羰基——還原糖多糖和蔗糖等無(wú)還原性——非還原糖糖類(lèi)化學(xué)檢測(cè)主要是利用游離羰基的還原性質(zhì)，與試劑（氧化劑）進(jìn)行氧化還原反應(yīng)而進(jìn)行測(cè)定的。非還原糖必須轉(zhuǎn)化為還原糖再進(jìn)行測(cè)定第二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日最常用的試劑：斐林（Fehling）試劑基本組成：A：CuSO4溶液B:NaOH和酒石酸鉀鈉溶液使用時(shí)A、B等體積混合(生成酒石酸鉀鈉銅）酒石酸鉀鈉銅是氧化劑，可與還原糖的游離羰基發(fā)生氧化還原反應(yīng)，而進(jìn)行糖的測(cè)定。第三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日定糖常用方法1蘭——愛(ài)農(nóng)（Lane-Eynon）法次甲基藍(lán)（亞甲基藍(lán)、四甲基藍(lán)）法、置換法、直接滴定法反應(yīng)終點(diǎn)用次甲基藍(lán)指示劑顯示（還原糖滴定斐林試劑，由于次甲基藍(lán)氧化能力比二價(jià)銅弱，待二價(jià)銅全部還原后，過(guò)量1D還原糖使次甲基藍(lán)還原，藍(lán)色消失）多糖或其他非還原糖需轉(zhuǎn)化為還原糖后再滴定如淀粉，可用酸解或酶解第四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日操作要點(diǎn)（1）斐林試劑的標(biāo)定（a）標(biāo)定預(yù)備試驗(yàn)A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）搖勻，加熱至沸騰，＋2D1％次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失，耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（0.1％或0.2％）V1mL。（b）標(biāo)定A、B各5mL＋10mL水（250mL三角瓶中）搖勻，從滴定管中預(yù)先加入（V1-1)mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，搖勻后加熱加熱至沸騰，＋2D1％次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失（滴定在1min內(nèi)完成），記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的總毫升數(shù)V0第五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日(2)定糖（a）定糖預(yù)備試驗(yàn)A、B各5mL＋10mL樣品糖液（250mL三角瓶中）搖勻，加熱至沸騰，＋2D1％次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失，耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液（0.1％或0.2％）V2mL。（b）定糖A、B各5mL＋10mL樣品糖液（250mL三角瓶中）搖勻，補(bǔ)加（V0-V2）mL水，并從滴定管中預(yù)先加入（V2-1)mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液，搖勻后加熱加熱至沸騰，＋2D1％次甲基藍(lán)溶液，用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液滴定至藍(lán)色消失（滴定在1min內(nèi)完成），記錄消耗標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的總毫升數(shù)V第六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日(3)計(jì)算還原糖含量（以葡萄糖計(jì)）＝（V0-V)×c×(1/10)×n注意：（a）AB分開(kāi)儲(chǔ)存，防止Cu++變化，臨用混合（b）單標(biāo)移液管吸液準(zhǔn)確，外壁也需擦干凈（c）體積需控制在一定范圍內(nèi)，對(duì)pH有影響（d）煮沸時(shí)間要一致（e）注意指示劑加入時(shí)間和加入量一致（f）滴定速度一致（后滴定0.5～1mL，1min內(nèi)完成）（g）產(chǎn)物Cu2O不穩(wěn)定，次甲基藍(lán)變色也不穩(wěn)定，暴露于空氣或沸騰顏色變化，滴定過(guò)程不能搖動(dòng)，不可中途中止加熱

第七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日斐林試劑快速法：在斐林試劑中加入亞鐵氰化鉀（黃血鹽）反應(yīng)終點(diǎn)為藍(lán)色消失，淡黃色出現(xiàn)。反應(yīng)終點(diǎn)比蘭－愛(ài)農(nóng)法更為明顯。第八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日2碘量法I2→NaIO(氧化劑），其氧化能力較弱，僅適用于醛糖的測(cè)定，與酮糖不起反應(yīng)操作要點(diǎn)：（1）標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液配制，0.05mol/L，沸騰后冷卻水配制，存放在棕色瓶中，一周后用標(biāo)準(zhǔn)重鉻酸鉀標(biāo)定。（2）標(biāo)準(zhǔn)碘液配制，0.1mol/L（3）空白滴定：空白液，用硫代硫酸鈉滴定試劑中全部碘第九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日碘量瓶中，10mL0.1mol/L碘液＋15mL0.1mol/LNaOH＋5mL空白液，搖勻后暗反應(yīng)15min＋1mL1mol/L硫酸溶液，用0.05mol/L硫代硫酸鈉滴定至淺黃色，加0.2mL0.5％淀粉液作指示劑，滴定至藍(lán)色消失，記錄V0(4)樣品滴定：以5mL樣品液代替空白液，V1(5)計(jì)算：醛糖含量＝（V0－V1）C×M×n注意：暗反應(yīng)后需酸化再滴定，滴定時(shí)開(kāi)始輕搖（碘揮發(fā)），后再搖（淀粉吸附碘）配合次甲基藍(lán)法測(cè)定某些糖含量（如果糖）第十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日3銅試劑法將還原糖與二價(jià)銅離子反應(yīng)生成的Cu2O用碘氧化，再用硫代硫酸鈉滴定反應(yīng)液中剩余的碘而測(cè)定樣品還原糖的含量。（1）銅試劑的配制主要提供二價(jià)銅離子及碘（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作第十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日（a)標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖液的配制0.1%或0.05％（根據(jù)所用銅離子試劑定）（b)三角瓶編號(hào)123456葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（mL)012345蒸餾水（mL)543210銅試劑（mL)555555沸水浴10min，冷卻至室溫（c)各加入0.5mol/L硫酸5mL，振蕩，待紅色Cu2O完全溶解后，用硫代硫酸鈉滴定至終點(diǎn)，記錄耗用量V(d)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖含量（mg）為縱坐標(biāo)，（V0-V)為橫坐標(biāo)第十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日二蛋白質(zhì)和氨基酸的化學(xué)檢測(cè)蛋白質(zhì)含氮量幾乎恒定，平均16％測(cè)出N含量×6.25，即為蛋白質(zhì)量含氮量每gN相當(dāng)P

肉、蛋、豆16％6.25面粉17.6％5.70奶品15.7％6.38花生18.2％5.50鮭精蛋白31.5％3.17第十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日蛋白質(zhì)常用檢測(cè)方法1定氮法（經(jīng)典的，仲裁的）常用凱氏定氮法或微量凱氏定氮法（1）原理消化、蒸餾、吸收、滴定計(jì)算（2）操作要點(diǎn)(a)消化：凱氏定氮瓶，樣品＋K2SO4-CuSO4、濃H2SO4,通風(fēng)廚內(nèi)進(jìn)行，消化液全部移入100mL容量瓶定容。第十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日第十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日(b)蒸餾：防止漏氣(c)吸收：5mL2％H3BO3＋甲基紅－溴甲酚綠幾滴或一定量標(biāo)準(zhǔn)酸溶液（如25mL0.05mol/LH2SO4)(d)滴定計(jì)算：H3BO3吸收：0.01mol/LHCl滴定至綠色→淡紫紅色樣品中的總氮量（mg)=（A-B)×C×14×n標(biāo)準(zhǔn)硫酸接收：0.1mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，甲基紅→黃色終點(diǎn)樣品中總氮量=（C1V1-C2V2)×14×n粗蛋白含量＝樣品的總氮量×6.25第十六頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日2雙縮脲試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)縮脲＋CuSO4、NaOH→紫紅色化合物A∝C縮脲蛋白質(zhì)含有兩個(gè)以上脲鍵，有雙縮脲反應(yīng)蛋白質(zhì)（多肽）＋CuSO4→（NaOH）→銅－鈉－雙縮脲絡(luò)合物A∝Cp，與蛋白質(zhì)的分子量和氨基酸組成無(wú)關(guān)Tris緩沖液干擾P的測(cè)定，測(cè)定范圍1～10mg/mL第十七頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日操作：（1）雙縮脲試劑的配制CuSO4、酒石酸鉀鈉、NaOH、0.1%KI(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作1％標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白(mL)00.20.40.60.81.0蒸餾水(mL)1.00.80.60.40.20雙縮脲試劑(mL)444444室溫反應(yīng)30min測(cè)A540(3)樣品測(cè)定1mL＋4mL雙縮脲試劑，30min，測(cè)A540第十八頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日3福林－酚試劑法測(cè)定蛋白質(zhì)含量雙縮脲法的發(fā)展，靈敏100倍，需時(shí)較長(zhǎng)，對(duì)雙縮脲反應(yīng)有干擾的物質(zhì)對(duì)其影響更大，酚類(lèi)和檸檬酸也有干擾。堿性銅試劑——雙縮脲反應(yīng)稀釋的苯酚試劑——與酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸反應(yīng)呈藍(lán)色兩種呈色反應(yīng)可疊加第十九頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日操作：（1）福林－酚試劑的配制甲液：堿性銅試劑（A、NaOH、NaCO3,B、CuSO4和酒石酸鉀鈉)乙液：稀釋的苯酚試劑（2）標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液配制結(jié)晶牛血清蛋白溶于0.9％NaCl或用酪蛋白（凱氏定氮法測(cè)定含量）（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（4）樣品測(cè)定1mL樣品（含P15～500μg）＋5mL甲液，室溫10min，＋乙液0.5mL，混勻，室溫30min，測(cè)A500~750第二十頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日蛋白質(zhì)的免疫化學(xué)檢測(cè)概念：免疫化學(xué)檢測(cè)、抗體、抗原、凝集反應(yīng)、沉淀反應(yīng)檢測(cè)方法：（1）凝集反應(yīng)效價(jià)測(cè)定，細(xì)菌、病毒分類(lèi)（2）沉淀反應(yīng)沉淀反應(yīng)、界面（環(huán)狀）試驗(yàn)、免疫擴(kuò)散、免疫電泳、免疫親和層析、免疫熒光檢測(cè)等第二十一頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日氨基酸含量測(cè)定方法1茚三酮顯色法微酸性條件下，氨基酸茚三酮反應(yīng)生成紫色化合物，亞氨基酸（脯氨酸和羥脯氨酸）茚三酮反應(yīng)生成黃色化合物取1mL樣品溶液（含氨基酸0.1～50ug)加1mL緩沖液（pH5.0～6.7），再加1mL茚三酮顯色液，100℃水浴15min，自來(lái)水冷卻后，加入3mL60％乙醇溶液，測(cè)定OD570，脯氨酸或羥脯氨酸測(cè)OD440第二十二頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日2甲醛滴定法測(cè)定氨基酸氨基酸是兩性電解質(zhì)，不能用一般酸堿指示劑通過(guò)氫氧化鈉來(lái)測(cè)定。加進(jìn)甲醛生成羥甲基衍生物，可以用堿滴定。注意：需用過(guò)量中性甲醛。第二十三頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日三核酸的化學(xué)檢測(cè)根據(jù)核酸所含的磷及戊糖的化學(xué)性質(zhì)，可用定磷法、二苯胺法和地衣酚法等進(jìn)行檢測(cè)。1定磷法測(cè)定核酸含量（1）核酸的消化（2）磷的測(cè)定定磷試劑，45℃水浴25min，冷卻至室溫測(cè)OD650無(wú)機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)液作標(biāo)準(zhǔn)曲線（3）核酸含量的計(jì)算一般DNA含磷9.5％,RNA含磷9.2％，RNA量＝（總磷量－無(wú)機(jī)磷量）×10.9DNA量＝（總磷量－無(wú)機(jī)磷量）×10.5第二十四頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日2二苯胺法測(cè)定DNA含量DNA中的2-脫氧核糖在酸性環(huán)境中與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595nm處有最大吸收峰。在40～400μg范圍內(nèi)，OD595與DNA濃度成正比。少量乙醛可提高反應(yīng)靈敏度。（1）二苯胺試劑的配制（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作（3）樣品DNA含量測(cè)定第二十五頁(yè)，共二十七頁(yè)，2022年，8月28日3地衣酚法測(cè)定RNA含量核糖核酸在濃鹽酸和三氯化鐵的存在下，與3，5－二羥甲苯（地衣酚）反應(yīng)，生成綠色物質(zhì)。一定濃度范圍內(nèi)，OD670與RNA濃度成正比。所有戊糖均可進(jìn)行此反應(yīng)，注意干擾（如DNA）。操作：地衣酚試劑配制；標(biāo)準(zhǔn)曲線