第二章-組培資料2713

第二章植物組織培養(yǎng)的基本理論、條件與操作技術(shù)第一節(jié)植物組織培養(yǎng)的基本理論一、植物細(xì)胞的全能性及其表達(dá)1.植物組織培養(yǎng)(Planttissueculture)：在離體條件下，利用外植體(explant)：由活體(invivo)植物體上提取下來(lái)的，接種分類(lèi)：廣義的組織培養(yǎng)依外植體不同，可分為：器官培養(yǎng)(organculture)、莖尖分生組織培養(yǎng)(shoottipculture,shootapexcultrue)、細(xì)胞培養(yǎng)(cellculture)、原生質(zhì)體培養(yǎng)(protoplast2.植物細(xì)胞的全能性(totipotency)：一個(gè)具有完整細(xì)胞核的植物化)＞特化細(xì)胞(篩管等細(xì)胞)。胞全能性的表達(dá)全能性的表達(dá)：從離體培養(yǎng)的植物細(xì)胞或組織誘導(dǎo)分化成完整植全能性只是一種可能性。完整細(xì)胞核具有該植物體全套的遺傳信1)脫離整株，切斷胞間連絲，解除抑制；2)營(yíng)養(yǎng)和激素，使其脫分化與再分化。二、植物細(xì)胞的脫分化與再分化化(Celldifferentiation)1)成熟細(xì)胞未表達(dá)基因并非永久關(guān)閉，條件適宜即表達(dá)。2)生理生化分化先于形態(tài)結(jié)構(gòu)分化。3)完整植株中，細(xì)胞發(fā)育途徑一旦被決定常不再改變，而離體培養(yǎng)4)極性是植物細(xì)胞分化的基本現(xiàn)象，即在器官、組織、細(xì)胞中，在5)由不等分裂導(dǎo)致細(xì)胞分化的差異，說(shuō)明細(xì)胞質(zhì)在起作用。6)有位置效應(yīng)，可能與生理狀態(tài)和激素分布有關(guān)，導(dǎo)致基因表達(dá)差7)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)細(xì)胞分化有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。8)細(xì)胞分化時(shí)，常見(jiàn)核內(nèi)多倍性和多線染色體。3.愈傷組織(callus):在培養(yǎng)基上，由外植體經(jīng)脫分化和細(xì)胞分4.再分化/再生(redifferentiation/regeneration):由脫分化生的途徑：2)體細(xì)胞胚胎發(fā)生(somaticembryogenesis)：從體細(xì)胞誘導(dǎo)的愈傷組織形成類(lèi)似于合子胚的結(jié)構(gòu)(體細(xì)胞胚)，進(jìn)一步發(fā)育成完整植根芽根芽脫分化脫分化官、組織和細(xì)胞第二節(jié)植物組織培養(yǎng)的基本條件2.接種室(無(wú)菌操作室)4.細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)室3.濕度：室內(nèi)相對(duì)濕度70%~80%,過(guò)低使培養(yǎng)基失分，過(guò)高易造第三節(jié)培養(yǎng)基及其配制劑＋其它。HPCa:CaCl2.2H2O;Cu：CuSO4;Fe:FeSO4.7H20與Na2EDTA.2H20的螯合物；B:H3BO3;Mn:MnSO4.H20；MoNa2MoO4Co:CoCl2.6H20Zn:ZnSO4.7H201)糖：常用蔗糖(2%~5%)，葡萄糖和果糖等也用，大規(guī)模生產(chǎn)用綿白糖/砂糖。最常用的碳源(Carbonsource)是蔗糖(sucrose)，葡萄糖和果糖(GlucoseandFructose)也是較好的碳源，可支持許多組織很好的生長(zhǎng)。麥芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖(Maltose,galactose,mannoseandlactose)在組織培養(yǎng)中也有應(yīng)用。蔗糖使2)維生素：用量一般0.1~1.0mg/L。4)氨基酸及有機(jī)添加物：常用甘氨酸、丙氨酸和谷氨酰胺；也用水4.植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物(plantgrowthregulator)開(kāi)花、結(jié)實(shí)、成熟、脫落、衰老和休眠以及萌發(fā)等許許多多的生理1)生長(zhǎng)素類(lèi)(auxin)：用量0.01~10mg/L。人工合成，其活力較低，是生長(zhǎng)素中活力最弱的激素，對(duì)器官形成IBA(indolebutyriacid，吲哚丁酸):促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)2)細(xì)胞分裂素類(lèi)(cytokinin)：用量0.1~10mg/L。BAP卞氨基嘌呤)；2-ip(異戊烯基腺嘌呤)等。3)赤霉素(Gibberellins,GA’s)4)脫落酸(AbscisicAcid,ABA)。模式生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長(zhǎng)5.固化劑1)瓊脂(agar)：用量6~10g／L。2)其他：濾紙橋、海綿、脫脂棉、卡拉膠等，總的要求是排出的有養(yǎng)基的滲透壓培養(yǎng)基中由于有添加的鹽類(lèi)、蔗糖等化合物，因此，而影響到滲透2.B5：含較低的銨(常抑制生長(zhǎng))，適合于雙子葉特別是木本植物。stocksolution配制制1)在燒杯中放入一定量的水，依次加入大量元素、微量元素、有機(jī)2)加入蔗糖；3)如果需要，加入肌醇等大量成分；5)加瓊脂；6)裝在大三角瓶中滅菌后分裝，或先分裝再滅菌。有機(jī)物分解、糖焦化、鹽沉淀、難凝固(瓊脂解聚)。第四節(jié)離體無(wú)菌操作技術(shù)1.1高壓高溫蒸氣滅菌(培養(yǎng)基、器皿、用具)點(diǎn)不斷提高，鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在1atm/cm2(0.1Mpa)的壓力1.2灼燒滅菌(金屬器械)1.3過(guò)濾除菌(不耐熱物品)1.4干熱滅菌(玻璃器皿及耐熱用具)1.5紫外線照射滅菌(接種室、超凈臺(tái))化學(xué)滅菌2.2熏蒸滅菌中操作步驟：1.打開(kāi)超凈臺(tái)風(fēng)機(jī)hood，開(kāi)紫外燈照20min左右；劑的使用濃度及時(shí)間使使用濃度(%)處理時(shí)間(min)去除難易易易易有無(wú)無(wú)好好好0.1~110mg/L、外植體的滅菌與接種1)基因型：影響培養(yǎng)難易和再生途徑，草本比木本、雙子葉比單子3)發(fā)育年