寄生蟲樣本的采集制作及保存

寄生蟲樣本的采集制作及保存第1頁/共25頁寄生蟲樣本的概念：指用于標(biāo)本制作、保種、冷藏的寄生蟲不同生活史階段的蟲體材料、遺傳材料及相關(guān)的生物材料，是寄生蟲種質(zhì)資源的實(shí)物資源。

第2頁/共25頁一、寄生蟲樣本的采集：

掌握基本知識(shí)：了解人體寄生蟲的形態(tài)、生活史和生態(tài)以及地域分布等有關(guān)知識(shí)。

1、樣本來源：

2、采集時(shí)注意事項(xiàng)：

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1、樣本來源：

腸道、腔道內(nèi)的蠕蟲卵、原蟲滋養(yǎng)體或包囊：排泄物、分泌物腸道內(nèi)的蠕蟲成蟲：藥物驅(qū)出血液、骨髓內(nèi)的寄生蟲：抽取血液和骨髓穿刺肝、肺、肌肉等組織內(nèi)的寄生蟲：穿刺、活檢組織作切片有些難以采到的寄生蟲：動(dòng)物接種及人工培養(yǎng)增殖

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2、采集時(shí)注意事項(xiàng)：

①詳細(xì)的樣本記錄：②保持樣本的完整：③防止自身感染：第5頁/共25頁二、寄生蟲樣本的制作和保存：

1、盡快適當(dāng)處理：

2、固定方法：

3、常見的固定液：

4、固定后的處理保存：

5、特殊用途的樣本處理：第6頁/共25頁

1、盡快適當(dāng)處理：

①進(jìn)行人工飼養(yǎng)。②及時(shí)感染動(dòng)物進(jìn)行保種。③需制作玻片標(biāo)本時(shí)，先用0.85%生理鹽水將蟲體粘附的污物洗凈，固定后制作玻片標(biāo)本。④如條件所限不能對(duì)樣本及時(shí)處理，應(yīng)立即將樣本放入4℃冰箱內(nèi)，但時(shí)間不能過久，以免蟲體腐爛。

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2、固定方法：

固定處理使蟲體在短時(shí)間內(nèi)迅速死亡，保持蟲體標(biāo)本原有的姿態(tài)，并使蟲體內(nèi)的物質(zhì)(如蛋白質(zhì)、脂肪和糖類等)凝固，防止腐爛和自溶，保證蟲體內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整并易于著色。

無論是新鮮蟲體還是病變組織，固定越及時(shí)越好。

常用的固定方法有物理固定與化學(xué)固定兩種。

物理固定：以加熱和干燥方法固定標(biāo)本。化學(xué)固定：用某些化學(xué)藥品配成溶液來固定標(biāo)本，這些溶液叫做固定液。固定時(shí)將標(biāo)本浸于固定液內(nèi)。第8頁/共25頁

3、常見的固定液：

常用于配制固定液的試劑有甲醛、乙醇、升汞、苦味酸、冰醋酸等。固定液分為單純固定液與復(fù)合固定液兩種。單純固定液配制簡單，使用方便，但均不能兼?zhèn)涓鞣N試劑的優(yōu)點(diǎn)，因此較少應(yīng)用。

復(fù)合固定液由兩種以上化學(xué)藥品配制而成，可利用各種藥品的優(yōu)點(diǎn)以互補(bǔ)不足，例如醋酸會(huì)使細(xì)胞膨脹，而乙醇與苦味酸反使細(xì)胞收縮，兩者混合使用，可使收縮和膨脹作用抵消。

第9頁/共25頁單純固定液：

甲醛：具有較強(qiáng)的殺菌效果，能保存標(biāo)本免于腐爛。由于其滲透力較強(qiáng)，有硬化標(biāo)本的性能，故準(zhǔn)備切片的活檢組織多用此固定液保存。乙醇：為無色液體,具有固定、保存和硬化標(biāo)本的性能，滲透力強(qiáng)，其主要缺點(diǎn)在于吸收水分，能使標(biāo)本收縮。由于乙醇可使蟲體或組織收縮，表面硬化，因而較難滲入到組織深部，所以不宜固定大塊組織。乙醇除了固定和保存蟲體以外，還在制片過程中用于脫水。第10頁/共25頁復(fù)合固定液：

鮑恩氏(Bouin)固定液：含苦味酸飽和水溶液75份,甲醛25份,冰醋酸5份。固定時(shí)間3~12h，或過夜。臨用時(shí)配制，不宜久藏。該固定液適用于一般小型蠕蟲的固定。

勞氏(Looss)固定液：含升汞飽和水溶液100ml，醋酸2ml。適用于固定小型吸蟲，固定4~24h。

肖氏(Schaudinn)固定液：含升汞飽和水溶液2份，95%乙醇1份，每100ml混合液中加入冰醋酸5~10ml。適用于固定腸原蟲涂片，固定10~60min。

布萊氏(Bless)固定液：含70%乙醇90ml、40%甲醛7ml、冰醋酸3ml。此固定液滲透力強(qiáng)，為昆蟲幼蟲的良好固定劑，亦可固定小型吸蟲和絳蟲。

第11頁/共25頁4、固定后的處理保存：

樣本經(jīng)固定后，視樣本的種類、大小以及固定液的種類不同，后處理的方法也不盡相同。用任何保存液(如5%甲醛液或70%乙醇)固定后的蟲體，須在1周內(nèi)重新更換于新的保存液內(nèi)保存，換液的目的是防止藥液被稀釋而影響保存蟲體的效果。

一般固定的標(biāo)本應(yīng)保存于緊塞的瓶中，并注明標(biāo)本的來源、名稱、保存液、日期和采集人姓名，存放于陰暗處備用。第12頁/共25頁5、特殊用途的樣本處理：樣本準(zhǔn)備開展分子生物學(xué)研究，如提取

DNA等，需對(duì)樣本進(jìn)行特殊處理。

將現(xiàn)場采集的蠕蟲(活蟲)成蟲、幼蟲或蟲卵,可選用以下固定方法進(jìn)行保存：①固定于20%二甲基亞砜(DMSO)飽和鹽水溶液中存放4℃保存；②直接固定于100%無水乙醇；③可將活蟲體直接保存于-70℃冰箱中。含蟲體的糞便標(biāo)本：現(xiàn)場采集的糞便(內(nèi)含蟲卵、幼蟲或原蟲時(shí))可選用：①如短期保存,可直接保存于4℃冰箱或-70℃干冰中；②如長期保存，可將糞便與無水乙醇1∶1混合后4℃保存或與重鉻酸鉀1∶1混合后4℃保存。含蟲體的血液標(biāo)本：現(xiàn)場采集的血液標(biāo)本(如內(nèi)含原蟲,未服用過藥物)，可以1~5ml血液中加EDTA4℃保存，也可將5~6滴血采集在濾紙上，待干后可短期保存于4℃冰箱內(nèi)。

第13頁/共25頁三、常見寄生蟲樣本的采集、固定與保存：

1、蠕蟲樣本：

1—①

蠕蟲成蟲1—②

蠕蟲蟲卵

2、原蟲樣本：

2—①

腸道內(nèi)原蟲2—②

腔道內(nèi)原蟲

2—③

組織內(nèi)原蟲2—④

血清內(nèi)原蟲

3、醫(yī)學(xué)昆蟲樣本：第14頁/共25頁1—①

蠕蟲成蟲樣本：采集：可用驅(qū)蟲藥物自宿主的消化道驅(qū)出蟲體，或解剖自然感染和人工接種感染的動(dòng)物及尸體解剖而獲得蟲體。清洗：采集到的蟲體須將其體表附著物除去：放入0.85%鹽水中洗滌。固定：吸蟲：凡用含有升汞固定的標(biāo)本會(huì)產(chǎn)生許多汞鹽沉淀，沉積于組織內(nèi)影響觀察，故需用0.5%碘乙醇(似葡萄酒色)浸泡12h，以除去汞鹽沉淀，再放入70%乙醇中退去碘的顏色，最后將蟲體保存于70%乙醇中。絳蟲：絳蟲標(biāo)本往往頭節(jié)深埋腸粘膜中。從解剖動(dòng)物腸管發(fā)現(xiàn)絳蟲時(shí)，保持其完整。線蟲：將蟲體放入加熱至60~70℃的熱水或乙醇等固定液中固定，可獲得伸直的蟲體，待冷卻后移于70%~80%乙醇或巴氏液(3%甲醛生理鹽水)中保存。保存：保存蟲體如暫不作檢查，可在保存液(乙醇)中加入丙三醇數(shù)滴，以防止保存液的蒸發(fā)干涸。保存蟲體標(biāo)本的瓶、管內(nèi)外均須貼標(biāo)簽，注明采集地點(diǎn)、采集日期、宿主名稱、寄生部位、采集者以便查考。第15頁/共25頁1—②

蠕蟲蟲卵樣本：采集和清洗：小型蟲卵取糞便5~10g,放入小燒杯內(nèi)，加少量清水，調(diào)勻,通過80~100目尼龍網(wǎng)篩過濾至含500ml清水量杯中，靜置30~40min后，傾去上部渾濁液，再加水至500ml靜置30min留沉淀物，再反復(fù)沉淀數(shù)次，直至上部水澄清。固定和保存：棄去上清液，加3%甲醛液與含蟲卵沉淀糞渣混合進(jìn)行固定24h，然后再更換5%甲醛生理鹽水中并加丙三醇數(shù)滴密封保存。大型蟲卵水洗沉淀方法基本同上，區(qū)別為換以40~60目尼龍網(wǎng)篩過濾糞液，每次換水后靜置15~25min。固定保存方法同上。受精蛔蟲卵和鉤蟲卵容易發(fā)育成胚胎，故固定時(shí)需用加熱至70℃的10%甲醛進(jìn)行處理，以阻止卵細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育。第16頁/共25頁2—①

腸道內(nèi)原蟲樣本：

采集：腸道內(nèi)原蟲如溶組織內(nèi)阿米巴、結(jié)腸內(nèi)阿米巴、布氏嗜碘阿米巴、邁氏唇鞭毛蟲、蘭氏賈第鞭毛蟲、人毛滴蟲、結(jié)腸小袋釬毛蟲等。這些寄生蟲生活史中均有滋養(yǎng)體與包囊(人毛滴蟲除外)兩個(gè)時(shí)期。滋養(yǎng)體通常出現(xiàn)于液質(zhì)或半液質(zhì)以及含有粘液膿血之糞便內(nèi)。包囊則見于成形或半成形的糞便中。收集糞便標(biāo)本最好用特制的糞便盒或油紙。采取糞便務(wù)求新鮮。

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固定與保存：當(dāng)采到含有腸原蟲新鮮標(biāo)本時(shí)，無論是滋養(yǎng)體還是包囊，應(yīng)立即制成涂片標(biāo)本，用肖定氏固定液固定，再移置于70%乙醇內(nèi)保存，以備日后染色制片觀察。腸原蟲滋養(yǎng)體在體外容易死亡分解，應(yīng)趁新鮮及時(shí)涂片固定，包囊除了涂制玻片標(biāo)本染色外，亦可保存于5%甲醛生理鹽水中。保存方法：將含有原蟲包囊較多的糞便用5%甲醛生理鹽水調(diào)成懸液，經(jīng)60目孔銅篩過濾于尖底量筒中，靜置3~4h后，傾去上清液，再換以新的5%甲醛生理鹽倒入瓶中保存。檢查時(shí)，用吸管吸取此混懸液一滴置于載玻片上，復(fù)以蓋玻片高倍鏡檢。如需染色檢查時(shí)，可加入碘液1滴與糞液相混后檢查。此法可保持包囊形態(tài)較長時(shí)間不變。第18頁/共25頁2—②

腔道內(nèi)原蟲樣本：采集：腔道內(nèi)原蟲主要為陰道毛滴蟲、齒齦內(nèi)阿米巴及口腔毛滴蟲。陰道毛滴蟲：將收集的陰道分泌物接種于培養(yǎng)基內(nèi)經(jīng)培養(yǎng)使該原蟲繁殖后涂制標(biāo)本易檢出。亦可取少量標(biāo)本,不經(jīng)培養(yǎng)直接涂片鏡檢，檢出率較低。齒齦內(nèi)阿米巴與口腔毛滴蟲：兩種原蟲均寄生于口腔內(nèi),定居于齒齦組織、齒垢、蛀穴及齒槽膿瘍內(nèi)。采集時(shí)用牙簽或小尖鑷子挑取牙齦周圍污垢物質(zhì)，加一滴生理鹽水于載玻片上調(diào)和均勻，置顯微鏡下檢查。如標(biāo)本蟲數(shù)太少，通過人工培養(yǎng)法使蟲體繁殖后涂制鏡檢,可提高檢出率。第19頁/共25頁

固定與保存：陰道毛滴蟲：取陰道分泌物在玻片上涂成薄膜，在空氣中晾干，用甲醇固定后，即可短期保存，如用吉氏染液染色30~60min，水洗晾干后即可長期保存。齒齦內(nèi)阿米巴與口腔毛滴蟲：取患者牙齦周圍污垢物質(zhì)加一小滴生理鹽水和血清于載玻片中央調(diào)和均勻，使成一圓形薄膜，平置待尚未干燥而濕潤時(shí)用肖定氏固定液固定，再移置于70%乙醇內(nèi)保存，供日后染色制片、長期保存。第20頁/共25頁2—③

組織內(nèi)原蟲樣本：

組織內(nèi)原蟲主要為利什曼原蟲和弓形蟲。

弓形蟲寄生于單核白細(xì)胞、網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和其他組織細(xì)胞內(nèi)，但有時(shí)也可游離于體液中。

采集和固定：取急性患者的體液、腦脊液經(jīng)離心沉淀,取沉渣作涂片，干燥后用甲醇固定。當(dāng)蟲體較少時(shí)，可將待檢體液或組織磨碎，加適量無菌生理鹽水稀釋或制成混懸液，注射于小白鼠腹腔內(nèi)，約經(jīng)過1~3周，取腹腔滲出液或小白鼠肝、脾、腦磨碎制成厚膜涂片，待自然干燥后用甲醇固定。

保存：涂片經(jīng)吉氏染液染色干燥后保存。第21頁/共25頁2—④

血清內(nèi)原蟲樣本：血液內(nèi)可查到的原蟲有瘧原蟲、錐蟲等。

瘧原蟲的采集：耳垂或手指取血，用推片邊緣中部取少許（0.5~1.0ul）血液在載玻片上推成薄血膜；再用推片的角，取血4~5ul，在同一載玻片上另一位置涂制成圓形厚血膜。

制片和染色：自然干燥血膜，用甲醇固定薄血膜，厚血膜上加幾滴清水