層析公開課課件

層析技術(shù)

第七章層析技術(shù)第一節(jié)

層析的基本原理及分類

第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析凝膠過(guò)濾層析

第三節(jié)

離子交換層析

第四節(jié)

疏水性相互作用層析

第五節(jié)

親和層析第六節(jié)反相層析

第一節(jié)

層析的基本原理及分類一、層析的基本原理層析是根據(jù)混合物中溶質(zhì)在互不混溶的兩相之間分配行為的差別，引起移動(dòng)速度的不同而進(jìn)行分離的方法。典型的柱層析分離設(shè)備示于圖7-1中。

圖7-1柱層析分離設(shè)備

第一節(jié)

層析的基本原理及分類

圖7-2層析柱出口處各個(gè)溶質(zhì)的濃度變化

在定溫定壓條件下，當(dāng)色譜分離過(guò)程達(dá)到平衡狀態(tài)時(shí)，某種組分在固定相S和流動(dòng)相m中含量（濃度）C的比值，稱為平衡系數(shù)K（也可以是分配系數(shù)、吸附系數(shù)、選擇性系數(shù)等）。第一節(jié)

層析的基本原理及分類其表達(dá)通式可寫為：

（7-1）

式中K——平衡系數(shù)（分配系數(shù)、吸附系數(shù)、選擇性系數(shù)等）；Cs——固定相中的濃度；Cm——流動(dòng)相中的濃度。平衡系數(shù)K主要與下列因素有關(guān)：①被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)；②固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)；③色譜柱的操作溫度。一般情況下，溫度與平衡系數(shù)成反比，各組分平衡系數(shù)K的差異程度決定了色譜分離的效果，K值差異越大，色譜分離效果越理想。第一節(jié)

層析的基本原理及分類2．阻滯因數(shù)或比移值Rf在色譜柱（紙、板）中，溶質(zhì)的移動(dòng)速度與流動(dòng)相的移動(dòng)速度之比，稱為阻滯因數(shù)或比移值Rf，其定義式可寫為：令A(yù)s為固定相平均截面積，Am為流動(dòng)相平均截面積，則系統(tǒng)或柱的總截面積At=As+Am。設(shè)體積為V的流動(dòng)相流過(guò)色譜系統(tǒng)，流速很慢，可以認(rèn)為溶質(zhì)在兩相間平衡，則：第一節(jié)

層析的基本原理及分類（1）基線在操作條件下，色譜柱出口處沒有組分流出，僅有純流動(dòng)相流過(guò)檢測(cè)器，此時(shí)的流出曲線稱為基線，如圖7-3中OC曲線。使基線發(fā)生細(xì)小波動(dòng)的現(xiàn)象稱為噪音，如圖7-3中的空氣峰?；€反映了操作條件下，檢測(cè)器系統(tǒng)噪聲隨時(shí)間變化的波動(dòng)情況，穩(wěn)定的基線應(yīng)是一條平行于橫坐標(biāo)的直線。圖7-3色譜圖第一節(jié)

層析的基本原理及分類（2）色譜峰當(dāng)樣品中的組分隨流動(dòng)相流入檢測(cè)器時(shí)，檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)大小隨時(shí)間變化所形成的峰形曲線稱為色譜峰，峰的起點(diǎn)和終點(diǎn)的連接直線稱為峰底。（3）峰形

正常的色譜流出曲線為對(duì)稱于峰尖的正態(tài)分布曲線，如圖7-4(a)所示。但實(shí)際上，流出曲線并非完全對(duì)稱，不正常的色譜峰有拖尾峰和前伸峰，如圖7-4(b)、(c)所示。(a)(b)(c)圖7-4峰形示意圖第一節(jié)

層析的基本原理及分類（4）保留值表示混合物中各組分在色譜柱中停留時(shí)間或?qū)⒔M分帶出色譜柱所需流動(dòng)相體積的數(shù)值，稱為保留值。保留值可作為定性分析的參數(shù)，由于計(jì)量單位的不同，分別稱為保留時(shí)間、保留體積。①保留時(shí)間tR

從開始進(jìn)樣至柱出口處被測(cè)組分出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所需的時(shí)間，稱為保留時(shí)間，如圖7-3所示。②保留體積VR

從開始進(jìn)樣到柱出口處被測(cè)組分出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所通過(guò)的流動(dòng)相體積，稱為保留體積。③死時(shí)間t0

不被固定相滯留的組分（氣相色譜中如空氣、甲烷等），從開始進(jìn)樣到柱出口處出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所需的時(shí)間稱為死時(shí)間，其值等于流動(dòng)相流經(jīng)色譜柱的時(shí)間，如圖7-3所示。第一節(jié)

層析的基本原理及分類⑦相對(duì)保留值r2,1

在相同的操作條件下，待測(cè)組分與參比組分的校正保留值之比，稱為相對(duì)保留值，又稱為選擇因子。,其定義式為：（7-2）式中t′R2、t′R1——分別為被測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的校正保留時(shí)間；V′R1、V′R2——分別為被測(cè)物質(zhì)和參比物質(zhì)的校正保留體積。相對(duì)保留值r2,1可以消除某些操作條件對(duì)保留值的影響，只要柱溫、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)保持不變，即使填充情況、柱長(zhǎng)、柱徑及流動(dòng)相流速有所變化，相對(duì)保留值仍保持不變。

第一節(jié)

層析的基本原理及分類（5）峰高與峰面積色譜峰頂點(diǎn)與峰底之間的垂直距離稱為峰高，用h表示；峰與峰底之間的面積稱為峰面積，用A表示，可作為定量分析的參數(shù)。（6）區(qū)域?qū)挾壬V峰的區(qū)域?qū)挾瓤珊饬恐?，并且可與峰高相乘來(lái)計(jì)算峰面積，如圖7-3所示。色譜峰的區(qū)域?qū)挾韧ǔＳ腥N表示方法：①標(biāo)準(zhǔn)偏差σ

即0.607h峰高處的峰寬的二分之一。②半高峰寬W1/2

即1/2峰高處的峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為：W1/2=2.355σ。③峰寬W自色譜峰兩側(cè)的轉(zhuǎn)折點(diǎn)（拐點(diǎn)）處所作的切線與峰底相交于兩點(diǎn)，此兩點(diǎn)間的距離稱為峰寬。它與標(biāo)準(zhǔn)偏差的關(guān)系為：W=4σ。

標(biāo)準(zhǔn)偏差、峰寬與半高峰寬的單位由色譜峰橫坐標(biāo)單位而定，可以是時(shí)間、體積或距離等。在理想的色譜中，組分的譜帶應(yīng)是很窄的，若譜帶較寬，將直接導(dǎo)致分離效果下降。第一節(jié)

層析的基本原理及分類（7）分離度R是指相鄰兩色譜峰保留值之差與兩組分色譜峰峰底寬度平均值之比值，即：（7-3）式中tR1、tR2——分別為組分1和2的保留時(shí)間(也可采用其它保留值)；W1、W2——分別為組分1和2的色譜峰的峰底寬度，與保留值的單位相同。分離度R綜合考慮了保留值的差值與峰寬兩方面的因素對(duì)柱效率的影響，可衡量色譜柱的總分離效能。第一節(jié)

層析的基本原理及分類

（8）柱效柱效是表達(dá)色譜柱性能的一個(gè)重要參數(shù)，可用塔板數(shù)N和塔板高度H表示，其計(jì)算式為：假設(shè)色譜柱的內(nèi)徑和柱內(nèi)的填料是均勻一致的，混合液流經(jīng)一小段色譜柱后，各組分在兩相間達(dá)平衡。這一小段色譜柱可看成是一個(gè)理論塔板，相當(dāng)于精餾操作中的一塊理論塔板，一個(gè)理論塔板所對(duì)應(yīng)的色譜柱的長(zhǎng)度稱為理論塔板高度（理論板高），一個(gè)色譜柱可包含若干個(gè)理論塔板。理論塔板數(shù)的多少可反映色譜柱分離性能的優(yōu)劣。單位長(zhǎng)度色譜柱內(nèi)包含的理論塔板數(shù)越多，流動(dòng)相通過(guò)的塔板數(shù)也越多，說(shuō)明流動(dòng)相流過(guò)色譜柱的平衡次數(shù)越多，色譜柱的分離效率就越高。

第一節(jié)

層析的基本原理及分類（9）色譜流出曲線的意義色譜峰數(shù)等于樣品中單組分的最少個(gè)數(shù)；色譜保留值是定性分析的依據(jù)；色譜峰高或面積是定量分析的依據(jù)；色譜保留值或區(qū)域?qū)挾仁巧V柱分離效能的評(píng)價(jià)指標(biāo)；色譜峰間距是固定相或流動(dòng)相選擇是否合適的判定依據(jù)。二、層析分類1．流動(dòng)相與固定相層析法根據(jù)流動(dòng)相的相態(tài)分氣相層析法、液相層析法和超臨界流體層析法。而固定相有固體、液體和以固體為載體的液體薄層。生物物質(zhì)一般存在于水溶液中，因此，生物分離主要采用液相層析法，如固定相為液體的分配層析法，如固定相為固體的吸附層析法及固定相為固定于固體表面的液體薄層（以固體為載體）的分配層析法等。第一節(jié)

層析的基本原理及分類

2．固定相的形狀根據(jù)固定相或?qū)游鲅b置形狀的不同，液相層析法又分紙層析法(Paperchromatography)、薄層層析法(Thin—1ayerchromatography)和柱層析法(Columnchromatography)。紙層析和薄層層析多用于分析目的，而柱層析易于放大，適用于大量制備分離，是主要的層析分離手段。3．壓力在以固體(包括以固體為載體的液體薄層)為固定相的液相層析中，根據(jù)操作壓力的不同，又分為低壓(壓力一般小于0.5MPa)、中壓(壓力為0.5～40MPa)和高壓(壓力為4.0～40MPa)液相層析法。高壓液相層析法中層析介質(zhì)（固定相）微細(xì)，分離精度高、速度快，主要用于成分分析。大量制備分離常用低壓或中壓液相層析法。第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析一、原理與操作1．凝膠層析的原理凝膠過(guò)濾層析(Gelfiltrationchromatography，GFC)又稱體積排阻層析、分子篩層析，是利用凝膠粒子(通常稱為凝膠過(guò)濾介質(zhì))為固定相，根據(jù)料液中溶質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離的液相層析法。如圖7-6所示，在裝填具有一定孔徑分布的凝膠過(guò)濾介質(zhì)的層析柱中，料液中溶質(zhì)1的相對(duì)分子質(zhì)量很大，不能進(jìn)入到凝膠的細(xì)孔中，因而從凝膠間的床層空隙流過(guò)，洗脫體積為層析柱的空隙體積；對(duì)子溶質(zhì)4，其相對(duì)分子質(zhì)量很小，能夠進(jìn)入到凝膠的所有細(xì)孔中，因而其洗脫體積接近柱體積；相對(duì)分子質(zhì)量介于溶質(zhì)1和溶質(zhì)4之間的溶質(zhì)2和3可進(jìn)入到凝膠的部分細(xì)孔中，故其洗脫體積介于空隙體積和柱體積之間，根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量的差別（溶質(zhì)2的相對(duì)分子質(zhì)量大于溶質(zhì)3）順序洗脫。相對(duì)分子質(zhì)量大于溶質(zhì)l和小于溶質(zhì)4的溶質(zhì)的洗脫體積分別與溶質(zhì)1和溶質(zhì)4相同。第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析圖7-6GFC的分離原理及洗脫曲線

第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析

GFC操作中溶質(zhì)的分配系數(shù)M只是相對(duì)分子質(zhì)量、分子形狀和凝膠結(jié)構(gòu)(孔徑分布)的函數(shù)，與所用洗脫液的pH值和離子強(qiáng)度等物性無(wú)關(guān)，即在一般的層析操作條件下、相對(duì)分子質(zhì)量一定的溶質(zhì)的分配系數(shù)為常數(shù)。因此，GFC操作一般采用組成一定的洗脫液進(jìn)行洗脫展開，這種洗脫法稱為恒定洗脫法(isocratIcelution)。2．凝膠層析的操作（1）凝膠的處理

葡聚糖凝膠和聚丙烯酰胺凝膠上以干品出售的，所以在使用前必須溶脹。可以將它們浸泡在洗脫劑中，慢慢攪拌。洗脫劑應(yīng)具有一定的離子強(qiáng)度（約為0.08）。第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析（3）上樣和洗脫

柱床經(jīng)洗脫劑平衡后，在床頂部留下數(shù)毫升洗脫劑，再用滴管輕輕沿柱壁將試樣加入至柱的上面，防止擾動(dòng)填充層表面，打開柱底部的流出口，使樣品液滲入凝膠床內(nèi)。當(dāng)樣品液面恰與凝膠床表面平時(shí)，加入數(shù)毫升洗脫劑沖洗管壁。這一步關(guān)鍵是既要使樣品恰好全部滲入凝膠床，又不致使凝膠表面干燥而發(fā)生裂縫。然后用大量洗脫劑洗脫，并收集相應(yīng)的洗脫液。非水溶性物質(zhì)的洗脫采用有機(jī)溶劑（如苯和丙酮），水溶性物質(zhì)的洗脫一般采用水或具有不同離子強(qiáng)度和pH的緩沖液。PH的影響與被分離物質(zhì)的酸堿性有關(guān)，在酸性pH時(shí)堿性物質(zhì)易于洗脫，在堿性pH時(shí)酸性物質(zhì)易于洗脫。多糖類物質(zhì)的洗脫以水為最佳，有時(shí)為了使樣品溶液解度增加而使用含鹽洗脫劑。第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析

（4）凝膠的再生和保養(yǎng)理論上因?yàn)槟z本身不與溶質(zhì)發(fā)生作用，所以層析分離后無(wú)需再生處理，但實(shí)際操作時(shí)凝膠層常有一定的污染，必須作適當(dāng)?shù)奶幚怼＝宦?lián)葡萄糖凝膠柱可用0.2mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合液處理，聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠由于遇酸、堿不穩(wěn)定，常用0.5mol/LNaCl處理。為了抑制微生物在凝膠層內(nèi)生長(zhǎng)，在凝膠床保存之前必須完全除去磷酸根離子和所有底物，將柱真空保存或低溫保存，但溫度不可過(guò)低，離子強(qiáng)度要高一些，以防凍結(jié)。經(jīng)常使用的凝膠以濕態(tài)保存為主，只要在其中加入適當(dāng)?shù)囊志鷦┚涂煞胖脦讉€(gè)月至一年，不需要干燥。常用的抑菌劑有：疊氮鈉（0.02%）、三氯丁醇（0.01%～0.02%）、乙基汞硫代水揚(yáng)酸鈉(0.005%～0.01%)、苯基汞代鹽（包括、苯基汞代乙酸鹽、硝酸鹽、硼酸鹽，0.001%～0.01%）。第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析

Sepharose是常用的瓊脂糖凝膠品牌之一，機(jī)械強(qiáng)度較低。SepharoseCL是利用環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)制備的瓊脂糖凝膠，機(jī)械強(qiáng)度較普通Sepharose高。除GFC外，瓊脂糖凝膠經(jīng)化學(xué)修飾后主要用于離子交換層析、疏水性相互作用層析及親和層析的載體。除上述兩種常用的凝膠外，聚丙烯酰胺凝膠也常使用。二、凝膠層析的應(yīng)用及特點(diǎn)1．分離純化GFC可用于相對(duì)分子質(zhì)量從幾百到l06數(shù)量級(jí)的物質(zhì)的分離純化，是蛋白質(zhì)、肽、脂質(zhì)、抗生素、糖類、核酸以及病毒(50nm～400nm)的分離與分析中頻繁使用的液相層析法。第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析圖7-9是—例利用高效GFC分離骨髓血清蛋白質(zhì)的結(jié)果。此外，GFC還可用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)中無(wú)熱原水的制備以及低分子生物制劑中抗原性雜質(zhì)的除去。例如，青霉素的致敏作用—般認(rèn)為是產(chǎn)品中存在的一些高分子雜質(zhì)所致，如青霉素聚合物和青霉素降解產(chǎn)物青霉烯酸與蛋白質(zhì)相結(jié)合形成的青毒噻唑蛋白，它們都是具有強(qiáng)烈致敏性的抗原。利用SephadexG25凝膠柱處理青霉素溶液可除去這類高分子雜質(zhì)。

圖7-9高效GFC分離骨髓血清蛋白質(zhì)的結(jié)果

第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析

2．脫鹽GFC在生物分離領(lǐng)域的另一主要用途是生物大分子溶液的脫鹽，以及除去其中的低相對(duì)分于質(zhì)量物質(zhì)。例如，經(jīng)過(guò)鹽析沉淀獲得的蛋白質(zhì)溶液中鹽濃度很高，一般不能直接進(jìn)行離子交換層析分離，可首先用GFC脫鹽。此外，GFC還用于溶解目標(biāo)產(chǎn)物的緩沖液的交換。生物物質(zhì)的分離純化需要多步操作，上一步操作所用緩沖液有時(shí)不適合于下一步單元操作的有效實(shí)施(例如，某些鹽離子抑制蛋白質(zhì)在親和吸咐劑上的吸附)，必須進(jìn)行緩沖液的交換。若將緩沖液A換成緩沖液B，可先用B液沖洗GFC柱，上樣后用B液洗脫，即可完成緩沖液的交換。第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析

3．相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定GFC中溶質(zhì)的分配系數(shù)m在分級(jí)范圍內(nèi)隨相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)值增大而線性減小，分配系數(shù)與相對(duì)分子質(zhì)量Mr之間存在如下關(guān)系：

m＝a-blogMr

（7-1）在凝膠過(guò)濾介質(zhì)的分級(jí)范圍內(nèi)蛋白質(zhì)的分配系數(shù)(或洗脫體積)與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，所以GFC可用于未知物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。首先用標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素C(12500，指分子量，下同)、肌紅蛋白(16900)、胰凝乳蛋白酶(23200)、卵白蛋白(45000)和血紅蛋白(64500)等分別進(jìn)行凝膠過(guò)濾層析實(shí)驗(yàn)，確定分配系數(shù)與相對(duì)分子質(zhì)量的關(guān)系式。然后測(cè)定未知物質(zhì)的洗脫體積(分配系數(shù))，就可推算其相對(duì)分子質(zhì)量。不過(guò)，GFC僅對(duì)球形分子的測(cè)量精度較高，對(duì)分子形狀為棒狀的物質(zhì)，測(cè)量值將小于實(shí)際值。第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析

4．凝膠層析的特點(diǎn)與其他層析法相比，GFC的最大特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，凝膠過(guò)濾介質(zhì)相對(duì)價(jià)廉易得，適合于大規(guī)模分離純化過(guò)程。因此，GFC在生物大分子的分離純化過(guò)程中應(yīng)用最為普遍，尤其被廣泛應(yīng)用子分離純化過(guò)程的初級(jí)階段以及最后成品化前的脫鹽。GFC的具體優(yōu)點(diǎn)如下：①溶質(zhì)與介質(zhì)不發(fā)生任何形式的相互作用。因此可采用恒定洗脫法洗脫展開，操作條件溫和，產(chǎn)品收率可接近100％；②每批操作結(jié)束后不需要進(jìn)行介質(zhì)的清洗或再生，故容易實(shí)施循環(huán)操作，提高產(chǎn)品純度；第二節(jié)

凝膠過(guò)濾層析

③作為脫鹽手段，GFC比透析法速度快，精度高，與超濾法相比，剪切應(yīng)力小，蛋白質(zhì)活性收率高；④分離機(jī)理簡(jiǎn)單，操作參數(shù)少，容易規(guī)模放大。與其他層析法相比，GFC的不足之處在于：①僅根據(jù)溶質(zhì)之間相對(duì)分子質(zhì)量的差別進(jìn)行分離，選擇性低，料液處理量??；②經(jīng)GFC洗脫展開后產(chǎn)品被稀釋。因此需要在具有濃縮作用的單元操作(如超濾、離子交換和親和層析等)后使用。第三節(jié)

離子交換層析一、原理與操作1．離子交換層析的原理離子交換層析(Ionexchangechromatography，IEC)是利用離子交換劑為固定相，根據(jù)荷電溶質(zhì)與離子交換劑之間靜電相互作用力的不同而發(fā)生差速遷移，從而實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)分離的洗脫層析法。陰離子交換基有DEAE(二乙胺乙基，通用范圍：pH≤8.6，QAB(季銨乙基)；陽(yáng)離子交換基為CM(羧甲基，適用范圍pH＞4)，P(磷酸基)和SP(磺丙基)。各種凝膠過(guò)濾介質(zhì)鍵合上述離于交換基，即可制備相應(yīng)的離子交換劑。常用于制備離子交換劑的介質(zhì)有Sephadex、Sepharose、TSKgetPW、Toyopearl、Bio-GelA和纖維素等。第三節(jié)

離子交換層析

2．離子交換層析的操作離子交換層析的裝置主要包括蠕動(dòng)泵、離子交換層析柱、紫外檢測(cè)器及部分收集器等。進(jìn)行離子交換層析時(shí)，先將樹脂用展開劑處理，使樹脂層析劑轉(zhuǎn)變成展開劑離子的型式；然后將溶解在少量溶劑（通常為展開劑）中的試樣加到層析柱的上部，再通入展開劑展開，流出液分步收集，測(cè)定其含量。在分離制備中，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，分段合并各步收集液，并進(jìn)行濃縮提取。IEC操作很少采用恒定洗脫法，而多采用流動(dòng)相離子強(qiáng)度線性增大的線性梯度洗脫法(1ineargradiente1ution)或離子強(qiáng)度階躍增大的逐次洗脫法(stepwiseelution)。第三節(jié)

離子交換層析在線性梯度洗脫和逐次洗脫過(guò)程中，IEC柱內(nèi)溶質(zhì)區(qū)帶后部的離子強(qiáng)度高于前部，因此區(qū)帶后部的移動(dòng)速度高于前部，溶質(zhì)在洗脫過(guò)程中得到濃縮。GFC之外的層析操作多采用線性梯度洗脫法或逐次洗脫法，只是流動(dòng)相組成的變化情況各不相同。線性梯度洗脫法的優(yōu)點(diǎn)是流動(dòng)相離子強(qiáng)度(鹽濃度)連續(xù)增大，缺點(diǎn)是需要特殊的調(diào)配濃度梯度的設(shè)備。逐次洗脫法的優(yōu)點(diǎn)是利用切換不同鹽濃度的流動(dòng)相溶液進(jìn)行洗脫，不需要特殊梯度設(shè)備，操作簡(jiǎn)便，缺點(diǎn)是因?yàn)榱鲃?dòng)相濃度不連續(xù)變化，容易出現(xiàn)干擾峰。此外，容易出現(xiàn)多組分洗脫峰重疊的現(xiàn)象，因此洗脫操作參數(shù)(如鹽濃度，體積)的設(shè)計(jì)較困難。第三節(jié)

離子交換層析綜合上述兩種洗脫法的特點(diǎn)，在實(shí)際層析操作中，如果料液組成未知，一般應(yīng)首先采用線性梯度洗脫法，確定各種組分的分配特性以及層析操作的條件。選擇合適的離子交換劑是操作關(guān)鍵，離子交換劑的選擇詳見“第五章吸附及離子交換技術(shù)”。另外離子交換層析緩沖液的選擇也很重要。溶解樣品的初始緩沖液離子強(qiáng)度要低，層析展開用的洗脫劑離子強(qiáng)度可升高。使用梯度洗脫時(shí)，離子強(qiáng)度逐漸增加。陽(yáng)離子交換劑的洗脫pH由低到高，陰離子交換劑的洗脫pH由高到低。新的離子交換劑在初次使用前，常需預(yù)處理，離子交換劑使用過(guò)后，要再生處理。以上這些操作見“第五章吸附及離子交換技術(shù)”。第三節(jié)

離子交換層析二、離子交換層析的應(yīng)用及特點(diǎn)如果說(shuō)GFC主要用于生物產(chǎn)物的初步純化和中后期的脫鹽，則IEC是蛋白質(zhì)、肽和核酸等生物產(chǎn)物的主要純化手段。這主要是由于IEC基于離于交換的原理分離純化生物產(chǎn)物，不僅具有通用性而且選擇性遠(yuǎn)高于GFC。圖7-10、7-11分別為IEC分離多肽和核酸的實(shí)例。圖7-10激素多肽的IEC分離

圖7-11EcoliRNA的IEC分離第三節(jié)

離子交換層析歸納而言，IEC具有如下的特點(diǎn)：①料液處理量大，具有濃縮作用，可在較高流速下操作；②應(yīng)用范圍廣泛，優(yōu)化操作條件可大幅度提高分離的選擇性，所需柱長(zhǎng)較短；③產(chǎn)品回收率高；④商品化的離子交換劑種類多，選擇余地大，價(jià)格也遠(yuǎn)低于親和吸附劑。但是，IEC的操作變量遠(yuǎn)多于GFC，影響分離效果的因素非常復(fù)雜。這種復(fù)雜性給目標(biāo)產(chǎn)物的選擇性高度純化帶來(lái)了機(jī)遇，同時(shí)也增加了過(guò)程設(shè)計(jì)和規(guī)模放大的難度。小型層析柱的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)一般不能直接用于規(guī)模(包括柱體積和處理量)放大，必須實(shí)施必要的探索性實(shí)驗(yàn)。第四節(jié)

疏水性相互作用層析一、原理與操作1．疏水性相互作用層析的原理疏水性相互作用層析(Hydrophobicinteractionchromatography，HIC)是利用表面偶聯(lián)弱疏水性基團(tuán)(疏水性配基)的疏水性吸附劑為固定相，根據(jù)蛋白質(zhì)與疏水性吸附劑之間的弱疏水性相互作用的差別進(jìn)行蛋白質(zhì)類生物大分子分離純化的洗脫層析法。親水性蛋白質(zhì)表面均含有一定量的疏水性基團(tuán)，疏水性氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸等)含量較多的蛋白質(zhì)疏水性基團(tuán)多，疏水性也大。盡管在水溶液中蛋白質(zhì)具有將疏水性基團(tuán)折疊在分子內(nèi)部而表面顯露極性和荷電基團(tuán)的作用，但總有一些疏水性基團(tuán)或極性基團(tuán)的疏水部位暴露在蛋白質(zhì)表面。這部分疏水基團(tuán)可與親水性固定相表面偶聯(lián)的短鏈烷基、苯基等弱疏水基發(fā)生疏水性相互作用，被固定相(疏水性吸附劑)所吸附。第四節(jié)

疏水性相互作用層析

（1）疏水性吸附劑各種凝膠過(guò)濾介質(zhì)經(jīng)偶聯(lián)疏水性配基后均可用作疏水性吸附劑。常用的疏水性配基主要有苯基、短鏈烷基(c3～c8)、烷氨基、聚乙二醇和聚醚等。因疏水性吸附作用與配基的疏水性(疏水鏈長(zhǎng)度)和配基密度成正比，故配基修飾密度應(yīng)根據(jù)配基的疏水性而異，疏水性高的配基應(yīng)較疏水性低的配基修飾密度低。一般配基修飾密度在（10～40）μmo1／cm3之間。配基修飾密度過(guò)小則疏水性吸附作用不足，密度過(guò)大則洗脫困難。疏水性配基與親水性固定相粒子之間的偶聯(lián)主要利用氨基或醚鍵結(jié)合，形成圖7-12中所示的各種疏水性吸附劑，其中R表示疏水配基。

第四節(jié)

疏水性相互作用層析圖7-12疏水性吸附劑圖中a的末端氨基以及a和b的鍵合亞氨基顯弱堿性，在中性pH范圍內(nèi)帶正電荷，因此，這類疏水件吸附劑除疏水性吸附外，還可能存在靜電吸附(離子交換)作用。圖中c的吸附劑利用醚鍵結(jié)合．不引入荷電基團(tuán)，對(duì)蛋白質(zhì)僅產(chǎn)生疏水性吸附作用。第四節(jié)

疏水性相互作用層析

（2）影響疏水性吸附的因素

蛋白質(zhì)的疏水性與其荷電性質(zhì)相比復(fù)雜得多，不易定量掌握。除疏水性吸附劑的性質(zhì)（疏水性配基的結(jié)構(gòu)和修飾密度）外，流動(dòng)相的組成以及操作溫度對(duì)蛋白質(zhì)疏水性吸附的強(qiáng)弱均產(chǎn)生重要影響。①離子強(qiáng)度及種類如前所述，蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用隨離子強(qiáng)度提高而增大。除離子強(qiáng)度外，離子的種類亦影響蛋白質(zhì)的疏水性吸附。高價(jià)陰離子的鹽析作用較大。疏水性吸附與鹽析沉淀一樣，在高價(jià)陰離子的存在下作用力較高。因此，HIC分離過(guò)程中主要利用硫酸銨、硫酸鈉和氯化鈉等鹽溶液為流動(dòng)相，在略低于鹽析點(diǎn)的鹽濃度下進(jìn)料，然后逐漸降低流動(dòng)相離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫分離。第四節(jié)

疏水性相互作用層析

②破壞水化作用的物質(zhì)SCN-、CLO4-和I-等離子半徑較大、電荷密度低的陰離子可減弱水分子之間相互作用。這類陰離子與上述鹽析作用強(qiáng)的高價(jià)陰離子(如SO42-，HPO42-等)的作用正好相反，前者稱為離液離子(chaotropicion)，后者稱為反離液離子(antichaotropicion)。在離液離子存在下疏水性吸附減弱，蛋白質(zhì)易于洗脫。除離液離子外，乙二醇和丙三醇等含羥基的物質(zhì)也具有影響水化的作用，降低蛋白質(zhì)的疏水性吸附作用，經(jīng)常用做洗脫促進(jìn)劑，洗脫時(shí)疏水吸附強(qiáng)烈、僅靠降低鹽濃度難于洗脫高疏水性蛋白質(zhì)。第四節(jié)

疏水性相互作用層析

③表面活性劑表面活性劑可與吸附劑及蛋白質(zhì)的疏水部位結(jié)合，從而減弱蛋白質(zhì)的疏水性吸附。根據(jù)這一原理，難溶于水的膜蛋白質(zhì)可添加一定量的表面活性劑使其溶解，利用HIC法進(jìn)行洗脫分離。但此時(shí)選用表面活性劑的種類和濃度應(yīng)當(dāng)適宜：濃度過(guò)小則膜蛋白不溶解，過(guò)大則抑制蛋白質(zhì)的吸附。2．疏水性相互作用層析的操作吸附生物大分子采用柱層析法，裝柱和拆柱與其他類型的柱層析法相同。為了使要分離的生物大分子能緊密結(jié)合在柱上，選擇適當(dāng)?shù)木彌_液、pH和離子強(qiáng)度，也要考慮溫度因素。為了有效地洗脫吸附劑上的生物大分子，可以用下列的一種或幾種方法：①改換一種具有較低鹽析效應(yīng)的離子；②降低離子強(qiáng)度；③減弱洗脫劑的極性，也可加入乙二醇；④用含有表面活性劑的洗脫劑；⑤提高洗脫劑的pH。

第四節(jié)

疏水性相互作用層析每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸附劑需要再生。因?yàn)槲絼┲猩辛粲薪Y(jié)合緊密的生物大分子、表面活性劑等。未經(jīng)再生的疏水吸附劑，其吸附容量將明顯降低。一般來(lái)說(shuō)可用蒸餾水、乙醇、正丁醇、乙醇、蒸餾水依次洗滌，裝柱，用初始緩沖液平衡吸附劑。吸附劑經(jīng)再生后可反復(fù)使用。蛋白質(zhì)的純化過(guò)程中，各種分離技術(shù)結(jié)合的順序是很重要的。疏水層析可用在沉淀步驟之后，或與凝膠過(guò)濾、離子交換層析結(jié)合使用。

第四節(jié)

疏水性相互作用層析二、疏水性相互作用層析的應(yīng)用及特點(diǎn)HIC主要用于蛋白質(zhì)類生物大分子的分離純化。這種方法與IEC的離子交換作用完全不同。它不僅是一種有效的分離純化手段，而且還可與IEC互補(bǔ)短長(zhǎng)，分離純化利用IEC難以分離的蛋白質(zhì)。但是，由于疏水性相互作用機(jī)理比較復(fù)狀。吸附劑的選擇和洗脫分離條件不易掌握。例如，鼠肝細(xì)胞色素c氧化酶與硫水性吸附劑的相互作用不能單純地用疏水性吸附來(lái)解釋，該酶可被OctylSepharose完全吸附，而用疏水性更大的DecylSepharose為吸附劑時(shí)，吸附作用降低；在ButylSePharose上部分吸附，而在疏水性低于ButylSepharose的Pheny1Sepharose上則完全吸咐。第四節(jié)

疏水性相互作用層析據(jù)推測(cè)，發(fā)生這種現(xiàn)象的原因是該酶與苯環(huán)之間可產(chǎn)生π-π鍵。因此，在利用HIC分離蛋白質(zhì)的混合物時(shí)，需事先利用各種小型預(yù)裝柱進(jìn)行吸附與洗脫實(shí)驗(yàn)，確定最佳吸附劑和洗脫分離溶劑。HIC具有如下特點(diǎn)：①由于在高濃度鹽溶液中疏水性吸附作用較大，因此HIC可直接分離鹽析所得的蛋白質(zhì)溶液；②可通過(guò)調(diào)節(jié)疏水配基鏈長(zhǎng)和密度調(diào)節(jié)吸附力，因此可根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物的性質(zhì)選擇適宜的吸附劑；③疏水性吸附劑種類多，選擇余地大，價(jià)格與離子交換劑相當(dāng)。第五節(jié)

親和層析一、原理及操作

1．親和層析的原理許多生物大分子化合物具有與其結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng)的專一分子可逆結(jié)合的特性，如蛋白酶與輔酶、抗原和抗體、激素與其受體、核糖核酸與其互補(bǔ)的脫氧核糖核酸等體系，都具有這種特性，生物分子間的這種專一結(jié)合能力稱為親和力。依據(jù)生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理，采用一定技術(shù)，把與目的產(chǎn)物具有特異親和力的生物分子固定化后作為固定相，則含有目的產(chǎn)物的混合物（流動(dòng)相）流經(jīng)此固定相后，可把目的產(chǎn)物從混合物中分離出來(lái)，此中分離技術(shù)稱為親和層析。第五節(jié)

親和層析圖7-13親和色譜分離示意圖第五節(jié)

親和層析圖7-13所示為親和層析分離示意圖。把具有特異親和力的一對(duì)分子的任何一方作為配基，在不傷害其生物功能的情況下，與不溶性載體結(jié)合，使之固定化，裝入層析柱中（如圖7-13中a），然后把含有目的物質(zhì)的混合液作為流動(dòng)相，在有利于固定相配基與目的物質(zhì)形成絡(luò)合物的條件下進(jìn)入層析柱。這時(shí)，混合液中只有能與配基發(fā)生結(jié)合反應(yīng)形成絡(luò)合物的目的物質(zhì)（圖7-13中·分子）被吸附（如圖7-13中b），不能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的雜質(zhì)分子（圖7-13中△分子）直接流出。經(jīng)清洗后，選擇適當(dāng)?shù)南疵撘夯蚋淖兿疵摋l件進(jìn)行洗脫（圖7-13中c），使被分離物質(zhì)與固定相配基解離，即可將目標(biāo)產(chǎn)物分離純化。

第五節(jié)

親和層析一般情況下，需根據(jù)目標(biāo)產(chǎn)物選擇合適的親和配基來(lái)修飾固體粒子，以制備所需的親和吸附介質(zhì)（固定相）。固體粒子稱為配基的載體。作為載體的物質(zhì)應(yīng)具有：①不溶性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，滲透性好；②物理和化學(xué)穩(wěn)定性高，有較高的機(jī)械強(qiáng)度，使用壽命長(zhǎng)；③具有親水性，無(wú)非特異性吸附；④含有可活化的反應(yīng)基團(tuán)，利于親和配基的固定化；⑤抗微生物和酶的侵蝕；⑥最好為粒徑均一的球形粒子。常用的載體有葡聚糖、聚丙烯酰胺等，近年來(lái)多孔硅膠和合成高分子化合物載體正在被開發(fā)應(yīng)用于親和層析。第五節(jié)

親和層析

親和配基可選擇酶的抑制劑、抗體、蛋白質(zhì)A、凝集素、輔酶和磷酸腺苷、三嗪類色素、、組氨酸和肝素等。當(dāng)配基的分子量較小時(shí)，將其直接固定在載體上，會(huì)由于載體的空間位阻，配基與生物大分子不能發(fā)生有效的親和吸附作用，如圖7-14a所示。如果在配基與載體之間連接間隔臂，可以增大配基與載體之間的距離，使其與生物大分子發(fā)生有效的親和結(jié)合，如圖7-14b所示。圖7-14間隔臂的作用第五節(jié)

親和層析2．親和層析的操作親和層析包括進(jìn)料吸附、清洗、洗脫和介質(zhì)再生幾個(gè)步驟。吸附操作要保證吸附介質(zhì)對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物有較高的吸附容量，雜質(zhì)的非特異性吸附要控制在盡可能低的水平。一般雜質(zhì)的非特異性吸附與其濃度、性質(zhì)、載體材料、配基固定化的方法以及流動(dòng)相的離子強(qiáng)度、pH和溫度等因素有關(guān)。為了減小吸附操作中的非特異性吸附，所用的緩沖液的離子強(qiáng)度要適當(dāng)，緩沖液的pH應(yīng)使配基與目標(biāo)產(chǎn)物及雜質(zhì)的靜電作用較小。料液流速是影響層析速度和效果的重要因素。提高流速雖可加快分離速度，但會(huì)降低柱效。此外，瓊脂糖容易受壓變形，壓力過(guò)大反而流速降低。第五節(jié)