單個核細(xì)胞分離課件

2007級五年制本科生

免疫學(xué)實驗課第四次實驗課人外周血單個核細(xì)胞分離實驗內(nèi)容人外周血單個核細(xì)胞的分離（實驗）淋巴細(xì)胞分離與檢測技術(shù)（講解）細(xì)胞分離純化的目的測定細(xì)胞免疫功能首先要從人或動物外周血或組織中獲取有活性的細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞等。根據(jù)實驗?zāi)康牟煌?，采用不同方法，主要需考慮(1)細(xì)胞純度；(2)細(xì)胞獲得量；(3)細(xì)胞活力；Ficoll密度梯度離心法常用來分離人外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的分層液比重是1.077左右的聚蔗糖(Ficoll)-泛影葡胺(Urografin）分層液。紅細(xì)胞、粒細(xì)胞比重大(1.092)，離心后沉于管底；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞的比重小于或等于分層液比重(1.070)，離心后漂浮于分層液的液面上，吸取分層液液面的細(xì)胞，就可從外周血中分離到單個核細(xì)胞。比重：1.070比重：1.077

比重：1.092

FicollFicoll密度梯度離心法實驗步驟1.加樣：吸取1ml稀釋的血液沿試管壁緩慢加至分層液頂部(距1cm處)NOTE：不要打破血液與分層液的界面；2.分離：2,000r/min離心17min，離心后管內(nèi)液體可分為四層;3.回收：將吸管直接插入灰白層，沿管壁輕輕吸出灰白層單個核細(xì)胞，放入EP管中(NOTE：盡量少吸分層液);加入PBS至1ml，洗滌1次，4,000rpm/min，離心5分鐘，棄上清；4.計數(shù)：用500ulPBS重懸細(xì)胞，取10ul加到計數(shù)板內(nèi)，計數(shù)。（NOTE：如細(xì)胞數(shù)較多，用白細(xì)胞計數(shù)液做適當(dāng)稀釋，再計數(shù)）5.調(diào)細(xì)胞濃度：細(xì)胞終濃度為：1×106/ml。（NOTE：一般每ml健康成人血可分離1~2×106個單個核細(xì)胞，其中90%以上為淋巴細(xì)胞，部分是單核細(xì)胞）示意圖細(xì)胞計數(shù)方法查出四個大方格的總細(xì)胞數(shù)(X)算出每個大方格的細(xì)胞數(shù)：Y=X/4每個大方格的體積為V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm3=10-4ml制備的細(xì)胞懸液的細(xì)胞濃度（/ml)=Y×104×稀釋倍數(shù)(50)4巨噬細(xì)胞淋巴細(xì)胞DC細(xì)胞免疫細(xì)胞的分離

——免疫細(xì)胞的分離原理及方法

一.

外周血單個核細(xì)胞（PMBC）分離二.

淋巴細(xì)胞亞群的分離及鑒定（表面標(biāo)志選擇性純化淋巴細(xì)胞亞群）

E花環(huán)分離法尼龍纖維分離法免疫熒光法流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)

磁珠分離術(shù)免疫細(xì)胞的分離

1.

細(xì)胞膜脆性：低滲液分離2.

細(xì)胞密度：密度梯度離心法3.細(xì)胞表面標(biāo)志：流式細(xì)胞術(shù)，磁珠分離術(shù)4.細(xì)胞黏附性：黏附玻璃，塑料，尼龍毛免疫細(xì)胞分離的依據(jù)

（一）外周血單個核細(xì)胞（PBMC）的分離血中的細(xì)胞單個核——PBMC

無核——紅細(xì)胞多核——多核白細(xì)胞離心前示意圖稀釋的抗凝血Ficoll分離液血漿PBMC（白膜狀）1.075Ficoll分離液1.077紅細(xì)胞、多核白細(xì)胞1.092離心后示意圖（二）T、B淋巴細(xì)胞的分離1、單核細(xì)胞的去除：（1）黏附去除法*

原理：單核細(xì)胞可黏附在塑料或玻璃表面而淋巴細(xì)胞不能。（2）L—亮氨酸甲酯去除法（3）羰基鐵吞噬離心法E花環(huán)分離法

人成熟T細(xì)胞表面的CD2分子是綿羊紅細(xì)胞受體（E受體），能結(jié)合綿羊紅細(xì)胞形成E花環(huán)，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離后，因E花環(huán)形成細(xì)胞比重大而沉降于管底，再以低滲法裂解T細(xì)胞周圍的綿羊紅細(xì)胞，即獲得了純化的T細(xì)胞。（三）小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離原理及方法：利用巨噬細(xì)胞可黏附在玻璃或塑料上的原理，吸取小鼠腹腔液體，離心洗滌，用培養(yǎng)液懸浮，沖洗三次，去除非黏附細(xì)胞，用橡皮棒輕輕刮取、解離貼壁細(xì)胞，即為巨噬細(xì)胞。一、免疫細(xì)胞的數(shù)量檢測二、免疫細(xì)胞的功能檢測淋巴細(xì)胞增殖檢測淋巴細(xì)胞亞群檢測免疫細(xì)胞自發(fā)增殖活性測定免疫細(xì)胞增殖檢測免疫細(xì)胞檢測的分類一.免疫細(xì)胞的數(shù)量檢測檢查的項目有：血中T細(xì)胞與B細(xì)胞的分類計數(shù)血液白細(xì)胞的計數(shù)血液中白細(xì)胞的分類計數(shù)實驗方法｛E玫瑰花環(huán)實驗(檢測T細(xì)胞)B細(xì)胞膜免疫球蛋白檢測E玫瑰花環(huán)實驗原理:綿羊紅細(xì)胞→T細(xì)胞→形如花環(huán)，比重變大，離心沉淀B細(xì)胞膜免疫球蛋白檢測

原理：熒光素→抗Ig特異性抗體→B細(xì)胞表面膜免疫球蛋白(mIg)

返回二.免疫細(xì)胞的功能檢測刺激物非特異性:有絲分裂原PHA、ConA…

微生物及其代謝產(chǎn)物葡萄球菌…

蛋白物質(zhì)胃蛋白酶…

抗體抗CD3、CD4抗體…

淋巴因子特異性：特異性抗原物質(zhì)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗是淋巴細(xì)胞功能檢測最基本方法。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗的檢測方法(一)形態(tài)學(xué)方法淋巴細(xì)胞→淋巴母細(xì)胞→染色鏡檢(二)3H﹣TdR摻入法有絲裂原或抗原→淋巴細(xì)胞→染色體復(fù)制→3H﹣TdR摻入→淋巴細(xì)胞攝取→測定放射量(三)MTT比色法

返回(一)免疫熒光法

(二)免疫酶標(biāo)法(三)熒光激活細(xì)胞分類儀檢測T細(xì)胞亞群（T細(xì)胞和B細(xì)胞檢測方法相同,現(xiàn)以T細(xì)胞為例進(jìn)行講解.）淋巴細(xì)胞亞群檢測的方法(一)免疫熒光法

直接法:熒光素→單克窿抗體→淋巴細(xì)胞

間接法:熒光素→第二抗體(羊或兔的抗鼠IgG)→McAb介導(dǎo)→淋巴細(xì)胞

(二)免疫酶標(biāo)法ABC法:親和素＋酶標(biāo)生物素→復(fù)合物→生物素化的二抗→McAb介導(dǎo)和酶催化底物作用→T細(xì)胞著色

APAAP復(fù)合