生物化學-RNA生物合成和加工

轉錄(transcription)生物體以DNA為模板合成RNA的過程。

轉錄RNADNA

經轉錄生成的RNA有多種，主要的是rRNA，tRNA，mRNA，snRNA和hnRNA第一頁，共89頁。參與轉錄的物質原料:

NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:DNA酶:

RNA聚合酶(RNA-pol)其他蛋白質因子第二頁，共89頁。主要內容第一節(jié)模板和酶第二節(jié)轉錄過程第三節(jié)轉錄后加工第四節(jié)RNA復制和逆轉錄第三頁，共89頁。模板和酶第一節(jié)第四頁，共89頁。一、轉錄模板DNA分子上轉錄出RNA的區(qū)段，稱為結構基因。DNA雙鏈中按堿基配對規(guī)律能指引轉錄生成RNA的一股單鏈，稱為模板鏈(templatestrand)，也稱作負鏈。相對的另一股單鏈是編碼鏈(codingstrand)，也稱為正鏈。

第五頁，共89頁。5′···GCAGTACATGTC···3′3′···cgtgatgtacag···5′5′···GCAGUACAUGUC···3′N······Ala·Val·His·Val······C編碼鏈模板鏈mRNA蛋白質轉錄翻譯第六頁，共89頁。5335模板鏈編碼鏈編碼鏈模板鏈結構基因轉錄方向轉錄方向第七頁，共89頁。不對稱轉錄

在DNA分子雙鏈上某一區(qū)段，一股鏈用作模板指引轉錄，另一股鏈不轉錄；模板鏈并非永遠在同一條單鏈上。5'

3'

3'

5'

模板鏈（含結構基因）編碼鏈第八頁，共89頁。二、RNA聚合酶（一）原核生物的RNA聚合酶第九頁，共89頁。核心酶全酶此外，每個RNA聚合酶還含有2個Zn離子。第十頁，共89頁。ω亞基由基因rpoZ編碼，Mr為1.10×104，曾長期被忽略，甚至許多人不把它作為聚合酶的組分。然而，現在已經肯定，ω亞基是嗜熱水生菌RNApol必不可少的組分，也是體外變性的RNApol成功復性所必需的，它與β亞基一起構成催化中心，穩(wěn)定其與β'亞基的結合。第十一頁，共89頁。E.coli不同σ因子的性質與功能比較第十二頁，共89頁。（二）真核生物的RNA聚合酶(458)

第十三頁，共89頁。三、啟動子和轉錄因子原核生物一個轉錄區(qū)段可視為一個轉錄單位，稱為操縱子(operon)，包括若干個結構基因及其上游的調控序列。

5335結構基因調控序列RNA-polRNA聚合酶識別、結合和開始轉錄的一段DNA序列，稱為啟動子(promoter)。第十四頁，共89頁。LOREMIPSUMDOLORRNA聚合酶起始轉錄需要的輔助因子（蛋白質）稱為轉錄因子(transcriptionalfactor)。第十五頁，共89頁。RNA聚合酶保護法第十六頁，共89頁。第十七頁，共89頁。開始轉錄TTGACAAACTGT-35區(qū)(Pribnowbox)TATAATPuATATTAPy-10區(qū)1-30-5010-10-40-205335原核生物啟動子保守序列RNA-pol辨認位點(recognitionsite)55RNA聚合酶保護區(qū)結構基因33RNA聚合酶全酶結合位點第十八頁，共89頁。第十九頁，共89頁。轉錄過程

第二節(jié)第二十頁，共89頁。大腸桿菌RNA聚合酶的作用起始階段：在DNA分子上搜索啟動子，并將DNA雙螺旋解開一小段。延伸階段：選擇正確的核苷三磷酸（NTP），催化磷酸二酯鍵的形成。終止階段：檢測RNA合成的終止信號，停止RNA的合成。特點：不需引物；無核酸外切酶活性。錯誤率高：1/104~105核苷酸,是DNA復制的105倍。第二十一頁，共89頁。（一）轉錄起始轉錄起始需解決兩個問題：RNA聚合酶必須準確地結合在轉錄模板的起始區(qū)域。DNA雙鏈解開，使其中的一條鏈作為轉錄的模板。一、原核生物的轉錄過程第二十二頁，共89頁。RNA聚合酶全酶在轉錄起始區(qū)的結合第二十三頁，共89頁。2.DNA雙鏈解開，約解開17個堿基對。（酶與啟動子結合的部位是AT富集區(qū)，有利于解鏈）

1.RNA聚合酶全酶(2)與模板結合5-pppG-OH+

NTP

5-pppGpN

-OH3+ppi轉錄起始過程3.第一個核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)結合到全酶上，形成“啟動子-全酶-核苷三磷酸”三元起始復合物。4.第二個核苷酸參入，連結到第一個核苷酸的3'羥基上，形成了第一個磷酸二酯鍵。第二十四頁，共89頁。因子從全酶上掉下，又去結合其它的核心酶。

RNApol(2)-DNA-pppGpN-OH3轉錄起始復合物:第二十五頁，共89頁。（二）轉錄延長1.亞基脫落，RNA–pol聚合酶核心酶變構，與模板結合松弛，沿著DNA模板前移；

2.在核心酶作用下，NTP不斷聚合，RNA鏈不斷沿5'→3'方向延長。(NMP)n

+

NTP(NMP)n+1

+PPi第二十六頁，共89頁。

DNA上的解螺旋區(qū)：在RNA鏈延伸的同時，RNA聚合酶繼續(xù)解開它前方的DNA雙螺旋，暴露出新的模板鏈，而后面被解開的兩條DNA單鏈又重新形成雙螺旋，DNA上的解螺旋區(qū)保持約17個堿基對的長度。第二十七頁，共89頁。轉錄空泡(transcriptionbubble)：RNA-pol（核心酶）

····DNA····RNA第二十八頁，共89頁。RNA鏈的延伸圖解3′5′RNA-DNA雜交螺旋聚合酶的移動方向新生RNA復鏈解鏈編碼鏈模板鏈延長部位第二十九頁，共89頁。

RNA-DNA雜交區(qū)：剛合成出來的RNA鏈與解開的DNA模板鏈之間可形成一小段RNA-DNA雜交區(qū)。隨著核心酶的移動，RNA鏈不斷地延伸，雜交區(qū)也往前延伸，但后面的雜交區(qū)隨著DNA雙螺旋的恢復，RNA鏈逐漸被置換出來，因此，雜交區(qū)也保持著固定一小段。第三十頁，共89頁。53DNA原核生物轉錄過程中的羽毛狀現象核糖體RNARNA聚合酶第三十一頁，共89頁。依賴Rho(ρ)因子的轉錄終止不依賴Rho因子的轉錄終止（三）轉錄終止指RNA聚合酶在DNA模板上停頓下來不再前進，轉錄產物RNA鏈從轉錄復合物上脫落下來。分類第三十二頁，共89頁。ATP1.依賴Rho因子的轉錄終止第三十三頁，共89頁。ρ因子是ρ基因編碼的蛋白質，是一種酶，在水解ATP的情況下，它沿著5′→3′方向轉錄物的3′端前進，直到遇到暫停在終止點位置的RNA聚合酶。隨后ρ因子通過解鏈酶的活性解開轉錄泡（transcriptionbubble）上的RNA/DNA形成的雜交雙螺旋，使RNA轉錄物得到釋放，從而終止轉錄。

依賴ρ因子（rhofactor）的終止子第三十四頁，共89頁。2.不依賴Rho因子的轉錄終止DNA模板上靠近終止處，有些特殊的堿基序列，轉錄出RNA后，RNA產物形成特殊的結構來終止轉錄。第三十五頁，共89頁。這類終止子結構上有2個特征

（2）發(fā)夾結構末端緊跟6個連續(xù)的U，這發(fā)夾結構阻礙了聚合酶的進一步延伸，RNA鏈的合成就終止，酶和mRNA就從模板DNA上釋放。

（1）DNA鏈的3′端附近有回文結構，富含G-C堿基，隨后緊跟的是A-T堿基，轉錄而形成的RNA具有莖環(huán)的發(fā)夾形結構。

不依賴于ρ因子的終止第三十六頁，共89頁?；匚慕Y構AT富集區(qū)GC富集區(qū)不依賴ρ因子的終止子結構第三十七頁，共89頁。莖環(huán)結構使轉錄終止的機理

使RNA聚合酶變構，轉錄停頓；使轉錄復合物趨于解離，RNA產物釋放。5′pppG5335RNA-pol第三十八頁，共89頁。RNA合成過程起始雙鏈DNA局部解開磷酸二酯鍵形成終止階段解鏈區(qū)到達基因終點延長階段53RNA

啟動子（promoter)

終止子(terminator)5RNA聚合酶5353553離開第三十九頁，共89頁。二、真核生物的轉錄過程（一）轉錄起始真核生物的轉錄起始上游區(qū)段比原核生物多樣化，轉錄起始時，RNA-pol不直接結合模板，其起始過程比原核生物復雜。第四十頁，共89頁。TATA盒CAAT盒GC盒

增強子

順式作用元件

結構基因-GCGC---CAAT---TATA轉錄起始真核生物啟動子保守序列1.

轉錄起始前的上游區(qū)段第四十一頁，共89頁。轉錄起始點TATA盒CAAT盒GC盒

增強子順式作用元件(cis-actingelement)AATAAA切離加尾轉錄終止點修飾點外顯子翻譯起始點內含子OCT-1OCT-1：ATTTGCAT八聚體第四十二頁，共89頁。2.

轉錄因子

能直接、間接辨認和結合轉錄上游區(qū)段DNA的蛋白質，或具有識別RNA聚合酶的作用，現已發(fā)現數百種，統(tǒng)稱為反式作用因子(trans-actingfactors)。又稱為轉錄因子(transcriptionalfactors,TF)。

第四十三頁，共89頁。3.轉錄起始前復合物(PIC)

真核生物RNA-pol不與DNA分子直接結合，而需依靠眾多的轉錄因子幫助間接結合到DNA分子上。第四十四頁，共89頁。POL-ⅡTFⅡFⅡAⅡB由RNA-PolⅡ催化轉錄的起始前復合物Pol-ⅡTFⅡFⅡHⅡETBPTAFTFⅡD-ⅡA-ⅡB-DNA復合物TATAⅡAⅡBTBPTAFTATAⅡHⅡECTD-P起始前復合物組裝完成，TFⅡH使CTD磷酸化RNA-PolⅡ羧基端結構域第四十五頁，共89頁。（二）轉錄延長真核生物轉錄延長過程與原核生物大致相似，但因有核膜相隔，沒有轉錄與翻譯同步的現象。第四十六頁，共89頁。5------AAUAAA-5------AAUAAA--核酸酶-GUGUGUGRNA-polAATAAAGTGTGTG轉錄終止的修飾點55333加尾AAAAAAA······3mRNA（三）轉錄終止——和轉錄后修飾密切相關。第四十七頁，共89頁。DNA復制與轉錄的比較性質

復制

轉錄相同點模板兩股DNA單鏈均作為模板為模板鏈原料dNTPNTP合成方式半保留復制不對稱轉錄聚合酶種類

DNA聚合酶RNA聚合酶RNA引物需要不需要產物半保留的雙鏈DNA單鏈RNA不同點需要DNA為模板需要核苷三磷酸為原料遵循堿基配對原則新鏈合成方向均為5’→3’第四十八頁，共89頁。1.嘌呤和嘧啶類似物

核酸代謝的拮抗物：抑制核酸合成有關的酶摻入核酸分子形成異常核酸如：6-巰基嘌呤、硫鳥嘌呤、2.6—二氨基嘌呤、

8-氮鳥嘌呤、5-氟尿嘧啶、6-氮尿嘧啶進入體內變成相應的核苷酸表現抑制作用

三、RNA生物合成的抑制劑P469第四十九頁，共89頁。2.DNA模板功能的抑制物（1）烷化劑（2）放線菌素D（actinomycinD）

與DNA形成非共價復合物其作用如同阻遏蛋白抑制DNA轉錄和復制。

色霉素A3、橄欖霉素、光神霉素（3）嵌入染料

使DNA在復制時缺失或增添一個核苷酸，導致移碼突變，并能抑制RNA鏈的起始。第五十頁，共89頁。利福平抑制細菌RNA聚合酶活性第五十一頁，共89頁。某些常用的轉錄抑制劑抑制劑靶酶抑制作用利福霉素細菌的全酶與β亞基結合阻止起始利鏈霉素細菌的核心酶與β亞基結合阻止延長放線菌素D真核DNA與DNA結合并阻止延長α-鵝膏蕈堿真核RNAPolⅡ與RNA聚合酶Ⅱ結合第五十二頁，共89頁。轉錄后加工第三節(jié)第五十三頁，共89頁。幾種主要的修飾方式1.拼接(splicing)2.剪切(cleavage)3.

修飾(modification)4.

添加(addition)第五十四頁，共89頁。tRNA和rRNA被加工的證據

rRNA和tRNA有以下三點特性：1）所有RNA初級轉錄產物的5`末端均是5`-三磷酸，而成熟rRNA和tRNA分子的5`末端是5`單磷酸；2）rRNA和tRNA分子比初級轉錄產物小很多；3）所有tRNA含有稀有堿基。

第五十五頁，共89頁。（一）rRNA的加工

原核生物rRNA轉錄初始物:rRNA基因和tRNA基因組成混合操縱子：

16SrDNA23SrDNA5SrDNAtDNA加工RNA酶Ⅲ對轉錄初始物切割再加工成熟原核生物的轉錄后加工原核生物有7個rRNA轉錄單位第五十六頁，共89頁。RNaseⅢRNaseⅢRNaseE甲基化堿基甲基化核糖第五十七頁，共89頁。(二)tRNA的加工

大腸桿菌染色體有tRNA基因約60個原核生物tRNA轉錄初始物:tRNA基因:◆Ⅰ型---tRNA有3’-CCA-OH◆Ⅱ型---tRNA無3’-CCA-OHtRNA轉錄初始物:◆與rRNA相連◆幾個相同(不同)tRNA連在一起多順反子轉錄單位第五十八頁，共89頁?！窦庸NA酶ⅢRNA酶FRNA酶DRNA酶PtRNA核苷轉移酶切開rDNA、tDNA轉錄產物

間隔序列從3’端切斷前體分子核酸外切酶,切除Ⅰ型tRNA3’-CCA-OH下游序列（核酸+蛋白）（M1RNA）內切酶，tRNA5’端成熟酶

催化Ⅱ型tRNA形成穩(wěn)定的3’-CCA-OH“斬頭”，去尾，剪接，3’-末端添加，化學修飾第五十九頁，共89頁。原核生物tRNA前體分子的加工b、末端添加：3’-端添加CCA序列。c、修飾：形成稀有堿基如DH2。RNAasePRNAaseFRNAasePRNAaseFRNAaseDRNAaseDACC表示核酸內切酶的作用表示核苷酸轉移酶的作用

表示核酸外切酶的作用

表示異構化酶的作用第六十頁，共89頁。（三）mRNA的加工原核細胞的mRNA通常沒有轉錄后的加工過程。第六十一頁，共89頁。真核生物的轉錄后加工第六十二頁，共89頁。4種rRNA，是兩個轉錄單位。18S、5.8S和28SrRNA的前體是45S（一個轉錄單位）。5SrRNA是單獨的一個轉錄單位。核仁是其轉錄、加工和裝配成核糖體的場所。一、rRNA的轉錄后加工第六十三頁，共89頁。40S亞基60S亞基大多數真核細胞為成熟的28S18S5.8SrRNA的共同前體rRNA

由核酶催化進行自身剪接第六十四頁，共89頁。轉錄45S-rRNA剪接18S-rRNA5.8S和28S-rRNArDNA內含子內含子28S5.8S18S32S多數真核生物的rRNA基因不存在內含子，有些含有內含子但并不轉錄，如果蠅。四膜蟲可以自動切去內含子第六十五頁，共89頁。tRNA前體RNApolⅢTGGCNNAGTGCGGTTCGANNCCDNA二、tRNA的轉錄后加工RNA聚合酶Ⅲ催化合成第六十六頁，共89頁。RNAaseP、內切酶第六十七頁，共89頁。tRNA核苷酸轉移酶、連接酶ATPADP第六十八頁，共89頁。堿基修飾（2）還原反應如：UDHU

（3）核苷內的轉位反應如：Uψ（4）脫氨反應如：AI

如：AAm（1）甲基化（1）（1）（3）（2）（4）約有10%需要酶促修飾第六十九頁，共89頁。三、真核生物mRNA的轉錄后加工核內的初級mRNA稱為核不均一RNA(hnRNA)定義：mRNA的原初轉錄物是相對分子量極大的前提，在核內加工過程中形成大小不等的中間體，即hnRNA特點：平均分子長度為8-10Kb左右。比mRNA的平均長度(1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA僅有總量的1/2轉移到細胞質內，其余的都在核內被降解掉。第七十頁，共89頁。LOREMIPSUMDOLORhnRNA是mRNA的前體，證據是：

(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；

(2)hnRNA在體外能作為模板翻譯蛋白；

(3)兩者5′端都有帽子結構，表明二者為相同的聚合酶所合成；

(4)兩者的3′端都有多聚腺苷有尾巴。第七十一頁，共89頁。（一）首、尾的修飾5端形成帽子結構(m7GpppGp—)3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)加工過程包括：首、尾、剪接、甲基化第七十二頁，共89頁。帽子結構(m7GpppGp—)

第七十三頁，共89頁。5pppGp…5GpppGp…pppGppi鳥苷酸轉移酶5

m7GpppGp…甲基轉移酶SAM帽子結構的生成5ppGp…磷酸酶Pi以5’-5’三磷酸相連作用:穩(wěn)定mRNA5’端和翻譯的起始有關第七十四頁，共89頁。步驟1步驟2作用位置加尾:3端加上多聚腺苷酸尾巴(polyAtail)

作用：穩(wěn)定mRNA，mRNA由細胞核進入細胞質所必需的形式第七十五頁，共89頁。四、RNA生物功能的多樣性（核酶）具有酶促活性的RNA稱為核酶。核酶(ribozyme)Cech和Altman獲得了1989年度的諾貝爾化學獎第七十六頁，共89頁。四膜蟲rRNA內含子的二級結構四膜蟲rRNA的剪接采用自我剪接方式5′-端核苷酸序列第七十七頁，共89頁。最簡單的核酶二級結構——錘頭狀結構(hammerheadstructure)底物部分通常為60個核苷酸左右同一分子上包括有催化部份和底物部份催化部份和底物部份組成錘頭結構除rRNA外，tRNA、mRNA的加工也可采用自我剪接方式。第七十八頁，共89頁。核酶研究的意義核酶的發(fā)現，對中心法則作了重要補充；核酶的發(fā)現是對傳統(tǒng)酶學的挑戰(zhàn)；利用核酶的結構設計合成人工核酶。第七十九頁，共89頁。第四節(jié)

RNA復制和逆轉錄(P491)第八十頁，共89頁。

RNA的復制是指

病毒基因組RNA的復制(真核生物RNA的復制只是極個別的現象)

概念:由RNA復制酶(RNAreplicase)催化,以病毒RNA為模板的RNA合成。

RNA病毒在宿主細胞內繁殖時,即進行RNA復制。一、RNA的復制第八十一頁，共89頁。

以四種NTP為底物；

專一性地選擇病毒RNA為模板；按5’→3’的方向合成病毒RNA；無外切酶活性（即無校對功能）。RNA復制酶的催化性質第八十二頁，共89頁。