蛋白質(zhì)類藥物的分離純課件

四.生物藥物的制備3.蛋白質(zhì)類藥物的分離純化方法生產(chǎn)過程上游構(gòu)建（基因工程）發(fā)酵生產(chǎn)(發(fā)酵工程)純化制備●來源：微生物細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞；●分離和純化過程都必須在溫和條件下進(jìn)行。蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)分子中存在游離氨基和羧基，具有兩性解離性質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某pH時(shí)，蛋白質(zhì)分子解離成正、負(fù)離子的趨勢相等，凈電荷為零，此時(shí)溶液pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI。①兩性解離與等電點(diǎn)利用蛋白質(zhì)兩性電離的性質(zhì)，可通過電泳、離子交換層析、等電聚焦等技術(shù)分離蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)分子量很大，分子粒徑為1～100nm，屬親水膠體在水中能形成穩(wěn)定膠體溶液。蛋白質(zhì)分子表面的水化膜和表面電荷是穩(wěn)定親水溶膠的兩個(gè)重要因素。②蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)++蛋白質(zhì)膠體顆粒的沉淀++++-------+-（沉淀）（疏水膠體）（疏水膠體）●沉淀過程中，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)都不發(fā)生變化，在適當(dāng)條件下，可以重新溶解形成溶液。●是分離、純化蛋白質(zhì)的基本方法。如：等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法等。●去除變性因素后，恢復(fù)原有空間構(gòu)象和生物活性。蛋白質(zhì)的非變性沉淀核糖核酸酶可逆變性鹽析電泳透析層析分子篩超速離心2）蛋白質(zhì)的分離純化方法定義：加入大量中性鹽以破壞Pr的穩(wěn)定因素并使從溶液中沉淀析出的現(xiàn)象。原理：破壞Pr兩個(gè)穩(wěn)定因素：水化膜和電荷層。中性鹽：(NH4)2SO4；Na2SO4；NaCl等。優(yōu)點(diǎn)：Pr不變性，常用。①鹽析（Saltingout)定義：帶電粒子在電場力作用下向著所帶電荷相反方向泳動(dòng)的現(xiàn)象叫電泳。原理：●Pr分子在溶液中可帶凈負(fù)電荷或凈正電荷，可在電場中移動(dòng)?！癫煌琍r分子攜帶電荷量不同，分子大小也不同，故在電場中泳動(dòng)速度不同，可彼此分離。②

電泳（electrophoresis)●粒子泳動(dòng)速度V與場強(qiáng)E、粒子電量Q成正比；●V與粒子半徑r、溶液粘度η成反比；●V與粒子形狀有關(guān)。非球形分子（如線狀DNA）在電泳過程中受到更大的阻力。電泳過程示意圖CH2=CHC=ONH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺CH2=CHC=ONHCH2NHC=O

CH2=CH聚丙烯酰胺CH2-CHC=ONH2CH2-CHC=ONHCH2NHC=O

CH2-CHCH2ˉ

CHC=ONH2CH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CHCH2-CHC=ONH2CH2-CHCH2-CH()n()n()m()m常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳主要特點(diǎn)凝膠由上、下兩層凝膠組成上層——大孔徑濃縮膠，濃度2～3％；下層——小孔徑分離膠，濃度5～15％；緩沖液中主要陰離子——Gly-,Cl-；凝膠pH不同電極緩沖液——pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液；濃縮膠——pH6.8的Tris-HCl緩沖液；分離膠——pH8.9的Tris-HCl緩沖液；三種物理效應(yīng)——樣品濃縮效應(yīng)，凝膠分子篩效應(yīng)，電荷效應(yīng)。

——分離效果好，分辨率高。板狀電泳B.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳當(dāng)電泳體系含有十二烷基硫酸鈉（SDS）時(shí),電泳遷移率的大小只取決于蛋白質(zhì)的分子量，可直接由電泳遷移率計(jì)算蛋白質(zhì)分子量。

測定蛋白質(zhì)分子量當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子量為17,000～165,000時(shí)，復(fù)合物電泳遷移率與蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系：lgMW=lgK－bm

MW——蛋白質(zhì)分子量；m——相對遷移率；K——常數(shù)；b——斜率。將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中的電泳遷移率對分子量的對數(shù)作圖，即可得到一條標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知分子量的蛋白質(zhì)在相同條件下的電泳遷移率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得其分子量。測定蛋白質(zhì)分子量SDSseparatesproteinsbyMW十二烷基硫酸鈉③凝膠色譜

利用生物大分子的相對分子質(zhì)量差異，進(jìn)行層析/色譜分離的方法。凝膠層析介質(zhì)主要是以葡聚糖、瓊脂糖、聚丙烯酰胺等為原料，通過特殊工藝合成的層析介質(zhì)。目前已成為生物化學(xué)、分子生物學(xué)和生物制藥在研究和生產(chǎn)中必不可少的分離介質(zhì)。

凝膠層析介質(zhì)是惰性球狀凝膠顆粒，內(nèi)部為多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成很多孔穴。凝膠層析原理

凝膠顆粒內(nèi)部具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，被分離的混合物流過層析柱時(shí)，比凝膠孔徑大的分子不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng)，并最先被洗脫出來；比網(wǎng)孔小的分子能不同程度的自由出入凝膠孔內(nèi)外，在柱內(nèi)經(jīng)過的路程較長移動(dòng)速度較慢，最后被洗脫出來。凝膠色譜分離洗脫體積凝膠色譜分離的應(yīng)用生物大分子物質(zhì)的分離純化分子量的測定分級分離溶液濃縮平衡常數(shù)的測定細(xì)胞及顆粒的分離分子量的測定蛋白質(zhì)通過凝膠柱的速度，即洗脫體積與其分子量有關(guān):LogM=k1-k2Ve（Ve為洗脫體積）先測得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve，并以其分子量對數(shù)對Ve作圖得一直線，再測出待測樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。LogMABCLogM測V測定義:利用離子交換樹脂作為支持物，將帶有不同電荷的Pr進(jìn)行分離的方法。分類:陽離子交換樹脂,如羧甲基纖維素等，

陰離子交換樹脂,如二乙基氨基乙基纖維素④離子交換色譜原理:帶正電荷多的Pr與樹脂結(jié)合較強(qiáng)，而帶正電荷少的Pr與樹脂結(jié)合則較弱。用不同濃度的陽離子洗脫液，如NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，通過Na+的離子交換作用，可以將帶有不同正電荷的Pr進(jìn)行分離。帶正電荷多蛋白緊密結(jié)合帶負(fù)電荷多蛋白流過層析柱陽離子交換樹脂工作示意圖離子交換色譜柱層析⑤親和層析法瓊脂糖凝膠連接臂蛋白質(zhì)分子配體蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)和配體復(fù)合物交聯(lián)試劑載體配體載體與配體交聯(lián)體雜質(zhì)雜質(zhì)游離配體親和色譜親和層析的特點(diǎn)純化效率極高：親和層析由于配體與待分離物質(zhì)進(jìn)行特異性結(jié)合，所以分離提純的效率極高，提純度可達(dá)幾千倍。⑥透析法（Dialysis）定義：利用半透膜把大小分子分開的方法。Pr溶液置半透膜袋中，置流動(dòng)溶劑（如蒸餾水）中，使小分子雜質(zhì)（如無機(jī)鹽、單